KR20050039688A - 조류 질병을 유발하는 신규한 박테리아 및 그로부터유래된 백신 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 동물 보건 분야, 특히 신규한 박테리아성 조류 질병의 병원체, 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica)에 속한다. 본 발명으 상기 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica) 박테리아, 불활성화된 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica)를 포함하는 백신, 및 닭에서 상기 질병을 예방하기 위하여 닭을 면역화시키는 방법을 제공한다.
Description
본 발명은 동물 보건 분야, 특히 신규한 박테리아성 조류 질병의 병원체, 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica)에 속한다. 본 발명은 상기 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica) 박테리아, 불활성화된 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica)를 포함하는 백신, 및 닭에서 상기 질병을 예방하기 위하여 닭을 면역화시키는 방법을 제공한다.
지난 10년동안, 생산성을 증가시키기 위한 집약적인 조류 사육 방법이 모든 주된 조류를 생산하는 전 국가에 질병 징후를 증가시켰다. 이는 이들 질병을 조정하기 위한 신규하고 좀 더 우수한 백신 및 백신화 프로그램에 대한 필요성을 증가시켰다. 요즘, 대다수의 동물은 바이러스 및 박테리아 기원의 다수 질병에 대하여 면역화되어 있다. 조류의 바이러스성 질병의 예는 뉴캣슬 질병, 감염성 기관지염, 조류-뉴모바이러스, 계두, 감염성 점액낭 질병 등이다. 박테리아성 질병의 예는 헤모필루스 파라갈리나룸(Haemophilus paragallinarum)(상부 기도), 보르데텔라 아비움(Bordetella avium)(상부 기도), 오르니토박테리움 리노트라케아레(Ornithobacterium rhinotracheale)(하부 기도), 살모넬라 감염(소화기관), 조류 콜레라(패혈성)의 병원체인 파스튜렐라 물코시다(Pasteurella multocida), E.coli 감염에 의해 유발된 코감기다.
따라서, 본 발명의 근원이 되는 기술상의 문제는 신규의 박테리아성 조류 질병을 동정하고, 상기 질병의 병원체를 제공하고 상기 질병을 예방하기 위한 백신을 제공하는 것이다.
도면 설명
A) 필드 돌발로부터
도 1 브로일러: 콧물 및 눈가 종창 .
도 2 브로일러: 심장내 출혈 및 심장 지방.
도 3 브로일러: 결막염 및 눈가 염증
도 4 레이어즈(layers): 콧물 및 청색증을 포함하는 전위된 닭벼슬.
도 5 레이어즈: 눈가 염증 및 출혈
도 6 레이어즈: 귓속 구멍 입구 뒤쪽 피부 조직의 출혈
도 7 레이어즈: 신장 염증
도 8 레이어즈: 난관 출혈
도 9 레이어즈: 기형 난포
도 10 레이어즈: 전위(proventriculus) 및 사낭 사이 이음부의 출혈
도 11 레이어즈: 난관 울혈 및 출혈
B) 실험 감염
도 12 레이어즈: 신장 염증 및 출혈
도 13 SPF: 피로.
도 14 레이어즈: 관절 및 근육내 출혈.
도 15 레이어즈: 콧물 및 및 핏기 없는 닭벼슬
도 16 레이어즈: 근육내 출혈.
도 17 SPF: 심장내 출혈 및 심장 지방.
도 18 레이어즈: 좌측: 건강한 새 및 우측: 목털이 난 병든 새
도 19 레이어즈: 녹색 설사
도 20 SPF: 근육내 출혈.
도 21 SPF: 피로 (운동 장애) 및 녹색 설사
도 22 레이어즈: 출혈을 포함하는 간 팽창
발명의 개시
명세서에서 사용된 용어의 정의
"한개의 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi)"에 대한 언급은 "다수의 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi)"를 포함하고, "세포"에 대한 언급은 하나 이상의 세포 및 본 분야의 기술자에게 공지되어 있는 그의 동등물 등을 언급한다. 달리 언급하지 않는 한, 대소문자에 상관없이, "아라비노오스" 및 "아라비노오스"은 동일한 의미흘 갖는다. 달리 정의하지 않는 경우, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 기술자가 통상적으로 이해하고 있는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 기재된 것과 동일하거나 동등한 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법, 장치, 및 재료를 기재한다. 본 명세서에 언급된 모든 문헌에서 보고된, 본 발명과 관련하여 사용될 수 있는 세포주, 벡터 및 방법을 기재하고 설명하기 위한 목적으로서 본 명세서에서 언급된 모든 공개 문헌이 참고문헌으로서 인용된다. 본 명세서에 어느 것도 본 발명이 선행 발명에 의해 상기 설명보다 선행하지 못한다고 인정되는 것을 의미하지 않는다.
놀랍게도, 본 발명자들은 주로 레이어즈 및 그보다는 덜 빈번하게 브로일러에서 발별되는 새로운 박테리아성 조류 질병을 발견하게 되었다. 이 질병은 박테리아, 헤모필루스 파라갈리나룸(Haemophilus paragallinarum)(조류 코감기의 병원체), 및 파스튜렐라 물코시다(Pasteurella multocida)(조류 콜레라(패혈성)의 병원체)에 대항 백신화된 닭에서 나타났다. 이 새로운 질병의 증상은 코감기의 특정 증상과는 상이한다. 단, 새로 발견된 질병이 이하 기술하는 바와 같은 상부 기도 염증의 임상적 징후를 나타낸다면, H. 파라갈리나룸(Haemophilus paragallinarum)는 병원체로 제어될 수 있다.
본 발명은 제 1면에서 조류의 상부 기도 및 생식관의 새로운 질병을 유발하는 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 그람-음성, 통성 혐기성, 다형 막대형 박테리아에 관한 것이다.
본 발명에 따른 박테리아는 감염된 기도, 구개열, 난소, 간, 심장, 신장 및 생식샘(브로일러)로부터 분리될 수 있다. 이들을 하기 열거한 시험에 기초하여 본 발명에 따른 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica)로서 동정할 수 있다:
베타-용혈 +
그람-염색 -
옥시다아제 +
카탈라아제 +
우레아제 -
질산염 +
인돌 -
Jaworski 등(1) 에 의해 기술된 방법에 따라 박테리아 분리물을 정제하고 바이오타입핑(biotype)할 수 있다. 박테리아를 분류하는 중요한 방법은 DNA-DNA-혼성화, REA (제한효소분석; 참조. z. B. J. Clinical Microbiol., 1993, 31: 831-835) 및 리보타이핑(ribotyping)이다. 박테리아가 본 발명의 범주내 포함되는지 밝혀내기 위하여 기술자는 상기 방법을 사용할 수 있다. Koch의 가설을 입증하기 위한 접종 모델 또한 실시예에서 예시된다.
따라서, 본 발명의 중요한 일면은 베타(β)-용혈-양성, 그람- 음성, 옥시다아제-양성, 카탈라아제-양성, 우레아제-음성, 질산염-양성, 인돌-음성인 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica)이다. 바람직하게 본 발명에 따른 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica)는 맥콘키(MacConkey)-양성이다. 더욱더 바람직한 본 발명에 따른 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica)는 글루코오스-양성, 수크로오스-양성, 만니톨-양성, 아라비노오스-음성, 셀로비오스-음성, 크실로오스-양성, 살리신-음성, 오르니틴-음성, 에스쿨린-음성, 알파-푸코시다아제-음성, 베타-갈락토시다아제-양성이다. 또한, 아라비노오스-음성 및 트레할로스-양성인 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica)가 가장 바람직하다. 또한, 바람직하게 본 발명에 따른 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica)는 바이오타입에 따라, 베타(β)-글루코시다아제-음성 또는 양성이다. 아라비노오스-음성 및 트레할로스-음성인 만헤이미아가 본 발명의 가장 바람직한 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica)이다. 또한 바람직하게, 본 발명에 따른 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica)는 또한 베타-글루코시다아제 음성이다.
본 발명에 따른 박테리아의 이러한 특징적인 성질에 의해 본 발명의 박테리아가 다른 공지된 박테리아성 조류 병원체보다 신규한 것으로 분류된다(Diseases of Poultry, 10. Aufl., herausgegeben von B. W. Calnek, Iowa State University Press, lowa, USA, 1997).
본 발명의 또다른 바람직한 일면은 조류가 닭, 칠면조, 오리, 거위, 산비둘기(dove), 집비둘기(pigeon) 및 메추라기로 구성된 그룹으로부터 선택되는, 본 발명에 따른 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica)이다.
본 발명은 수탁 번호
- 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) ATCC No. PTA-3667 (내부 식별표시 BIV-4985);
- 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) ATCC No. PTA-3668 (내부 식별표시 BIV-AVICOR);
- 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica) ATCC No. PTA-3669 (내부 식별표시 BIV-07990)하에 아메리카 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection(ATCC))(1081, University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, USA)에 기탁되었음을 특징으로 하는 신규한 타입의 그람-음성, 통성 혐기성, 다형 막대형 박테리아를 제공한다.
기탁일은 2001년 8월 22일이었다.
따라서, 본 발명의 가장 바람직한 일면은 수탁 번호 ATCC No. PTA-3667하에 기탁된 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi)이다. 이 박테리아는 추가로 실시예 1의 표 3에서 예시한다.
또다른 본 발명의 가장 바람직한 일면은 수탁 번호 ATCC No. PTA-3668하에 기탁된 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi)이다. 이 박테리아는 추가로 실시예 1의 표 2에서 예시한다.
또다른 본 발명의 가장 바람직한 일면은 수탁 번호 ATCC No. PTA-3669하에 기탁된 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi)이다. 이 박테리아는 추가로 실시예 1의 표 1에서 예시한다.
실시예중 A 및 B(표 1, 2, 및 3)의 실험 결과를 통해 파스튜렐라세아(Pasteurellaceae)과에 속하는 세균 BIV-4895; ATCC No. PTA-3667 및BIV- AVICOR; ATCC No. PTA-3668(파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi); 트레할로스 양성 및 아라비노오스 음성), 만헤이미아(Mannheimia)과에 속하는 세균 BIV-07990; ATCC No. PTA-3669(만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica). 트레할로시 음성 및 아라비노오스 음성)을 확인한다.
