DE60226057T2 - Geflügelkrankheit verursachendes bakterium und daraus stammender impfstoff - Google Patents

Geflügelkrankheit verursachendes bakterium und daraus stammender impfstoff Download PDF

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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die Erfindung betrifft das Gebiet der Tiergesundheit und insbesondere die Erreger einer neuen bakteriellen Geflügelkrankheit, nämlich Pasteurella trehalosi und/oder Mannheimia haemolytica. Die Erfindung stellt diese Pasteurella trehalosi und/oder Mannheimia haemolytica-Bakterien, einen Impfstoff, der inaktiviertes Pasteurella trehalosi und/oder Mannheimia haemolytica umfasst, und ein Verfahren zum Immunisieren von Hühnern zur Verhinderung dieser Krankheit bei Hühnern bereit.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Während der letzten 10 Jahre haben intensive Verfahren zur Bewirtschaftung von Geflügelfarmen mit dem Ziel der Erhöhung der Produktivität in sämtlichen wichtigen geflügelerzeugenden Ländern zu einem Anstieg von Krankheitsausbrüchen geführt. Somit besteht ein zunehmendes Bedürfnis nach neuen und besseren Impfstoffen und Impfstoffprogrammen, um diese Krankheiten zu bekämpfen. Heutzutage werden die meisten Tiere gegen eine Anzahl von Krankheiten viralen und bakteriellen Ursprungs immunisiert. Zu Beispielen für virale Krankheiten bei Geflügel gehören die Newcastle-Krankheit, infektiöse Bronchitis, Vogel-Pneumovirus, Geflügelpocken, infektiöse Schleimbeutelkrankheit und dergl.
  • Zu Beispielen für bakterielle Krankheiten gehören Vogel-Coryza, die durch Haemophilus paragallinarum (oberer Atmungstrakt), Bordetella avium (unterer Atmungstrakt), Ornithobacterium rhinotracheale (unterer Atmungstrakt), Salmonella-Infektionen (Verdauungstrakt), Pasteurella multocida, Erreger von Geflügelcholera (septikämisch) und E. coli-Infektionen verursacht werden.
  • Somit besteht das der Erfindung zugrundeliegende technische Problem darin, eine neue bakterielle Geflügelkrankheit zu identifizieren, den Erreger dieser Krankheit bereitzustellen und einen Impfstoff zur Bekämpfung dieser Krankheit bereitzustellen.
  • Figurenbeschreibung
  • A. Von Krankheitsausbrüchen unter Feldbedingungen
  • 1) Broiler: Nasale Ausscheidung und geschwollene Bereiche rund um die Augen.
  • 2) Broiler: Hämorrhagie in Herz und Koronarfett.
  • 3) Broiler: Konjunktivitis und Entzündungen rund um die Augen.
  • 4) Legehennen: Nasale Ausscheidungen und verschobener Kamm mit Cyanose.
  • 5) Legehennen: Entzündung und Hämorrhagie rund um die Augen.
  • 6) Legehennen: Hämorrhagie in dermalem Gewebe hinter dem Eingang zu den Gehörgängen.
  • 7) Legehennen: Entzündung der Nieren.
  • 8) Legehennen: Hämorrhagien im Eileiter.
  • 9) Legehennen: Deformierte Ovarialfollikel.
  • 10) Legehennen: Hämorrhagie in der Verbindung zwischen Proventriculus und Muskelmagen.
  • 11) Legehennen: Blutstau und Hämorrhagie im Eileiter.
  • B. Experimentelle Infektion
  • 12) Legehennen: Entzündung und Hämorrhagie in den Nieren.
  • 13) SPF: Prostration.
  • 14) Legehennen: Hämorrhagie in Gelenken und Muskeln.
  • 15) Legehennen: Nasale Ausscheidung und blasser Kamm.
  • 16) Legehennen: Hämorrhagie im Muskel.
  • 17) SPF: Hämorrhagie in Herz und Koronarfett.
  • 18) Legehennen: Gesunde Vögel auf der linken Seite und kranke Vögel auf der rechten Seite mit zerzausten Federn.