본 발명은 또한 상기 기술한 바와 같은 본 발명에 따른 박테리아를 포함하는 미생물 배양액에 관한 것이다. 이 배양액은 35℃ 내지 37℃의 온도에서 상기 박테리아를 배양하여 제조할 수 있다. 박테리아를 표준 대기 산소압하에서 배양할 수 있다. 박테리아는 기술자에게 공지되어 있는 다양한 상이한 목적의 세균 배양 촉진 배지, 예를 들면, 트립토스-브로쓰 (TB), 소이 트립티카제인 또는 브레인 하트 인퓨젼 브로쓰 또는 영양강화배지에서 배양할 수 있다. 박테리아는 또한 24시간동안 37℃에서 인큐베이션된 양 혈액 아가상에서 배양될 수 있다.
박테리아를 불활성화시키는 다양한 물리화학적 방법이 본 분야에 공지되어 있다. 물리적 불활성화 방법의 예는 UV-조사, X-선 조사, 감마-조사 및 가열이다. 불활성화 시키는 화학 물질의 예는 베타-프로피오락톤, 글루타르알데히드, 베타- 에틸렌이민 및 포름알데히드이다.
바람직하게 본 발명에 따른 박테리아는 포름알데히드에 의해 불활성화된다. 놀랍게도 최종 농도 0.2%의 포름알데히드를 사용하는 것이 본 발명에 따른 박테리아를 불활성화시키는 가장 우수한 방법이다. 따라서, 또다른 중요한 일면으로, 본 발명은 최종 농도 0.2%의 포름알데히드를 사용하는 것을 포함하는 본 발명에 따른 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica)를 불활성화시키는 방법에 관한 것이다.
상기 기술된 방법 및 기술자에게 공지된 박테리아를 불활성화시키는 다른 방법에 의해 불활성화된 상기 박테리아도 본 발명에 포함된다. 따라서, 또다른 중요한 일면은 본 발명의 방법 또는 본 분야에 공지된 방법에 따라 수득할 수 있는 불활성화된 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica)이다. 바람직하게 본 발명에 따른 불활성화된 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica)는 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) ATCC No. PTA-3667, 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) ATCC No. PTA-3668 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica) ATCC No. PTA-3669로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
그러므로, 또다른 중요한 일면은 본 분야에 공지된 방법에 따라 수득할 수 있는 생(live) 약독화된 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica)이다. 바람직하게, 생 약독화된 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica)는 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) ATCC No. PTA-3667, 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) ATCC No. PTA-3668 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica) ATCC No. PTA-3669로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 본 발명에 따른 상기 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica)는 적절한 배양 배지에서 다중 계대 배양하거나 본 분야의 공지된 다른 방법에 의해 약독화된다.
본 명세서에서 이해되는 바, 불활성화는 본 발명에 따른 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica)가 임상 질병을 유발하는 복제를 할 수 없도록 사멸된 것을 의미한다.
본 명세서에서 이해되는 바, 약독화는 본 발명에 따른 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica)가 복제는 할 수 있지만 임상 질병은 유발시키기 못하는 살아있는 박테리아를 의미한다.
또다른 중요한 일면은 본 분야에 공지된 방법에 따라 수득할 수 있는 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica)의 분획 또는 단편이다. 본 발명에 따른 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica)의 세정제를 사용하는 용해 또는 다른 본 분야에 공지된 다른 방법에 의해 단편을 제조할 수 있다. 바람직하게, 상기 분획 또는 단편은 본 발명에 따른 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica)의 정제된 항원이다. 바람직하게, 분획/단편은 본 발명에 따른 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica)의 외막 단백질이다. 본 발명의 "단편"은 본 발명에 따른 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica)의 면역원성 서브유니트, 즉 폴리펩티드 서브세트이다.
따라서, 본 발명은 본 발명의 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica)의 적어도 하나의 항원을 포함하는 단편에 관한 것이다. 가장 바람직하게, 상기 단편은 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) ATCC No. PTA-3667, 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) ATCC No. PTA-3668 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica) ATCC No. PTA-3669로 구성된 그룹으로부터 선택되는 박테리아의 적어도 하나의 항원을 포함하는 단편에 관한 것이다. 상기 단편은상기 균주(들)의 전체 박테리아 세포, 박테리아 추출물, 외막 분획, 박테리아 외- 및 내독소, 및 정제된 단백질을 포함할 수 있다. 항원 폴리펩티드 또는 그의 단편은 예를 들면, 정제된 박테리아 단백질로부터 또는 일부 원핵 또는 진핵 세포 발현 시스템에서 상응하는 유전 물질의 발현을 통해 또는 유기-화학적 합성을 통해 수득할 수 있다. 상기 방법은 본 분야의 기술자에게 공지되어 있다.
본 발명으 추가로 백신에 사용하기 위한 생, 및/또는 생 약독화된, 및/또는 불활성화된 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica) 및/또는 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica)의 분획에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 상기 기술한 새로 동정된 박테리아로부터 유래한 백신을 제공한다. 따라서, 본 발며은 추가로 생, 및/또는 생 약독화된, 및/또는 불활성화된 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica) 및/또는 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica)의 분획을 포함하는 백신 조성물에 관한 것이다.
본 명세서에서 사용되는 바 "백신"은 항원 물질을 포함하는 수의학용 백신이고 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica)에 의해 유발되는 질병에 대하여 특이적이고 능동 또는 수동의 면역성을 유도하기 위한 목적으로 투여된다. 본 발명에 따른 생 또는 생 약독화된 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica)는 포함하고 있는 이뮤노겐 및 또한 때로는 항원 관련 유기체에 대한 모체항체를 통해 수동적으로 전달될 수 있는 능동면역을 제공한다. 본 발명에 따른 불활성화된 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica) 및/또는 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica)의 분획은 수동면역을 제공한다. 면역 반응을 증진시키는 추가의 성분은 추가의 성분은 흔히 어쥬번트라고 불리우는 구성물, 예를들어 수산화 알루미늄, 광유 또는 다른 오일 또는 백신에 첨가되거나 이러한 추가의 성분에 의해 각각의 유도후 신체에 의해 발생되는 보조 분자, 예를들어 제한되는 것은 아니지만 인터페론, 인터류킨 또는 성장인자이다.
바람직한 일면으로 백신은 불활성화된 박테리아를 포함한다. 바람직하게, 본 발명의 백신은 하나의 면역원성 활성 성분이 생 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica) 및/또는 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi)인 백신을 언급한다. 용어 "생 백신"은 분열/증식할 수 있는 입자를 포함하는 백신을 언급한다.
또한, 바람직하게 본 발명에 따른 백신은 본 발명의 약독화된 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica) 및 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함한다. 또한 백신은 생, 및/또는 생 약독화된, 및/또는 불활성화된 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica)중 2개 이상의 균주 및/또는 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica)중 2개 이상의 균주의 분획을 포함하는 조합 백신으로서 투여될 수 있다. 가장 바람직하게, 생, 및/또는 생 약독화된, 및/또는 불활성화된 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica) 및/또는 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica)의 분획은 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) ATCC No. PTA-3667, 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) ATCC No. PTA-3668 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica) ATCC No. PTA-3669로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
바람직하게, 또는 본 발명에 따른 백신은 본 발명에 따른 불활성화된 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica) 및 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함한다. 또한 백신은 불활성화된 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica)중 2개 이상의 균주를 포함하는 조합 백신으로서 투여될 수 있다.
추가로, 전체 세포 분획은 또한 본 발명에 따른 백신중 관련 이뮤노겐으로서 사용될 수 있다. 그러므로, 본 발명에 따른 백신은 본 발명에 따른 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica)의 분획 및 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함한다. 또한 백신은 불활성화된 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica)중 2개 이상의 균주를 포함하는 조합 백신으로서 투여될 수 있다. 특히, 본 발명은 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica)의 적어도 하나의 항원을 포함하는 단편을 포함하는 백신에 관한 것이다. 가장 바람직하게, 본 발명은 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) ATCC No. PTA-3667, 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) ATCC No. PTA-3668 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica) ATCC No. PTA-3669로 구성된 그룹으로부터 선택되는 박테리아의 적어도 하나의 항원을 포함하는 단편을 포함하는 백신에 관한 것이다. 상기 단편은 상기 균주(들)의 전체 박테리아 세포, 박테리아 추출물, 외막 분획, 박테리아 외- 및 내독소, 및 정제된 단백질을 포함할 수 있다. 항원 폴리펩티드 또는 그의 단편은 예를 들면, 정제된 박테리아 단백질로부터 또는 일부 원핵 또는 진핵 세포 발현 시스템에서 상응하는 유전 물질의 발현을 통해 또는 유기-화학적 합성을 통해 수득할 수 있다. 상기 방법은 본 분야의 기술자에게 공지되어 있다.
바람직하게, 본 발명에 따른 백신은 또한 어쥬번트를 포함한다. 따라서, 본 발명은 추가로 하나 이상의 적절한 어쥬번트(들) 및/또는 부형제(들) 및/또는 담체(들)을 포함하는 본 발명에 따른 조성물 백신을 추가로 포함한다.
본 발명에서 사용되는 어쥬번트는 주사한 동물의 면역 반응을 증대시키는 물질을 포함한다. 다수의 상이한 어쥬번트가 본 분야에 공지되어 있다. 본 명세서에서 사용되는 어쥬번트는 프로인트 완전 및 불완전 어쥬번트, 비타민 E, 비이온성 차단 폴리머, 뮤라밀디펩티드, Quil A, 광유 및 무광물유 및 Carbopol(호모폴리머)을 포함한다. 바람직한 일례로, 본 발명의 박테리아의 백신은 유중수형 유제 어쥬번트를 포함한다. 상기 백신은 또한, 본 발명에 따른 불활성화된(사멸된) 박테리아 및 유중수형 유제 어쥬번트를 포함하는 박테린(bacterin)으로 명명된다. 본 발명의 기술자에게 공지되어 있는 박테리아를 어쥬베이트(adjuvate)시키는 다른 방법 역시 본 발명에 포함된다.