  • 19) Legehennen: Grünliche Diarrhö
  • 20) SPF: Hämorrhagie in Muskeln
  • 21) SPF: Prostration (lokomotorische Probleme) und grünliche Diarrhö
  • 22) Legehennen: Vergrößerte Leber mit Hämorrhagie
  • Offenbarung der Erfindung
  • Definitionen von in der Beschreibung verwendeten Ausdrücken
  • Vor Beschreibung der erfindungsgemäßen Ausführungsformen ist darauf hinzuweisen, dass die hier und in den beigefügten Ansprüchen verwendeten Singularformen der unbestimmten und bestimmen Artikel auch den entsprechenden Plural einschließen, sofern der Textzusammenhang nicht deutlich etwas anderes angibt. Beispielsweise umfasst die Bezugnahme auf "ein Pasteurella trehalosi" auch eine Mehrzahl von derartigen Pasteurella trehalosi-Bakterien, eine Bezugnahme auf die "Zelle" bezieht sich auf eine oder mehrere Zellen und Äquivalente davon, die dem Fachmann geläufig sind, und dergl. Die Groß- und Kleinschreibung von Produkten ist irrelevant; (im englischen Text) haben sowohl "Arabinose" als auch "arabinose" die gleiche Bedeutung, sofern nichts anderes angegeben ist. Weiterhin haben, sofern nichts anderes angegeben ist, sämtliche technischen und wissenschaftlichen Ausdrücke, die hier verwendet werden, die gleichen Bedeutungen, wie sie der Fachmann auf dem einschlägigen Gebiet üblicherweise versteht. Obgleich beliebige Verfahren und Materialien, die ähnlich oder gleichwertig mit den hier beschriebenen Verfahren und Materialien sind, bei der praktischen Ausübung oder beim Testen der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können, werden nachstehend bevorzugte Verfahren, Vorrichtungen und Materialien beschrieben. Sämtliche hier erwähnten Publikationen werden durch Verweis zum Gegenstand der Beschreibung gemacht, um die in diesen Publikationen, die in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung heranzuziehen sind, beschriebenen Zelllinien, Vektoren und Verfahren zu beschreiben. Durch keine der hier gemachten Ausführungen soll eingeräumt werden, dass die Erfindung durch eine frühere Erfindung, vorweggenommen wird.
  • Überraschenderweise haben die Erfinder eine neue bakterielle Geflügelkrankheit beobachtet, die vorwiegend bei Legehennen und weniger häufig bei Broilern auftritt. Die Krankheit wurde bei Hühnern festgestellt, die gegen das Bacterium Haemophilus paragallinarum (Erreger von Vogel-Coryza) und Pasteurella multocida (Erreger von Vogelcholera) geimpft worden waren. Die Symptome dieser neuen Krankheit unterscheiden sich von den speziellen Symptomen von Coryza. Aufgrund der Tatsache, dass die neu entdeckte Krankheit klar die klinischen Anzeichen einer Infektion des oberen Atmungstrakts zeigt, wie nachstehend ausgeführt wird, kann H. paragallinarum als Erreger ausgeschlossen werden.
  • Die Erfindung betrifft in einer ersten Ausführungsform gram-negative, fakultativ anaerobe, pleomorphe, stabförmige Bakterien, die eine neue Krankheit des oberen Atmungstrakts und des reproduktiven Trakts von Geflügel hervorrufen, wobei die Bakterien aus der Gruppe von Pasteurella trehalosi und/oder Mannheimia haemolytica ausgewählt sind.
  • Diese erfindungsgemäßen Bakterien können aus infizierten Luftröhren, Gaumenspalten, Ovarien, Leber, Herz, Nieren und Gonaden (Broiler) isoliert werden. Sie können als Pasteurella trehalosi und/oder Mannheimia haemolytica gemäß der Erfindung auf der Grundlage der nachstehend aufgeführten Tests identifiziert werden:
    β-Hämolyse +
    gram-Färbung –
    Oxidase +
    Katalase +
    Urease –
    Nitrat +
    Indol –
  • Die bakteriellen Isolate können gemäß dem Verfahren von Jaworski et al. (1) gereinigt und biotypisiert werden. Dieses Verfahren wird auch in den Beispielen beschrieben. Wichtige Verfahren zur Klassifizierung von Bakterien sind die DNA-DNA-Hybridisierung, REA (Restriktionsenzym-Analyse; vergl. z. B. J. Clinical Microbiol., Bd. 31 (1993), S. 831–835) und die Ribotypisierung. Diese Verfahren können vom Fachmann für die Feststellung eingesetzt werden, ob Bakterien unter den Umfang der vorliegenden Erfindung fallen. In den Beispielen wird auch ein Belastungsmodell zur Validierung der Koch-Postulate beschrieben.
  • Somit besteht eine wichtige Ausführungsform der vorliegenden Erfindung in Pasteurella trehalosi und/oder Mannheimia haemolytica, wobei Pasteurella und/oder Mannheimia beta(β)-Hämolyse-positiv, gram-negativ, Oxidase-positiv, Katalase-positiv, Urease-negativ, Nitrat-positiv und Indol-negativ sind. Vorzugsweise sind Pasteurella trehalosi und/oder Mannheimia haemolytica gemäß der Erfindung auch MacConkey-positiv. Besonders bevorzugt ist, dass Pasteurella trehalosi und/oder Mannheimia haemolytica gemäß der Erfindung zusätzlich Glucose-positiv, Saccharose-positiv, Mannit-positiv, Arabinose-negativ, Cellobiose-negativ, Xylose-positiv, Salicin-negativ, Ornithin-negativ, Esculin-negativ, alpha-Fucosidase-negativ und beta-Galactosidase-positiv sind. Besonders bevorzugt ist erfindungsgemäßes Pasteurella trehalosi, wobei das Pasteurella auch Arabinose-negativ und Trehalose-positiv ist. Bevorzugt wird ferner erfindungsgemäßes Pasteurella trehalosi, das je nach dem Biotyp ferner beta(β)-Glucosidase-negativ oder -positiv ist. Insbesondere bevorzugt wird Mannheimia haemolytica gemäß der Erfindung, wobei das Mannheimia ferner Arabinose-negativ und Trehalose-negativ ist. Vorzugsweise sind ferner Mannheimia haemolytica gemäß der Erfindung auch β-Glucosidase-negativ.
  • Aufgrund dieser charakteristischen Eigenschaften der erfindungsgemäßen Bakterien sind diese erfindungsgemäßen Bakterien gegenüber anderen bekannten bakteriellen Geflügelpathogenen neu (Diseases of Poultry, Tenth Edition, Herausgeber B. W. Calnek, Iowa State University Press, Iowa, USA, 1997).
  • Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besteht in Pasteurella trehalosi und/oder Mannheimia haemolytica gemäß der Erfindung, wobei das Geflügel aus der Gruppe Hühner, Truthahngeflügel, Enten, Gänse, Tauben und Wachteln ausgewählt ist.
  • Erfindungsgemäß wird ein neuer Typ von gram-negativen, fakultativ anaeroben, pleomorphen, stabförmigen Bakterien bereitgestellt, wobei dieser neue Typ von Bakterien durch die bei der American Type Culture Collection (ATCC), 1081, University Boulevard, Manassas, VA 20110–2209, USA unter den folgenden Hinterlegungsnummern hinterlegten Bakterien charakterisiert ist:
    • – Pasteurella trehalosi ATCC Nr. PTA-3667 (interne Bezeichnung BIV-4985);
    • – Pasteurella trehalosi ATCC Nr. PTA-3668 (interne Bezeichnung BIV-AVICOR);
    • – Mannheimia haemolytica ATCC Nr. PTA-3669 (interne Bezeichnung BIV-07990).
  • Hinterlegungstag ist der 22. August 2001.
  • Somit handelt es sich bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung um Pasteurella trehalosi, das unter der Hinterlegungsnummer ATCC Nr. PTA-3667 hinterlegt worden ist. Diese Bakterien werden ferner in Tabelle 3 von Beispiel 1 erläutert.
  • Eine weitere besonders bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist Pasteurella trehalosi, das unter der Hinterlegungsnummer ATCC Nr. PTA-3668 hinterlegt worden ist. Diese Bakterien werden ferner in Tabelle 2 von Beispiel 1 beschrieben.