또한, 바람직하게 본 발명에 따른 백신은 하나 이상의 적절한 유화제, 예로서 Span 또는 Tween을 포함할 수 있다.
바람직하게, 백신중 백신중 생, 및/또는 생 약독화된, 및/또는 불활성화된 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica) 및/또는 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica)의 분획은 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) ATCC No. PTA-3667, 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) ATCC No. PTA-3668 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica) ATCC No. PTA-3669로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
바람직하게, 본 발명에서 백신은 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) ATCC No. PTA-3667, 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) ATCC No. PTA-3668 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica) ATCC No. PTA-3669로 구성된 그룹으로부터 선택되는 박테리아의 적어도 하나의 항원을 포함한다. 백신은 상기 균주(들)의 전체 박테리아 세포, 박테리아 추출물, 외막 분획, 박테리아 외- 및 내독소, 및 정제된 단백질을 포함할 수 있다. 항원 폴리펩티드 또는 그의 단편은 예를 들면, 정제된 박테리아 단백질로부터 또는 일부 원핵 또는 진핵 세포 발현 시스템에서 상응하는 유전 물질의 발현을 통해 또는 유기-화학적 합성을 통해 수득할 수 있다. 상기 방법은 본 분야의 기술자에게 공지되어 있다.
가장 바람직하게, 본 발명은 추가로 조류에 대한 바이러스 또는 미생물로부터의 적어도 하나의 다른 항원을 포함하는 본 발명에 따른 백신 조성물에 관한 것이다. 바람직하게, 상기 항원은 생, 약독화 또는 불활성화 바이러스 또는 미생물 또는 그의 단편 형태로 존재한다. 단편은 상기 균주(들)의 전체 박테리아 세포, 박테리아 추출물, 외막 분획, 박테리아 외- 및 내독소, 및 정제된 단백질을 포함할 수 있다. 항원 폴리펩티드 또는 그의 단편은 예를 들면, 정제된 박테리아 단백질로부터 또는 일부 원핵 또는 진핵 세포 발현 시스템에서 상응하는 유전 물질의 발현을 통해 또는 유기-화학적 합성을 통해 수득할 수 있다. 상기 방법은 본 분야의 기술자에게 공지되어 있다.
가장 바람직하게, 본 발명은 제한하는 것은 아니지만, 기관지염 바이러스, 뉴캣슬 질병 기관지염 바이러스, 감염성 점액낭 질병 바이러스(병명: 감보로(Gumboro), 닭 빈혈 인자, 조류 레오바이러스, 미코플라즈마 갈리셉티쿰(Mycoplasma gallisepticum), 조류-뉴모바이러스, 헤모필루스 파라갈리나룸(Haemophilus paragallinarum)(병명: 코감기), 닭 폭스바이러스, 조류 뇌척수염 바이러스, 파스튜렐라 물토시다(Pasteurella Multocida) 및 E. Coli로부터 선택되는 바이러스 또는 미생물로부터의 적어도 하나의 다른 항원을 포함하는 본 발명에 따른 백신 조성물에 관한 것이다.
"약제학적 조성물"은 본질적으로 투여받은 유기체, 또는 상기 유기체중 또는 표면상에 사는 유기체들의 면역학적 기능과 같은 생리학적 기능을 변형시킬 수 있는 하나 이상의 성분으로 구성된다. 제한하는 것은 아니지만, 이 용어는 항생제 또는 항기생충제, 및 특정의 다른 목적, 예를들어 제한되는 것은 아니지만 처리 특성, 생식불능, 안정성, 장내 또는 비경구 경로, 예를들어 경구, 비강내, 정맥내, 근육내, 피하. 피내 또는 다른 적절한 경로를 통한 조성물 투여의 용이성, 투여후의 내성, 조절된 방출 성질을 달성하기 위하여 첨가되는 다른 구성 성분으로 구성된다. 따라서, 본 발명의 또다른 일면으로, 본 발명은 생, 및/또는 생 약독화된, 및/또는 불활성화된 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica) 및/또는 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica)의 분획을 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 상기 기술된 바와 같은 본 발명에 따른 생, 및/또는 생 약독화된, 및/또는 불활성화된 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica) 및/또는 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica)의 분획을 본 분야의 기술자에게 공지된 바와 같이 적절한 투여량으로 그를 필요로 하는 조류 동물에 투여하고 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica) 감염에 의해 유발된 질병이 감소되었음을 모니터하는, 조류 그룹에 속하는 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica)(예: 상기 기술된 바와 같은 살아있는 박테리아)-감염된-동물(예: 상기 기술된 바와 같은 살아있는 박테리아)을 치료하는 방법에 관한 것이다. 바람직하게 치료는 반복할 수 있다.
추가의 중요한 일면은 면역학적 유효량의 본 발명에 따른 백신을 투여하고 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica) 감염에 의해 유발된 증상이 감소되었음을 모니터하는 것을 포함하는 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica)(예: 상기 기술된 바와 같은 살아있는 박테리아)에 의해 유발된 호흡 및 생식관의 질병에 대하여 조류를 면역화시키는 방법이다.
또다른 중요한 일면은 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica) 감염 예방용 백신의 제조에서 본 발명에 따른 불활성화된 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica) 및/또는 본 발명에 따른 생 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica) 및/또는 본 발명에 따른 생 약독화된 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica) 및/또는 본 발명에 따른 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica)의 분획의 용도이다.
본 발명은 또한 혈액, 혈청, 혈장, 조직 찰과표본(scraping), 세액, 면봉(swab), 조직으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 샘플을 조류로부터 수득하고 샘플을 본 발명의 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica)의 존재에 대하여 분석하는 단계를 포함하는, 유발된 질병을 진단하는 방법에 관한 것이다.
바람직한 일례에서, 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica)의 존재는 면역 시험에 의해 측정된다. 면역 시험은 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica)에 특이성인 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체를 사용한다. 모노클로날 항체의 제조는 본 분야에 공지되어 있다(3, 4). 면역 시험은 본 분야에 공지된 검출 방법, 예로서, ELISA-시험 (효소면역측정법) 또는 소위 샌드위치-ELISA-시험, 도트 블랏, 이뮤노블랏, 방사선면역 시험 (방사선면역분석, RIA), 또는 확산-기초 Ouchterlony 시험 또는 로켓트 면역형광측정법) 또는 응집 시험(플레이트 또는 마이크로플레이트 급속 응집 시험)을 포함한다. 또다른 면역 시험은 소위 웨스턴 블랏(또는 웨스턴 전달 방법 또는 웨스턴 블랏팅으로 공지되어 있음)이다. 웨스턴 블랏의 목적은 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 니트로셀룰로오스 필터 또는 다른 적절한 캐리어에 의해 분리된 단백질 또는 폴리펩티드를 전달하고 동시에 겔 전기영동에 의해 수득한 단백질 또는 폴리펩티드의 상대적인 위치를 보유하는 것이다. 이어서 웨스턴 블랏을 고려중인 단백질 또는 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체와 함께 인큐베이션시킨다. 이 검출 방법은 본 명세서에 기술된 발명을 수행하는 일반 기술자에 의해 사용될 수 있다. 기술자가 상기 언급한 방법 및 다른 검출 방법을 찾을 수 있는 참고 문헌은 하기에 나열한다: : An Introduction to radioimmunoassay and Related Techniques, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, The Netherlands (1986); Bullock et al., Techniques in Immunocytochemistry, Academic Press, Orlanda, FL, Bd. 1 (1982), Bd. 2 (1983), Bd. 3 (1985); Tijssen, Practice and Theory of enzyme immunoassays: Laboratory Techniques in, Biochemistry and Molecular Biology, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, The Netherlands (1985).
특별한 또다른 일면으로, 상기 기술한 샘플을 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica)에 특이성인 항체와 인큐베이션시키고 그렇게 형성된 항원/항체를 측정한다.
본 발명에 따른 방법의 특이 바람직한 일면으로, 상기 기술한 바와 같은 샘플중 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica)의 존재는 분자 생물학적 방법에 의해 측정한다. 본 명세서에서 사용되는 분자 생물학적 방법은 예를 들면, 중합효소연쇄반응(PCR) 또는 역전사중합효소연쇄반응(RT-PCR)를 포함하는 검출방법을 의미하거나 기술자가 일반 참고 서적(참조. Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflg., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; and Bertram, S. and Gassen, H. G. Gentechnische Methoden, G. Fischer Verlag, Stuttgart, New York, 1991)에서 찾아볼 수 있는 노던 또는 서던 블랏일 수 있다.
본 발명은 또한 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica)를 검출하기 위한 모든 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 본 발명에 따른 진단 시험용 키트를 포함한다.
진단 시험용 키트는 본 발명에 따른 진단 방법을 수행하기 위한 모든 구성 요소의 집합체이다. 본 발명에 따른 방법을 수행하기 위한 다른 요소의 일부 예(열거하지 않음)는 예로서, 96-웰 플레이트 또는 마이크로틸터 플레이트, 테스트 튜브, 다른 적절한 용기와 같은 용기, 표면 및 기판(substrate), 막 예를 들면, 니트로셀룰로오스 필터, 세제 및 완충액을 포함한다. 진단 시험용 키트는 또한 결합된 항체, 예로서 표지된 2차 항체, 발색단, 효소(예: 항체와 컨쥬게이트됨) 및 그의 기판 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질을 포함한다.