  • Bei einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich um Mannheimia haemolytica, das unter der Hinterlegungsnummer ATCC Nr. PTA-3669 hinterlegt worden ist. Diese Bakterien werden ferner in Tabelle 1 von Beispiel 1 erläutert.
  • Die Ergebnisse von Tests der Abschnitte A und B in den Beispielen (Tabelle 1, 2 und 3) bestätigen, dass die Bakterien BIV-4895; ATCC Nr. PTA-3667 und BIV-AVICOR; ATCC Nr. PTA-3668, zur Familie Pasteurellaceae (Pasteurella trehalosi, die Trehalose-positiv und Arabinose-negativ sind) gehören, während das Bakterium BIV-07990; ATCC Nr. PTA-3669 zur Familie Mannheimia (Mannheimia haemolytica, das Trehalose-negativ und Arabinose-negativ ist) gehört.
  • Die Erfindung betrifft ferner eine mikrobiologische Kultur, die erfindungsgemäße Bakterien gemäß den vorstehenden Ausführungen umfasst. Die Kultur kann hergestellt werden, indem man die Bakterien bei einer Temperatur von 35 bis 37°C züchtet. Die Bakterien können unter normalem, atmosphärischem Sauerstoffdruck gezüchtet werden. Die Bakterien können in einer Vielzahl unterschiedlicher, das Bakterienwachstum fördernder Medien für allgemeine Zwecke, die dem Fachmann geläufig sind, gezüchtet werden, z. B. Tryptose-Brühe (TB), Soja-Trypticasein-Brühe oder Hirn-Herz-Infusionsbrühe oder beliebige angereicherte Medien. Die Bakterien können auch auf Schafblut-Agar, das 24 Stunden bei 37°C inkubiert worden ist, gezüchtet werden.
  • Es sind verschiedene physikalische und chemische Verfahren der bakteriellen Inaktivierung bekannt. Zu Beispielen für eine physikalische Inaktivierung gehören die UV-Bestrahlung, die Röntgenbestrahlung, die gamma-Bestrahlung und das Erhitzen. Zu Beispielen für inaktivierende Chemikalien gehören beta-Propiolacton, Glutaraldehyd, beta-Ethylenimin und Formaldehyd.
  • Vorzugsweise werden die erfindungsgemäßen Bakterien mit Formaldehyd inaktiviert. Überraschenderweise stellt die Verwendung von Formaldehyd in einer Endkonzentration von 0,2% ein hervorragendes Verfahren zur Inaktivierung der erfindungsgemäßen Bakterien dar.
  • Somit betrifft die vorliegende Erfindung gemäß einem weiteren wichtigen Aspekt ein Verfahren zur Inaktivierung von erfindungsgemäßen Pasteurella trehalosi und/oder Mannheimia haemolytica, wobei das Verfahren die Verwendung von Formaldehyd in einer Endkonzentration von 0,2% umfasst.
  • Die erfindungsgemäßen Bakterien, die gemäß den vorerwähnten Verfahren und durch andere Verfahren zum Inaktivieren von Bakterien, die dem Fachmann geläufig sind, inaktiviert worden sind, stellen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung dar. Somit betrifft ein weiterer wichtiger Aspekt der Erfindung inaktiviertes Pasteurella trehalosi und/oder Mannheimia haemolytica, die durch ein erfindungsgemäßes Verfahren oder durch ein dem Fachmann bekanntes Verfahren erhältlich sind. Vorzugsweise werden inaktiviertes Pasteurella trehalosi und/oder Mannheimia haemolytica gemäß der Erfindung aus der Gruppe Pasteurella trehalosi ATCC Nr. PTA-3667, Pasteurella trehalosi ATCC Nr. PTA-3668 und/oder Mannheimia haemolytica ATCC Nr. PTA-3669 ausgewählt.
  • Somit besteht ein weiterer wichtiger Aspekt der Erfindung in lebendem, abgeschwächtem Pasteurella trehalosi und/oder Mannheimia haemolytica, die durch ein bekanntes Verfahren erhältlich sind. Vorzugsweise werden das lebende, abgeschwächte Pasteurella trehalosi und/oder Mannheimia haemolytica gemäß der Erfindung aus der Gruppe Pasteurella trehalosi ATCC Nr. PTA-3667, Pasteurella trehalosi ATCC Nr. PTA-3668 und/oder Mannheimia haemolytica ATCC Nr. PTA-3669 ausgewählt. Dieses Pasteurella trehalosi und/oder Mannheimia haemolytica gemäß der Erfindung werden durch mehrfache Passagen in geeigneten Kulturmedien oder durch beliebige andere bekannte Verfahren abgeschwächt.
  • Der hier verwendete Ausdruck "inaktiviert" bedeutet, dass das erfindungsgemäße Pasteurella trehalosi und/oder Mannheimia haemolytica abgetötet worden ist, ohne dass eine Replikationsmöglichkeit zur Verursachung einer klinischen Krankheit besteht.
  • Der hier verwendete Ausdruck "abgeschwächt" bedeutet, dass das erfindungsgemäße Pasteurella trehalosi und/oder Mannheimia haemolytica ein lebendes Bakterium mit Replikationsmöglichkeit darstellt, das aber keine klinische Krankheit verursacht.
  • Einen weiteren wichtigen Aspekt stellen Fraktionen oder Fragmente von Pasteurella trehalosi und/oder Mannheimia haemolytica dar, die durch bekannte Verfahren erhältlich sind. Diese Fragmente können durch Detergens-Solubilisierung von Pasteurella trehalosi und/oder Mannheimia haemolytica gemäß der Erfindung oder durch ein anderes bekanntes Verfahren erhalten werden. Vorzugsweise handelt es sich bei diesen Fraktionen oder Fragmenten um gereinigte Antigene von Pasteurella trehalosi und/oder Mannheimia haemolytica gemäß der Erfindung. Vorzugsweise handelt es sich bei diesen Fraktionen/Fragmenten um äußere Membranproteine von Pasteurella trehalosi und/oder Mannheimia haemolytica gemäß der Erfindung.
  • Der Ausdruck "Fragment" bedeutet erfindungsgemäß eine beliebige immunogene Untereinheit des erfindungsgemäßen Pasteurella trehalosi und/oder Mannheimia haemolytica, d. h. eine beliebige Polypeptid-Untergruppe.
  • Somit betrifft die Erfindung Fragmente oder Fraktionen, die mindestens ein Antigen von erfindungsgemäßem Pasteurella trehalosi und/oder Mannheimia haemolytica enthalten. Insbesondere enthalten diese Fragmente mindestens ein Antigen von Bakterien, die aus der Gruppe Pasteurella trehalosi ATCC Nr. PTA-3667, Pasteurella trehalosi ATCC Nr. PTA-3668 und/oder Mannheimia haemolytica ATCC Nr. PTA-3669 ausgewählt sind. Diese Fragmente können vollständige Bakterienzellen von einem oder mehreren Stämmen, bakterielle Extrakte, äußere Membranfraktionen, bakterielle Exo- und/oder Endotoxine und gereinigte Proteine umfassen. Antigene Polypeptide oder Fragmente davon können beispielsweise aus gereinigten bakteriellen Proteinen oder durch Expression des entsprechenden genetischen Materials in einem prokaryontischen oder eukaryontischen Expressionssystem oder durch organisch-chemische Synthese erhalten werden. Diese Verfahren sind dem Fachmann geläufig.
  • Die Erfindung betrifft ferner lebende und/oder lebende, abgeschwächte und/oder inaktivierte Pasteurella trehalosi- und/oder Mannheimia haemolytica-Bakterien gemäß der Erfindung und/oder Fraktionen dieser Pasteurella trehalosi und/oder Mannheimia haemolytica zur Verwendung in einem Impfstoff.
  • Erfindungsgemäß wird ferner ein Impfstoff, der sich von den vorstehend definierten, neu identifizierten Bakterien ableitet, bereitgestellt. Somit betrifft die Erfindung ferner eine Impfstoffzusammensetzung, die lebendes und/oder lebendes, abgeschwächtes und/oder inaktiviertes Pasteurella trehalosi und/oder Mannheimia haemolytica gemäß der Erfindung und/oder Fraktionen dieses Pasteurella trehalosi und/oder Mannheimia haemolytica umfasst.