본 발명은 추가로 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica)-특이성 DNA 또는 RNA를 검출하기 위하여 PCR 또는 RT-PCR을 수행하기 위한 모든 구성 요소 를 포함하는 것을 특징으로 하는 본 발명에 따른 진단 시험용 키트에 관한 것이다. 상기 키트는 제한하는 것은 아니지만, 시험 튜브 또는 96-웰 플레이트 또는 마이크로틸터 플레이트외에도 다른 적절한 용기, 표면 및 기판, 막 예를 들면, 니트로셀룰로오스 필터, 세제 및 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양할 수 있다), 멸균수, 광유, BSA(송아지 혈청 알부민), MgCl2, (NH4)2SO4, DMSO(디메틸설폭시드), 머캅토에탄올, 뉴클레오티드(dNTPs), 효소, 예를 들면 Taq-폴리머라제 및 역전사효소, 및 DNA-매트릭스로서 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica)에 특이성인 DNA 또는 cDNA, 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica) DNA 또는 RNA에 특이성인 올리고뉴클레오티드, 대조군 주형, DEPC-수, DNAse, RNAse 및 추가로 본 분야의 기술자에게 공지되어 있는 추가의 성분을 포함할 수 있다. 본 발며에 따른 올리고뉴클레오티드는 엄격한 조건하에서 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica) 단백질에 상보적인 핵산 서열에 결합하는 길이가 약 15 내지 약 100개의 뉴클레오티드인 단쇄의 핵산 분자이다. 엄격한 조건에 의해 기술자는 85%이상, 바람직하게 90% 이상의 상동성을 위해 선택되는 조건을 의미한다(참조. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflg., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; 및Bertram, S. 및Gassen, H. G. Gentechnische Methoden, G. Fischer Verlag, Stuttgart, New York, 1991).
하기 예는 본 발명을 설명하기 위한 것이고, 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.
파스튜렐라 트레할로시(
Pasteurella trehalosi
) 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(
Mannheimia haemolytica
)와 관련된 필드 질병 돌발
임상 징후
필드 관찰로부터
레이어즈 | 브로일러 |
경미한 상부 호흡기/생식기 | 중증의 상부 호흡기/생식기 |
22주령 | 7주령 |
콧물 | 수포음을 포함하는 재채기 |
눈가 종창 | 두부 팽창 |
낮은 음식물 섭취 | 낮은 음식물 섭취 |
백색 설사 | 우울증 |
달걀 생산 감소 | 비균일적 성장 |
낮은 사망율 | 목털이 남 |
전위된 닭벼슬 | 피로 |
청색증을 갖는 닭벼슬 | 사망율 8% |
전체 장애 | |
출혈을 포함하는 난소 위축 및 퇴보 | 생식샘 출혈 |
난포 변성 | 상부 기관의 출혈 |
간 비대 | 출혈을 포함하는 간 비대 |
신장 염증 | |
복부 지방내 출혈 | 출혀을 포함하는 지라 비대 |
흉강내 출혈 | 근육내 출혈 |
난관내 출혈 | 심장내 출혈 및 물심장막증 |
심장 지방내 출혈 | 흉강내 출혈 |
수탁 번호 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) ATCC No. PTA-3667 (내부 식별표시 BIV-4985); 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) ATCC No. PTA-3668 (내부 식별표시 BIV-AVICOR); - 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica) ATCC No. PTA-3669 (내부 식별표시 BIV-07990)하에 아메리카 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection(ATCC))(1081, University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, USA)에 신규한 타입의 그람-음성, 통성 혐기성, 다형 막대형 박테리아의 균주 3개를 기탁하였다. 기탁일은 2001년 8월 22일이었다.
기탁된 박테리아는 Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Bd. I (1984. Williams and Wilkins, 428 East Preston Street. Baltimore, USA)을 사용하여 표준 측정 방법에 따라 분류하였다.
표 1
만헤이미아 헤모리티카(
Mannheimia haemolytica
): BIV-07990 (바이오타입 1); ATCC No. PTA-3669
육안상의 형태
24 시간동안 양 혈액 아가에서 배양된 콜로니, 지름 범위 1.0 내지 1.5 mm,
밝은 반투명, 약간 볼록, 매끈 및 크리미, β -용혈
현미경상의 형태
그람-음성, 비-운동성, 다형 막대기형, 주로 양극성 염색을 보임.
생화학적 및 다른 시험
섹션 A
시험 | 반응 |
옥시다아제 | + |
카탈라아제 | + |
인돌 | - |
글루코오스 | + |
수크로오스 | + |
맥콘키 | + |
우레아제 | - |
질산염 | + |
섹션 B
말토오스 | + |
만니톨 | + |
아라비노오스 | - |
셀로비오스 | - |
소르비톨 | + |
크실로스 | + |
트레할로스 | - |
살리신 | - |
오르니틴 | - |
에스쿨린 | - |
β글루코시다아제 | - |
α푸코시다아제 | - |
β갈락토시다아제 | + |
표 2
파스튜렐라 트레할로시(
Pasteurella trehalosi
): BIV-AVICOR (바이오타입 2); ATCC No. PTA-3668
육안상의 형태
24 시간동안 양 혈액 아가에서 배양된 콜로니, 지름 범위 1.0 내지 1.5 mm,
밝은 반투명, 약간 볼록, 매끈 및 크리미, β -용혈
현미경상의 형태
그람-음성, 비-운동성, 다형 막대기형, 주로 양극성 염색을 보임.
생화학적 및 다른 시험
섹션 A
시험 | 반응 |
옥시다아제 | + |
카탈라아제 | + |
인돌 | - |
글루코오스 | + |
수크로오스 | + |
맥콘키 | + |
우레아제 | - |
질산염 | + |
섹션 B
말토오스 | + |
만니톨 | + |
아라비노오스 | - |
셀로비오스 | - |
소르비톨 | + |
크실로스 | + |
트레할로스 | + |
살리신 | - |
오르니틴 | - |
에스쿨린 | - |
β글루코시다아제 | +α |
α푸코시다아제 | - |
β갈락토시다아제 | + |
α 80%가 양성
표 3
파스튜렐라 트레할로시(
Pasteurella trehalosi
): BIV-4895 (바이오타입 4); ATCC No. PTA-3667
육안상의 형태
24 시간동안 양 혈액 아가에서 배양된 콜로니, 지름 범위 1.0 내지 1.5 mm,
밝은 반투명, 약간 볼록, 미립자 및 건성, β -용혈
현미경상의 형태
그람-음성, 비-운동성, 다형 막대기형, 주로 양극성 염색을 보임.
생화학적 및 다른 시험
섹션 A
시험 | 반응 |
옥시다아제 | + |
카탈라아제 | + |
인돌 | - |
글루코오스 | + |
수크로오스 | + |
맥콘키 | + |
우레아제 | - |
질산염 | + |
섹션 B
말토오스 | - |
만니톨 | + |
아라비노오스 | - |
셀로비오스 | - |
소르비톨 | + |
크실로스 | + |
트레할로스 | + |
살리신 | - |
오르니틴 | - |
에스쿨린 | - |
β글루코시다아제 | - |
α푸코시다아제 | - |
β갈락토시다아제 | + |
A 및 B(표 1, 2, 및 3)중 의 실험 결과를 통해 파스튜렐라세아(Pasteurellaceae)과에 속하는 세균 BIV-4895; ATCC No. PTA-3667 및BIV- AVICOR; ATCC No. PTA-3668(파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi); 트레할로스 양성 및 아라비노오스 음성), 만헤이미아(Mannheimia)과에 속하는 세균 BIV-07990; ATCC No. PTA-3669(만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica). 트레할로시 음성 및 아라비노오스 음성)을 확인하였다.
병원체의 동정
감염된 기도, 구개열, 난소, 간, 심장, 신장 및 생식샘(브로일러)로부터로부터 박테리아를 분리하였다. 이들을 하기 열거한 시험에 기초하여 본 발명에 따른 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica)로서 동정하였다:
베타 용혈 +
그람 염색 -
옥시다아제 +
카탈라아제 +
우레아제 -
질산염 +
인돌 -
바이러스 또는 다른 박테리아의 분리물은 제조하지 않았다.
바이오타입핑:
Jaworski 등(1) 에 의해 기술된 방법에 따라 박테리아 분리물을 정제하고 바이오타입핑 하였다. 3개의 상이한 바이오타입(4,2,1)을 동정하였다. 간단하게, 정제된 분리물로부터 단일 콜로니를 3ml의 트립토스-브로쓰를 포함하는 튜브내로 접종하고, 8시간동안 37℃에서 인큐베이션시켰다. 튜브로부터 루브의 접종물(20㎕)을 3ml의 1% 당을 포함하는 시험하는 또다른 튜브로 이동시키고 결과를 기록하기 앞서 7시간동안 37℃에서 인큐베이션시켰다.
접종 모델:
박테리아를 정제한 후, 분리물을 트립토스 배지에서 배양하여 다량의 순수한 병원균을 수득하였다. Koch 가설을 입증하기 위하여 13주령된 특정 병원균이 없는 (SPF) 닭 3개의 상이한 그룹(각 그룹당 20마리)을 정맥을 통해 각 바이오타입(0,2 ml/마리; 3 x 108 CFU/ml)으로 감염시켰다. 3일동안 매일 사망율 및 이병율에 대하여 관찰하였다. 3일째날 최종적으로 모든 새을 희생시키고, 사후 병변을 기록하고 기관 샘플(간 및 생식샘)을 재분리하기 위하여 회수하였다. 죽은 새의 사후 병변을 기록하였다.
결과
임상 징후: 피로, 절름발이, 닭벼슬 전위, 목털, 닭벼슬 끝의 청색증
병변:
병변 | BIV-4985(바이오타입 4) | BIV-AVICOR(바이오타입 2) | BIV-07990(바이오타입 1) |
심장 부종 | 73% | 37% | 90% |
심장 출혈 | 90% | - | 70% |
심장 지방내 출혈 | 90% | 37% | 50% |
심장막염 | 73% | 46% | 30% |
흉강내 출혈 | - | 19% | 40% |
난소내 출혈 | 64% | 9% | 20% |
신장 염증 | 64% | 46% | 60% |
신장 출혈 | 55% | 46% | 20% |
출혈을 포함하는 간 비대 | - | 73% | - |
공기소낭염 | 64% | - | - |
근육내 출혈 | - | 37% | - |
사망율 | 46% | 19% | - |
실시예 II
본 발명에 따른 박테리아의 배양, 백신 제조 및 SPF 새의 백신화
균주를 트립토스-브로쓰 (TB)상에서 배양하였다. 균주에 따라 접종 후 약 -8시간 후 대수증식기로 회수하였다. 적정을 위해 양 혈액 아가에서 플레이트 계수를 수행하였다. 밀리리터당 콜로닝 형성 유니트(CFU/ml)는 1:10의 수확물 희석액을 사용하여 측정하였다. 최종 농도 0.2%의 포름알데히드를 가하여 세포를 죽였다. 이 현탁액의 멸균도를 측정한 후, 최소 역가 108CFU/ml를 최종 백신에 가하였다.
두개의 균주(BIV-4895, ATCC No. PTA- 3667 및 BIV-AVICOR, ATCC No. PTA-3668) 및 오일성-어쥬번트(60%/40%=오일/물의 비를 갖는 광유에 기초한 유중수 유제)를 혼합하여 최소 농도 107 CFU/균주/ml로 백신을 제조하였다.
2, 5, 9주령째의 특정 병원균이 없는(specific pathogen free(SPF) 닭의 목 중간 아랫 부위에 0.5ml의 백신을 피하 주사하여 백신화시켰다.
실시예 III
접종 균주의 제조 및 백신화된 그룹 및 대조군의 접종
박테리아 균주 BIV-4895, ATCC No. PTA-3667 및BIV-AVICOR, ATCC No. PTA-3668을 24시간동안 37℃에서 인큐베이션된 양 혈액 아가상에서 배양하였다. 540nm에서 분광광도계를 사용하여 현탁액의 광학 밀도가 2.0에 도달할 때까지 세포를 트립토스-브로쓰 (TB)에서 채취하였다. 접종을 위해 최종 접종 용량중 하기 갯수의 세포를 포함하는 표본을 제조하였다:
3 x 109 CFU/ml BIV-AVICOR; ATCC No. PTA-3668
1.45 x 1010 CFU/ml BIV-4895, ATCC No. PTA-3667
13주령째,백신화된 새 20마리 및 백신화되지 않은 새 20를 0.2ml의 접종물(적어도(108.0CFU/새)를 정맥내로 접종시켰다. 새를 3일동안 사망율 및 이병율에 대하여 관찰하였다. 3일동안 관찰한 후 남은 새 모두를 희생시키고 각 새의 간 및 생식샘으로부터 박테리아를 재분리하였다. 죽은 새의 사후 병변을 기록하였다.
결과
새 그룹 | 접종 접종물 | 사망율+재분리 | 보호율(%) |
음성 대조군 | N/A | 0 | N/A |
양성 대조군 | ATCC No. PTA-3667 | 77 | 23 |
양성 대조군 | ATCC No. PTA-3668 | 54 | 46 |
백신화됨 | ATCC No. PTA-3667 | 0 | 100 |
백신화됨 | ATCC No. PTA-3668 | 5 | 95 |
실시예 IV
본 발명에 따른 박테리아의 배양, 백신 제조 및 SPF 새의 백신화
균주를 트립토스-브로쓰 (TB)상에서 배양하였다. 균주에 따라 접종 후 약 -8시간 후 대수증식기로 회수하였다. 적정을 위해 양 혈액 아가에서 플레이트 계수를 수행하였다. 밀리리터당 콜로닝 형성 유니트(CFU/ml)는 1:10의 수확물 희석액을 사용하여 측정하였다. 최종 농도 0.2%의 포름알데히드를 가하여 세포를 죽였다. 이 현탁액의 멸균도를 측정한 후, 최소 역가 108CFU/ml를 최종 백신에 가하였다.
세개의 균주(BIV-4895, ATTC No. PTA-3667; BIV-AVICOR, ATCC No. PTA-3668 및 BIV-07990, ATCC No. PTA-3669) 및 오일성-어쥬번트(60%/40%=오일/물의 비를 갖는 광유에 기초한 유중수 유제)를 혼합하여 최소 농도 107 CFU/균주/ml로 백신을 제조하였다.
2, 5, 9주령째의 특정 병원균이 없는(specific pathogen free(SPF) 닭의 목 중간 아랫 부위에 0.5ml의 백신을 피하 주사하여 백신화시켰다.
실시예 V
접종 균주의 제조 및 백신화된 그룹 및 대조군의 접종
박테리아 균주 BIV-4895, ATTC No. PTA-3667; BIV-AVICOR, ATCC No. PTA-3668 및 BIV-07990, ATCC No. PTA-3669을 24시간동안 37℃에서 인큐베이션된 양 혈액 아가상에서 배양하였다. 540nm에서 분광광도계를 사용하여 현탁액의 광학 밀도가 2.0에 도달할 때까지 세포를 트립토스-브로쓰 (TB)에서 채취하였다. 접종을 위해 최종 접종 용량중 하기 갯수의 세포를 포함하는 표본을 제조하였다:
8.3 x 10 CFU/ml BIV-AVICOR; ATCC No. PTA-3668
2.2 x 10 CFU/ml BIV-4895; ATCC No. PTA-3667
1.0 x 10 CFU/ml BIV-07990; ATCC No. PTA-3669
13주령째,백신화된 새 20마리 및 백신화되지 않은 새 20를 0.2ml의 접종물(적어도(108.0CFU/새)를 정맥내로 접종시켰다. 새를 3일동안 사망율 및 이병율에 대하여 관찰하였다. 3일동안 관찰한 후 남은 새 모두를 희생시키고 각 새의 간 및 생식샘으로부터 박테리아를 재분리하였다. 죽은 새의 사후 병변을 기록하였다.
결과
새 그룹 | 접종 접종물 | 사망율+재분리 | 보호율(%) |
백신화된 음성 대조군 | N/A | 0 | N/A |
백신화되지 않은 음성 대조군 | N/A | 0 | N/A |
백신화됨 | ATCC No. PTA-3669 | 27.3 | 72.7 |
백신화됨 | ATCC No. PTA-3668 | 20.9 | 79.1 |
백신화됨 | ATCC No. PTA-3667 | 16.7 | 83.7 |
양성 대조군 | ATCC No. PTA-3669 | 53.3 | 46.7 |
양성 대조군 | ATCC No. PTA-3668 | 53.3 | 46.7 |
양성 대조군 | ATCC No. PTA-3667 | 64.3 | 35.7 |
혈청학적 시험
Biberstein et. al. (2)의 방법에 따라 각 바이오타입을 대표하는 분리물로 래빗에서 고면역혈청을 제조하였다.
분리물을 밤새도록 혈액 아가에서 배양한 후, 0.3% 포르말린을 포함하는 염수에서 채취하였다. 세포를 1회 세척하고 주사하기 위하여 575nm에서 10% 투과율로 조정하였다. 스케줄에 따라 4일 간격으로 0.5ml, 1.0; 2.0; 3.0; 3.0; 3,0 IV 경로로 주사하고, 최종 주사후 4일째 모든 래빗을 출혈시켰다.
3개의 바이오타입을 사용하여 그의 특이성에 대하여 고면역혈청을 시험하고 급속 플레이트 응집에 의해 상동성 및 이질성 래빗 항혈청(2배 희석액)과 반응시켰다.
종점이 양성인 최고 희석율에 도달할때까지 각 바이오타입의 항혈청을 희석하였다.
희석율(log2)
항원 바이오타입 1
항혈청 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | |
1 | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | |
2 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | |
4 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
희석율(log2)
항원 바이오타입 4
항혈청 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 |
1 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
2 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
4 | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
희석율(log2)
항원 바이오타입 2
항혈청 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 |
1 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
2 | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
4 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
이어서 바이오타입 특이성 고면역 혈청을 마이크로-플레이트 혈청 응집 시험에서 양성 대조군으로서 사용하였다.
실시예 VI
박테리아 균주 BIV-4895, ATTC No. PTA-3667; BIV-AVICOR, ATCC No. PTA-3668 및 BIV-07990, ATCC No. PTA-3669을 24시간동안 37℃에서 인큐베이션된 양 혈액 아가상에서 배양하였다. 540nm에서 분광광도계를 사용하여 현탁액의 광학 밀도가 2.0에 도달할 때까지 세포를 트립토스-브로쓰 (TB)에서 채취하였다. 접종을 위해 최종 접종 용량중 하기 갯수의 세포를 포함하는 표본을 제조하였다:
1.5 x 1010 CFU/ml BIV-AVICOR; ATCC No. PTA-3668
1.7 x 1010 CFU/ml BIV-4895; ATCC No. PTA-3667
1.6 x 1010 CFU/ml BIV-07990; ATCC No. PTA-3669
13주령째,백신화된 새 20마리 및 백신화되지 않은 새 20를 0.2ml의 접종물(적어도(108.0CFU/새)를 정맥내로 접종시켰다. 새를 3일동안 사망율 및 이병율에 대하여 관찰하였다. 3일동안 관찰한 후 남은 새 모두를 희생시키고 각 새의 간 및 생식샘으로부터 박테리아를 재분리하였다. 죽은 새의 사후 병변을 기록하였다.
결과
표 1. 사망율 및 재분리에 기초한 백신의 효능 평가
새 그룹 | 접종 접종물 | 사망율+재분리 | 보호율(%) |
백신화되지 않은 음성 대조군 | N/A | N/A | N/A |
양성 대조군 | ABIV-4895 | 70 | 30 |
양성 대조군 | BIV-AVICOR | 80 | 20 |
양성 대조군 | BIV-07990 | 88.8 | 11.2 |
백신화됨 | BIV-4895 | 10 | 90 |
백신화됨 | BIV-AVICOR | 10 | 90 |
백신화됨 | BIV-07990 | 15 | 85 |
표 2. 접종후의 전체 병변에 기초한 백신의 효능 평가
새 그룹 | 접종 접종물 | 병변율 | 보호율(%) |
백신화되지 않은 음성 대조군 | N/A | N/A | N/A |
양성 대조군 | ABIV-4895 | 74.4 | 25.6 |
양성 대조군 | BIV-AVICOR | 27.0 | 73.0 |
양성 대조군 | BIV-07990 | 7.0 | 93.0 |
백신화됨 | BIV-4895 | 4.0 | 96.0 |
백신화됨 | BIV-AVICOR | 1.1 | 99.0 |
백신화됨 | BIV-07990 | 2.4 | 98.0 |
참고문헌
1) Jaworski M. D., D. L. Hunter, A. C. S. Ward. Biovariants of isolates of Pasteurella from domestic and wild ruminants. J. Vet. Invest. 1988, 10: 49-55.