  • Der hier verwendete Ausdruck "Impfstoff" ist als ein Impfstoff für die veterinärmedizinische Verwendung zu verstehen, der antigene Substanzen umfasst und mit dem Ziel verabreicht wird, eine spezifische und aktive oder passive Immunität gegen eine Krankheit, die durch Pasteurella trehalosi und/oder Mannheimia haemolytica hervorgerufen wird, zu induzieren. Das lebende oder lebende, abgeschwächte Pasteurella trehalosi und/oder Mannheimia haemolytica gemäß der Erfindung verleihen eine aktive Immunität, die passiv über mütterliche Antikörper gegen die enthaltenen Immunogene und gelegentlich auch gegen antigenmäßig verwandte Organismen übertragen werden kann. Das erfindungsgemäße inaktivierte Pasteurella trehalosi und/oder Mannheimia haemolytica und/oder Fraktionen des Pasteurella trehalosi und/oder Mannheimia haemolytica verleihen passive Immunität.
  • Zusätzliche Komponenten zur Verstärkung der Immunreaktion sind Bestandteile, die üblicherweise als Adjuvantien bezeichnet werden, wie Aluminiumhydroxid, Mineralöle und andere Öle oder Hilfsmoleküle, die dem Impfstoff zugesetzt werden oder die nach der entsprechenden Induktion durch derartige zusätzliche Bestandteile vom Körper erzeugt werden, wie (ohne Beschränkung hierauf) Interferone, Interleukine oder Wachstumsfaktoren.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Impfstoff inaktivierte Bakterien.
  • Vorzugsweise bezieht sich ein erfindungsgemäßer Impfstoff auf einen Impfstoff gemäß der vorstehenden Definition, wobei es sich bei einer immunologisch aktiven Komponente um lebendes Pasteurella trehalosi und/oder Mannheimia haemolytica handelt. Der Ausdruck "Lebendimpfstoff" bezieht sich auf einen Impfstoff, der ein Teilchen umfasst, das zur Teilung/Vermehrung befähigt ist.
  • Vorzugsweise umfasst ein erfindungsgemäßer Impfstoff attenuiertes Pasteurella trehalosi und/oder Mannheimia haemolytica gemäß der Erfindung und einen pharmazeutisch verträglichen Träge oder Exzipiens. Dieser Impfstoff kann auch als ein Kombinationsimpfstoff verabreicht werden, der zwei oder mehr Stämme dieser lebenden und/oder lebenden abgeschwächten und/oder inaktivierten Pasteurella trehalosi- und/oder Mannheimia haemolytica-Bakterien gemäß der Erfindung und/oder Fraktionen von zwei oder mehr Stämmen dieser Pasteurella trehalosi- und/oder Mannheimia haemolytica-Bakterien umfasst. Insbesondere werden lebendes und/oder lebendes, abgeschwächtes und/oder inaktiviertes Pasteurella trehalosi und/oder Mannheimia haemolytica gemäß der Erfindung und/oder Fraktionen dieses Pasteurella trehalosi und/oder Mannheimia haemolytica im Impfstoff aus der Gruppe Pasteurella trehalosi ATCC Nr. PTA-3667, Pasteurella trehalosi ATCC Nr. PTA-3668 und/oder Mannheimia haemolytica ATCC Nr. PTA-3669 ausgewählt.
  • Vorzugsweise umfasst ferner ein erfindungsgemäßer Impfstoff inaktiviertes Pasteurella trehalosi und/oder Mannheimia haemolytica gemäß der Erfindung und einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder Exzipiens. Dieser Impfstoff kann auch als ein Kombinationsimpfstoff verabreicht werden, der zwei oder mehr Stämme von inaktiviertem Pasteurella trehalosi und/oder Mannheimia haemolytica umfasst.