2) Biberstein EL., Meyer M. E. 및Kenedy P. C. Colonial variation of Pasteurella haemolytica isolated from sheep. J. Bact. 1958, 76: 445-452.
3) Kearney, J. F., Radbruch A., Liesegang B., Rajewski K. A new mouse myeloma cell line that has lost imunoglobulin expression but permits construction of antibody-secreting hybrid cell lines. J. Immunol. 1979, 123: 1548-1550.
4) Kohler, G., Milstein, C. Continous culture of fused cells secreting antibody of predefined specifity. Nature 1975, 265:495-497
아메리카 타입 컬쳐 콜렉션
미국 버지니아주 20110-2209
마나사스 유니버시티 블러버드 1081
전화: 703-365-2700, 팩스: 703-365-2745
2001년 9월 12일
수신인: 아벨라르도 아퀼라르. 팩스 번호: 52 3 668 80 80
발신인 : ATCC 특허 기탁 수탁소
지정 수탁번호 ATCC No. PTA-3667의 BIV-4895 조류 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi)
지정 수탁번호 ATCC No. PTA-3668의 BIV-AVICOR 조류 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi)
지정 수탁번호 ATCC No. PTA-3669의 BIV-07990 조류 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica)
기탁일: 2001년 8월 22일. 본 문서는 며칠 후 송부될 것이며, 청구서는 따로 송부할 것이다:
일반 보관/통지 $ 3,450.00
생존능 시험 $ 480.00
PTA-3667 내지 PTA-3669에 대한 총 금액 $ 3,930.00
(서명) 마링레 하리스, 전문가
ATCC 특허 수탁소
부다페스트 조약 기탁
아메리카 타입 컬쳐 콜렉션 ATCC
미국 버지니아주 20110-2209
마나사스 유니버시티 블러버드 1081
전화: 703-365-2700, 팩스: 703-365-2745 전자메일: sci@atcc.org
특허절차상의 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약에 대한 요건을 충족시키기 위하여 기탁하거나 기탁물을 전환시키기 위함.
1. 기탁물 명칭
앞서 파스튜렐라 헤모리티카(Pasteurella haemolytica)로 공지된 조류 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica)
2. 균주 식별 표시
BIV-07990
3. 부다페스트 조약하에 원기탁됨.
4. 이는 부다페스트 조약에 대한 요건을 충족시키기 위하여 이미 ATCC에 기탁된 것을 전환시키고자 하는 것이 아님.
5. 이는 미생물 또는 세포의 혼합물이 아니다.
6. 상세한 설명
부록 3 참조
7. ATCC가 기탁물의 성질을 확인하기 위한 충분한 설명
부록 3 참조
a. 기탁물은 세포 배양물이 아니다.
b. 기탁물은 하이브리도마가 아니다.
8. 본 균주는 인간, 동물, 식물에 무해하다.
9. 이용가능성.
a. 특허시까지 기탁물을 이용할 수 없다.
b. 부다페스트 조약 비가맹국에서는 이용할 수 없다.
10. ATCC는 생존능 시험을 한 후, 아벨라르도 아퀼라르(팩스 번호: 52 3 668 80 80, 전화번호: 52 3 668 8038, 전자메일: baquilar@qua.boehringer ingelgeim.com)에 통보할 것이다.
11. ATCC는 멕시코 자리스코 44940 구아다라자라 조나 인더스트리알 칼레 30 2614번에 소재하는 아벨라르도 아퀼라르(팩스 번호: 52 3 668 80 80, 전화번호: 52 3 668 8038)에게 청구할 것이다.
13. 베링거 인겔하임 베트메디카 에스.에이.데 씨.브이.를 대신하여 기탁함.
부다페스트 조약 규칙 9.1하에 지어된 기간(미생물시료의 분양에 대한 가장 최근의 요청이 접수된 후 최소한 5년간 동 미생물을 보관하여야 하며 어떠한 경우에도 수탁일로부터 최소한 30년간)동안은 기탁을 철회할 수 없고, 바이러스, 세포 배양액, 플라스미드, 배(embryo), 및 시드(seed)의 경우 상기 기간 또는 특허 존속기가동안 세포 배양물이 죽거나 파괴되는 경우, 동일 유기체 또는 세포의 살아있는 배양액으로 교체해 줄 책임이 있으며, 상기 기간동안 분양을 위한 충분량을 공급해야할 책임이 있음을 이해하고 동의한다.
2001년 5월 24일 인그. 조지 수칠 비. 서명( )
주소: 멕시코 자리스코 44940 구아다라자라 조나 인더스트리알 칼레 30 2614번
전화 번호: 52 3 668 8000, 팩스번호: 52 3 668 8080 전자메일: jsuchil@gua.boehringer-ingelheim.com
아메리카 타입 컬쳐 콜렉션
미국 버지니아주 20110-2209 마나사스 유니버시티 블러버드 1081
수탁한 미생물시료의 분양에 대한 가장 최근의 요청이 접수된 후 최소한 5년간 동 미생물을 보관하여야 하며 어떠한 경우에도 수탁일로부터 최소한 30년간은 이를 보관된다.
3. 수입자:
아메리카 타입 컬쳐 콜렉션
미국 버지니아주 20110-2209 마나사스 유니버시티 블러버드 1081
5. 수입 물질의 기재:
냉동 건조된 BIV-07990으로 동정된, 앞서 파스튜렐라 헤모리티카(Pasteurella haemolytica)로 공지된 조류 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica)을 포함하는 25개의 유리 바이알.
9. 수입품의 처리
부록 6 참조.
부록 3
부다페스트 조약 기탁
6번에 대한 답변.
배양 이 균주를 뇌 심장 융합 브로쓰(Difco) 또는 트립토스-브로쓰 (TB)에서 배양하였다. 장기간의 성장기는 37℃에서 인큐베이션시 약 6 내지 8시간이다. 혈액 아가중 성장 피크는 37℃에서 24시간 후 관찰되었고 용혈을 관찰할 수 있다는 것이 이 방법의 잇점이다.
동결건조 보존 6 내지 8시간 박테리아를 뇌 심장 융합 브로쓰(Difco)에서 배양하였다. 안정화제로서 1:1(v/v) 비율의 10%의 박토 스킴 밀크 멸균 용액(Difco)을 사용한다.
생존능 시험: 냉동 건조된 바이알을 취하여 1ml의 멸균 PBS 1X, pH 7.2로 재구성시킨다. 멸균 PBS, pH 7.2로 10배 희석시킨다. 100㎕의 각 희석액을 혈액 아가 플레이트상에 접종한다. 37℃에서 24시간동안 인큐베이션시킨다. 콜로니 계수 방법에 의해 생존능을 시험한다.
7번 답변
BIV-07990
육안상의 형태
24 시간동안 양 혈액 아가에서 배양된 콜로니, 지름 범위 1.0 내지 1.5 mm,
밝은 반투명, 약간 볼록, 매끈 및 크리미, β -용혈
현미경상의 형태
그람-음성, 비-운동성, 다형 막대기형, 주로 양극성 염색을 보임.
생화학적 및 다른 시험
시험 | 반응 |
옥시다아제 | + |
카탈라아제 | + |
인돌 | - |
글루코오스 | + |
수크로오스 | + |
맥콘키 | + |
우레아제 | - |
질산염 | + |
말토오스 | + |
만니톨 | + |
아라비노오스 | - |
셀로비오스 | - |
소르비톨 | + |
크실로스 | + |
트레할로스 | - |
살리신 | - |
오르니틴 | - |
에스쿨린 | - |
β글루코시다아제 | - |
α푸코시다아제 | - |
β갈락토시다아제 | + |
부록 6
6번에 대한 답변(미국내 들여오기전 물질의 처리)
BIV-07990 균주
1. 자궁관층으로부터 분리
2. 기관을 물에 담가 부드럽게 함.
3 영양 배지(Difco로부터 20ml의 BHI)내 접종
4. 37℃에서 24시간동안 인큐베이션.
5. 양 혈액 아가 플레이트상에 시드
6. β용혈성 콜로니 분리
7. 양 혈액 아가 플레이트상에 시드
8. 동정(생화학적 및 다른 시험)
9. Difco로부터의 BHI 브로쓰상에 시드
10. 6 내지 8시간동안 뇌 심장 융합 브로쓰(Difco)에서 박테리아 배양
11. 안정화제로서 1:1(v/v) 비율의 10%의 박토 스킴 밀크 멸균 용액(Difco) 첨가
12. 샘플 냉동건조
13. 생존능, 순도 및 생화학적 시험.
부다페스트 조약 기탁
아메리카 타입 컬쳐 콜렉션 ATCC
미국 버지니아주 20110-2209
마나사스 유니버시티 블러버드 1081
전화: 703-365-2700, 팩스: 703-365-2745 전자메일: sci@atcc.org
특허절차상의 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약에 대한 요건을 충족시키기 위하여 기탁하거나 기탁물을 전환시키기 위함.
1. 기탁물 명칭
앞서 파스튜렐라 헤모리티카(Pasteurella haemolytica)로 공지된 조류 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi)
2. 균주 식별 표시
BIV-AVICOR
3. 부다페스트 조약하에 원기탁됨.
4. 이는 부다페스트 조약에 대한 요건을 충족시키기 위하여 이미 ATCC에 기탁된 것을 전환시키고자 하는 것이 아님.
5. 이는 미생물 또는 세포의 혼합물이 아니다.
6. 상세한 설명
부록 2 참조
7. ATCC가 기탁물의 성질을 확인하기 위한 충분한 설명
부록 2 참조
a. 기탁물은 세포 배양물이 아니다.
b. 기탁물은 하이브리도마가 아니다.