  • Ferner können Fraktionen von vollständigen Zellen ebenfalls als einschlägiges Immunogen im erfindungsgemäßen Impfstoff verwendet werden. Daher umfasst vorzugsweise ein erfindungsgemäßer Impfstoff Fraktionen von Pasteurella trehalosi und/oder Mannheimia haemolytica gemäß der Erfindung und einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder Exzipiens. Dieser Impfstoff kann als ein Kombinationsimpfstoff verabreicht werden, der zwei oder mehr Stämme des inaktivierten Pasteurella trehalosi und/oder Mannheimia haemolytica umfasst.
  • Insbesondere betrifft die Erfindung Impfstoffe, die Fragmente oder Fraktionen umfassen, die mindestens ein Antigen von erfindungsgemäßen Pasteurella trehalosi und/oder Mannheimia haemolytica enthalten. Ganz besonders betrifft die Erfindung Impfstoffe, die Fragmente umfassen, die mindestens ein Antigen von Bakterien enthalten, die aus der Gruppe Pasteurella trehalosi ATCC Nr. PTA-3667, Pasteurella trehalosi ATCC Nr. PTA-3668 und/oder Mannheimia haemolytica ATCC Nr. PTA-3669 ausgewählt sind. Dieses Fragment kann vollständige bakterielle Zellen, bakterielle Extrakte, äußere Membranfraktionen, bakterille Exo- oder Endotoxine und gereinigte Proteine umfassen. Antigene Polypeptide oder Fragmente davon können beispielsweise aus gereinigten bakteriellen Proteinen oder durch Expression des entsprechenden genetischen Materials in prokaryontischen oder eukaryontischen Expressionssystemen oder durch organisch-chemische Synthese erhalten werden. Diese Verfahren sind dem Fachmann geläufig.
  • Vorzugsweise umfasst der erfindungsgemäße Impfstoff auch ein Adjuvans. Daher betrifft die Erfindung ferner eine Impfstoffzusammensetzung gemäß der Erfindung, die ferner ein oder mehr geeignete Adjuvantien und/oder Exzipientien und/oder Träger enthält.
  • Die hier verwendeten Adjuvantien umfassen Substanzen, die die Immunreaktion des der Injektion unterzogenen Tiers auffrischen. Eine Anzahl verschiedener Adjunvantien ist aus dem Stand der Technik bekannt. Die hier verwendeten Adjuvantien umfassen komplettes und inkomplettes Adjuvans gemäß Freund, Vitamin E, nicht-ionische Blockcopolymere, Muramyldipeptide, Quil A, mineralische und nicht-mineralische Öle, pflanzliche Öle und Carbopol (ein Homopolymeres). Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der erfindungsgemäße Impfstoff ein Wasser-in-Öl-Emulsions-Adjuvans. Ein derartiger Impfstoff wird auch als Bakterin bezeichnet, das inaktivierte (abgetötete) Bakterien gemäß der Erfindung und ein Wasser-in-Öl-Emulsions-Adjuvans umfasst. Weitere Wege zur Unterstützung der Bakterien, die dem Fachmann geläufig sind, sind ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
  • Ferner kann der erfindungsgemäße Impfstoff vorzugsweise ein oder mehr geeignete Emulgatoren, z. B. Span oder Tween, enthalten.
  • Vorzugsweise werden das lebende und/oder lebende, abgeschwächte und/oder inaktivierte Pasteurella trehalosi und/oder Mannheimia haemolytica gemäß der Erfindung und/oder Fraktionen des Pasteurella trehalosi und/oder Mannheimia haemolytica im Impfstoff aus der Gruppe Pasteurella trehalosi ATCC Nr. PTA-3667, Pasteurella trehalosi ATCC Nr. PTA-3668 und/oder Mannheimia haemolytica ATCC Nr. PTA-3669 ausgewählt.
  • Vorzugsweise umfasst der erfindungsgemäße Impfstoff mindestens ein Antigen aus Bakterien, die aus der Gruppe Pasteurella trehalosi ATCC Nr. PTA-3667, Pasteurella trehalosi ATCC Nr. PTA-3668 und/oder Mannheimia haemolytica ATCC Nr. PTA-3669 ausgewählt sind. Dieser Impfstoff kann vollständige bakterielle Zellen dieser Stämme, Bakterienextrakte, äußere Membranfraktionen, bakterielle Exo- und/oder Endotoxine und gereinigte Proteine umfassen. Antigene Polypeptide oder Fragmente davon können beispielsweise aus gereinigten bakteriellen Proteinen oder durch Expression des entsprechenden genetischen Materials in prokaryontischen oder eukaryontischen Expressionssystemen oder durch organisch-chemische Synthese erhalten werden. Diese Verfahren sind dem Fachmann geläufig.