8. 본 균주는 인간, 동물, 식물에 무해하다.
9. 이용가능성.
a. 특허시까지 기탁물을 이용할 수 없다.
b. 부다페스트 조약 비가맹국에서는 이용할 수 없다.
10. ATCC는 생존능 시험을 한 후, 아벨라르도 아퀼라르(팩스 번호: 52 3 668 80 80, 전화번호: 52 3 668 8038, 전자메일: baquilar@qua.boehringer ingelgeim.com)에 통보할 것이다.
11. ATCC는 멕시코 자리스코 44940 구아다라자라 조나 인더스트리알 칼레 30 2614번에 소재하는 아벨라르도 아퀼라르(팩스 번호: 52 3 668 80 80, 전화번호: 52 3 668 8038)에게 청구할 것이다.
13. 베링거 인겔하임 베트메디카 에스.에이.데 씨.브이.를 대신하여 기탁함.
부다페스트 조약 규칙 9.1하에 지어된 기간(미생물시료의 분양에 대한 가장 최근의 요청이 접수된 후 최소한 5년간 동 미생물을 보관하여야 하며 어떠한 경우에도 수탁일로부터 최소한 30년간)동안은 기탁을 철회할 수 없고, 바이러스, 세포 배양액, 플라스미드, 배(embryo), 및 시드(seed)의 경우 상기 기간 또는 특허 존속기가동안 세포 배양물이 죽거나 파괴되는 경우, 동일 유기체 또는 세포의 살아있는 배양액으로 교체해 줄 책임이 있으며, 상기 기간동안 분양을 위한 충분량을 공급해야할 책임이 있음을 이해하고 동의한다.
2001년 5월 24일 인그. 조지 수칠 비. 서명( )
주소: 멕시코 자리스코 44940 구아다라자라 조나 인더스트리알 칼레 30 2614번
전화 번호: 52 3 668 8000, 팩스번호: 52 3 668 8080 전자메일: jsuchil@gua.boehringer-ingelheim.com
아메리카 타입 컬쳐 콜렉션
미국 버지니아주 20110-2209 마나사스 유니버시티 블러버드 1081
수탁한 미생물시료의 분양에 대한 가장 최근의 요청이 접수된 후 최소한 5년간 동 미생물을 보관하여야 하며 어떠한 경우에도 수탁일로부터 최소한 30년간은 이를 보관된다.
3. 수입자:
아메리카 타입 컬쳐 콜렉션
미국 버지니아주 20110-2209 마나사스 유니버시티 블러버드 1081
5. 수입 물질의 기재:
냉동 건조된 BIV-AVICOR로 동정된, 앞서 파스튜렐라 헤모리티카(Pasteurella haemolytica)로 공지된 조류 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi)를 포함하는 25개의 유리 바이알.
9. 수입품의 처리
부록 5 참조.
부록 2
부다페스트 조약 기탁
6번에 대한 답변.
배양 이 균주를 뇌 심장 융합 브로쓰(Difco) 또는 트립토스-브로쓰 (TB)에서 배양하였다. 장기간의 성장기는 37℃에서 인큐베이션시 약 6 내지 8시간이다. 혈액 아가중 성장 피크는 37℃에서 24시간 후 관찰되었고 용혈을 관찰할 수 있다는 것이 이 방법의 잇점이다.
동결건조 보존 6 내지 8시간 박테리아를 뇌 심장 융합 브로쓰(Difco)에서 배양하였다. 안정화제로서 1:1(v/v) 비율의 10%의 박토 스킴 밀크 멸균 용액(Difco)을 사용한다.
생존능 시험: 냉동 건조된 바이알을 취하여 1ml의 멸균 PBS 1X, pH 7.2로 재구성시킨다. 멸균 PBS, pH 7.2로 10배 희석시킨다. 100㎕의 각 희석액을 혈액 아가 플레이트상에 접종한다. 37℃에서 24시간동안 인큐베이션시킨다. 콜로니 계수 방법에 의해 생존능을 시험한다.
BIV-AVICOR
육안상의 형태
24 시간동안 양 혈액 아가에서 배양된 콜로니, 지름 범위 1.0 내지 1.5 mm,
밝은 반투명, 약간 볼록, 매끈 및 크리미, β -용혈
현미경상의 형태
그람-음성, 비-운동성, 다형 막대기형, 주로 양극성 염색을 보임.
생화학적 및 다른 시험
시험 | 반응 |
옥시다아제 | + |
카탈라아제 | + |
인돌 | - |
글루코오스 | + |
수크로오스 | + |
맥콘키 | + |
우레아제 | - |
질산염 | + |
말토오스 | + |
만니톨 | + |
아라비노오스 | - |
셀로비오스 | - |
소르비톨 | + |
크실로스 | + |
트레할로스 | + |
살리신 | - |
오르니틴 | - |
에스쿨린 | - |
β글루코시다아제 | +α |
α푸코시다아제 | - |
β갈락토시다아제 | + |
α 80%가 양성
부록 5
6번에 대한 답변(미국내 들여오기전 물질의 처리)
BIV-AVICOR 균주
1. 암탉 심장층으로부터 분리
2. 기관을 물에 담가 부드럽게 함.
3 영양 배지(Difco로부터 20ml의 BHI)내 접종
4. 37℃에서 24시간동안 인큐베이션.
5. 양 혈액 아가 플레이트상에 시드
6. β용혈성 콜로니 분리
7. 양 혈액 아가 플레이트상에 시드
8. 동정(생화학적 및 다른 시험)
9. Difco로부터의 BHI 브로쓰상에 시드
10. 6 내지 8시간동안 뇌 심장 융합 브로쓰(Difco)에서 박테리아 배양
11. 안정화제로서 1:1(v/v) 비율의 10%의 박토 스킴 밀크 멸균 용액(Difco) 첨가
12. 샘플 냉동건조
13. 생존능, 순도 및 생화학적 시험.
부다페스트 조약 기탁
아메리카 타입 컬쳐 콜렉션 ATCC
미국 버지니아주 20110-2209
마나사스 유니버시티 블러버드 1081
전화: 703-365-2700, 팩스: 703-365-2745 전자메일: sci@atcc.org
특허절차상의 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약에 대한 요건을 충족시키기 위하여 기탁하거나 기탁물을 전환시키기 위함.
1. 기탁물 명칭
앞서 파스튜렐라 헤모리티카(Pasteurella haemolytica)로 공지된 조류 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi)
2. 균주 식별 표시
BIV-4895
3. 부다페스트 조약하에 원기탁됨.
4. 이는 부다페스트 조약에 대한 요건을 충족시키기 위하여 이미 ATCC에 기탁된 것을 전환시키고자 하는 것이 아님.
5. 이는 미생물 또는 세포의 혼합물이 아니다.
6. 상세한 설명
부록 1 참조
7. ATCC가 기탁물의 성질을 확인하기 위한 충분한 설명
부록 1 참조
a. 기탁물은 세포 배양물이 아니다.
b. 기탁물은 하이브리도마가 아니다.
8. 본 균주는 인간, 동물, 식물에 무해하다.
9. 이용가능성.
a. 특허시까지 기탁물을 이용할 수 없다.
b. 부다페스트 조약 비가맹국에서는 이용할 수 없다.
10. ATCC는 생존능 시험을 한 후, 아벨라르도 아퀼라르(팩스 번호: 52 3 668 80 80, 전화번호: 52 3 668 8038, 전자메일: baquilar@qua.boehringer ingelgeim.com)에 통보할 것이다.
11. ATCC는 멕시코 자리스코 44940 구아다라자라 조나 인더스트리알 칼레 30 2614번에 소재하는 아벨라르도 아퀼라르(팩스 번호: 52 3 668 80 80, 전화번호: 52 3 668 8038)에게 청구할 것이다.
13. 베링거 인겔하임 베트메디카 에스.에이.데 씨.브이.를 대신하여 기탁함.
부다페스트 조약 규칙 9.1하에 지어된 기간(미생물시료의 분양에 대한 가장 최근의 요청이 접수된 후 최소한 5년간 동 미생물을 보관하여야 하며 어떠한 경우에도 수탁일로부터 최소한 30년간)동안은 기탁을 철회할 수 없고, 바이러스, 세포 배양액, 플라스미드, 배(embryo), 및 시드(seed)의 경우 상기 기간 또는 특허 존속기가동안 세포 배양물이 죽거나 파괴되는 경우, 동일 유기체 또는 세포의 살아있는 배양액으로 교체해 줄 책임이 있으며, 상기 기간동안 분양을 위한 충분량을 공급해야할 책임이 있음을 이해하고 동의한다.
2001년 5월 24일 인그. 조지 수칠 비. 서명( )
주소: 멕시코 자리스코 44940 구아다라자라 조나 인더스트리알 칼레 30 2614번
전화 번호: 52 3 668 8000, 팩스번호: 52 3 668 8080 전자메일: jsuchil@gua.boehringer-ingelheim.com
아메리카 타입 컬쳐 콜렉션
미국 버지니아주 20110-2209 마나사스 유니버시티 블러버드 1081
수탁한 미생물시료의 분양에 대한 가장 최근의 요청이 접수된 후 최소한 5년간 동 미생물을 보관하여야 하며 어떠한 경우에도 수탁일로부터 최소한 30년간은 이를 보관된다.
3. 수입자:
아메리카 타입 컬쳐 콜렉션
미국 버지니아주 20110-2209
마나사스 유니버시티 블러버드 1081
5. 수입 물질의 기재:
냉동 건조된 BIV-4895으로 동정된, 앞서 파스튜렐라 헤모리티카(Pasteurella haemolytica)로 공지된 조류 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi)를 포함하는 25개의 유리 바이알.
9. 수입품의 처리
부록 4 참조.
부록 1
부다페스트 조약 기탁
6번에 대한 답변.
배양 이 균주를 뇌 심장 융합 브로쓰(Difco) 또는 트립토스-브로쓰 (TB)에서 배양하였다. 장기간의 성장기는 37℃에서 인큐베이션시 약 6 내지 8시간이다. 혈액 아가중 성장 피크는 37℃에서 24시간 후 관찰되었고 용혈을 관찰할 수 있다는 것이 이 방법의 잇점이다.
동결건조 보존 6 내지 8시간 박테리아를 뇌 심장 융합 브로쓰(Difco)에서 배양하였다. 안정화제로서 1:1(v/v) 비율의 10%의 박토 스킴 밀크 멸균 용액(Difco)을 사용한다.
생존능 시험: 냉동 건조된 바이알을 취하여 1ml의 멸균 PBS 1X, pH 7.2로 재구성시킨다. 멸균 PBS, pH 7.2로 10배 희석시킨다. 100㎕의 각 희석액을 혈액 아가 플레이트상에 접종한다. 37℃에서 24시간동안 인큐베이션시킨다. 콜로니 계수 방법에 의해 생존능을 시험한다.
7번에 대한 답변
BIV-4895
육안상의 형태
24 시간동안 양 혈액 아가에서 배양된 콜로니, 지름 범위 1.0 내지 1.5 mm,
밝은 반투명, 약간 볼록, 미립자 및 건성, β -용혈
현미경상의 형태
그람-음성, 비-운동성, 다형 막대기형, 주로 양극성 염색을 보임.
생화학적 및 다른 시험
시험 | 반응 |
옥시다아제 | + |
카탈라아제 | + |
인돌 | - |
글루코오스 | + |
수크로오스 | + |
맥콘키 | + |
우레아제 | - |
질산염 | + |
말토오스 | - |
만니톨 | + |
아라비노오스 | - |
셀로비오스 | - |
소르비톨 | + |
크실로스 | + |
트레할로스 | + |
살리신 | - |
오르니틴 | - |
에스쿨린 | - |
β글루코시다아제 | - |
α푸코시다아제 | - |
β갈락토시다아제 | + |
부록 4
6번에 대한 답변(미국내 들여오기전 물질의 처리)
BIV-4895 균주
1. 암탉 구개열층으로부터 분리
2. 기관을 물에 담가 부드럽게 함.
3 영양 배지(Difco로부터 20ml의 BHI)내 접종
4. 37℃에서 24시간동안 인큐베이션.
5. 양 혈액 아가 플레이트상에 시드
6. β용혈성 콜로니 분리
7. 양 혈액 아가 플레이트상에 시드
8. 동정(생화학적 및 다른 시험)
9. Difco로부터의 BHI 브로쓰상에 시드
10. 6 내지 8시간동안 뇌 심장 융합 브로쓰(Difco)에서 박테리아 배양
11. 안정화제로서 1:1(v/v) 비율의 10%의 박토 스킴 밀크 멸균 용액(Difco) 첨가
12. 샘플 냉동건조
13. 생존능, 순도 및 생화학적 시험.
Claims (30)
- 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 조류의 상부 기도 및 생식관의 새로운 질병을 유발하는 그람-음성, 통성 혐기성, 다형 막대형 박테리아.
- 파스튜렐라(Pasteurella) 및/또는 만헤이미아(Mannheimia)가 베타 용혈-양성, 그람 염색-음성, 옥시다아제-양성, 카탈라아제-양성, 우레아제-음성, 질산염-양성 및 인돌-음성인 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica).
- 제 2항에 있어서, 파스튜렐라(Pasteurella) 및/또는 만헤이미아(Mannheimia)가 맥콘키(MacConkey) 양성인 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica).
- 제 2항 또는 제 3항중 어느 한 항에 있어서, 파스튜렐라(Pasteurella) 및/또는 만헤이미아(Mannheimia)가 글루코오스-양성, 수크로오스-양성, 만니톨-양성, 아라비노오스-음성, 셀로비오스-음성, 크실로오스-양성, 살리신-음성, 오르니틴-음성, 에스쿨린-음성, 알파-푸코시다아제-음성, 베타-갈락토시다아제-양성인 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica).
- 제 2항 내지 제 4항중 어느 한 항에 있어서, 파스튜렐라(Pasteurella)가 아라비노오스-음성 및 트레할로스-양성인 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi).
- 제 2항 내지 제 4항중 어느 한 항에 있어서, 만헤이미아(Mannheimia)가 아라비노오스-음성 및 트레할로스-음성인 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica).
- 제 2항 내지 제 6항중 어느 한 항에 있어서,조류가 닭, 칠면조, 오리, 거위, 산비둘기(dove), 집비둘기(pigeon) 및 메추라기로 구성된 그룹으로부터 선택되는, 본 발명에 따른 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica).
- 수탁 번호 ATCC No. PTA-3667 하에 기탁된 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi).
- 수탁 번호 ATCC No. PTA-3668 하에 기탁된 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi).
- 수탁 번호 ATCC No. PTA-3669 하에 기탁된 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica).
- 최종 농도 0.2%의 포름알데히드를 사용하는 것을 포함하는 제 1항 내지 제 10항중 어느 한 항의 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica)를 불활성화시키는 방법
- 제 11항의 방법 또는 본 분야에 공지된 방법에 따라 수득할 수 있는 불활성화된 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica).
- 제 12항에 있어서, 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica)가 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) ATCC No. PTA-3667, 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) ATCC No. PTA-3668 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica) ATCC No. PTA-3669로 구성된 그룹으로부터 선택되는 불활성화된 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica).
- 제 1항 내지 제 10항중 어느 한 항의 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica)가 약독화된 생(live) 약독화된 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica).
- 제 14항에 있어서, 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica)가 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) ATCC No. PTA-3667, 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) ATCC No. PTA-3668 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica) ATCC No. PTA-3669로 구성된 그룹으로부터 선택되는 생 약독화된 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica).
- 제 1항 내지 제 10항중 어느 한 항의 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica)의 적어도 하나의 항원을 포함하는 단편 또는 분획.
- 제 17항에 있어서, 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) ATCC No. PTA-3667, 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) ATCC No. PTA-3668 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica) ATCC No. PTA-3669로 구성된 그룹으로부터 선택되는 박테리아의 적어도 하나의 항원을 포함하는 단편 또는 분획.
- 제 12항 또는 제 13항의 불활성화된 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica) 및/또는 제 1항 내지 제 10항중 어느 한 항의 생 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica) 및/또는 제 14항 또는 제 15항의 생 약독화된 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica) 및/또는 제 16항 내지 제 17항의 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica)의 단편 또는 분획을 포함하는 백신 조성물.
- 제 18항에 있어서, 추가로 하나 이상의 적절한 어쥬번트(들) 및/또는 부형제(들) 및/또는 담체(들)을 포함하는 백신 조성물.
- 제 18항 또는 제 19항에 있어서, 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica)가 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) ATCC No. PTA-3667, 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) ATCC No. PTA-3668 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica) ATCC No. PTA-3669로 구성된 그룹으로부터 선택되는 불활성화 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica)를 포함하는 백신 조성물.
- 제 18항 내지 제 20항중 어느 한 항에 있어서, 제 1항 내지 제 10항 및 제 12항 내지 제 15항의 생, 및/또는 생 약독화된, 및/또는 불활성화된 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica) 및/또는 제 16항 또는 제 17항의 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica)의 2개 이상의 균주의 분획을 포함하는 백신 조성물.
- 제 18항 내지 제 21항중 어느 한 항에 있어서, 백신중 본 발명에 따른 생, 및/또는 생 약독화된, 및/또는 불활성화된 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica) 및/또는 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica)의 분획은 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) ATCC No. PTA-3667, 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) ATCC No. PTA-3668 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica) ATCC No. PTA-3669로 구성된 그룹으로부터 선택되는 백신 조성물.
- 제 18항 내지 제 22항중 어느 한 항에 있어서, 조류에 대하여 병원성인 바이러스 또는 미생물로부터의 적어도 하나의 다른 항원을 추가로 포함하는 백신 조성물.
- 제 18항 내지 제 23항중 어느 한 항에 있어서, 바이러스 또는 미생물이 감염성 기관지염 바이러스, 뉴캣슬 질병 바이러스, 감염성 점액낭 질병 바이러스, 닭 빈혈 인자, 조류 레오바이러스, 미코플라즈마 갈리셉티쿰(Mycoplasma gallisepticum), 조류-뉴모바이러스, 헤모필루스 파라갈리나룸(Haemophilus paragallinarum), 닭 폭스바이러스, 조류 뇌척수염 바이러스, 파스튜렐라 물토시다(Pasteurella Multocida) 및 E. Coli로부터 구성된 그룹으로부터 선택되는 백신 조성물.
- 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica) 감염 예방용 백신의 제조에서 제 12항 또는 제 13항의 불활성화된 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica) 및/또는 제 1항 내지 제 10항중 어느 한 항의 생 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica) 및/또는 제 14항 또는 제 15항의 생 약독화된 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica) 및/또는 제 16항 내지 제 17항의 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica)의 단편 또는 분획의 용도.
- 면역학적 유효량의 제 18항 내지 제 24항중 어느 한 항의 백신을 투여하고 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica) 감염에 의해 유발된 증상이 감소되었음을 모니터하는 것을 포함하는, 제 1항 내지 제 10항중 어느 한 항의 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica)에 의해 유발된 호흡 및 생식관의 질병에 대하여 조류를 면역화시키는 방법.
- 혈액, 혈청, 혈장, 조직 찰과표본(scraping), 세액, 면봉(swab), 조직으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 샘플을 조류로부터 수득하고 샘플을 제 1항 내지 제 10항중 어느 한 항의 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica)의 존재에 대하여 분석하는 단계를 포함하는, 유발된 질병을 진단하는 방법.
- 제 27항에 있어서, 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica)의 존재를 면역 시험에 의해 측정하는 진단 방법.
- 제 27항에 있어서, 파스튜렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi) 및/또는 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia haemolytica)를 분자 생물학적 방법에 의해 측정하는 진단 방법.
- 제 27항 내지 제 29항중 어느 한 항의 방법을 수행하기 위한 모든 필수 성분을 포함하는 진단용 시험 키트.
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