  • Insbesondere betrifft die Erfindung ferner eine Impfstoffzusammensetzung gemäß der Erfindung, die ferner mindestens ein weiteres Antigen aus einem Virus oder Mikroorganismus, die für Geflügel pathogen sind, umfasst. Vorzugsweise liegt dieses Antigen in Form von lebenden, abgeschwächten oder inaktivierten Viren oder Mikroorganismen oder Fragmenten davon vor. Dieses Fragment kann vollständige bakterielle Zellen oder virale Teilchen, bakterielle Extrakte, virale Antigene, virale Untereinheiten, äußere Membranfraktionen, bakterielle Exo- und/oder Endotoxine und gereinigte Proteine umfassen. Antigene Polypeptide oder Fragmente davon können beispielsweise aus gereinigten bakteriellen Proteinen oder durch Expression des entsprechenden genetischen Materials in prokaryontischen oder eukaryontischen Expressionssystemen oder durch organisch-chemische Synthese erhalten werden. Diese Verfahren sind dem Fachmann geläufig.
  • Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung eine erfindungsgemäße Impfstoffzusammensetzung, die ferner mindestens ein weiteres Antigen aus einem Virus oder Mikroorganismus, die für Geflügel pathogen sind, umfasst, wobei das Virus oder der Mikroorganismus aus der folgenden Gruppe (ohne Beschränkung hierauf) ausgewählt ist: infektiöses Bronchitis-Virus, Newcastle-Krankheit-Virus, infektiöses Schleimbeutelkrankheit-Virus (Krankheit: Gumboro), Hühneranämie-Erreger, Vogel-Reovirus, Mycoplasma gallisepticum, Vogel-Pneumovirus, Haemophilus paragallinarum (Krankheit: Coryza), Hühner-Pockenvirus, Vogel-Encephalomyelitis-Virus, Pasteurella multocida und E. coli.
  • Eine "pharmazeutische Zusammensetzung" besteht im wesentlichen aus einem oder mehreren Bestandteilen, die zur Modifikation von physiologischen, z. B. immunologischen Funktionen des Organismus, dem sie verabreicht wird, oder von Organismen, die im oder auf dem Organismus leben, befähigt sind. Der Ausdruck umfasst (ohne Beschränkung hierauf) Antibiotika oder Antiparasitika sowie andere Bestandteile, die üblicherweise verwendet werden, um bestimmte Ziele zu erreichen, z. B. (ohne Beschränkung hierauf) Bearbeitung von Merkmalen, Sterilität, Stabilität, Möglichkeit zur Verabreichung der Zusammensetzung über enterale oder parenterale Wege, wie oral, intranasal, intravenös, intramuskulär, subkutan, intradermal oder ein anderer geeigneter Weg, Verträglichkeit nach der Verabreichung und kontrollierte Freisetzungseigenschaften. Somit betrifft ein weiterer wichtiger Aspekt der Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, die ein lebendes und/oder lebendes, abgeschwächtes und/oder inaktiviertes Pasteurella trehalosi und/oder Mannheimia haemolytica gemäß der Erfindung und/oder Fraktionen dieses Pasteurella trehalosi und/oder Mannheimia haemolytica umfasst.
  • Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Behandlung eines mit Pasteurella trehalosi und/oder Mannheimia haemolytica infizierten Tiers (z. B. mit den lebenden Bakterien gemäß der vorstehenden Beschreibung), wobei das Tier zur Gruppe von Geflügeltieren gehört, wobei das lebende, abgeschwächte, inaktivierte Pasteurella trehalosi und/oder Mannheimia haemolytica gemäß der Erfindung und/oder Fraktionen und/oder Fragmente davon gemäß der Erfindung (wie vorstehend beschrieben) dem behandlungsbedürftigen Geflügeltier in ausreichenden Dosen, die dem Fachmann bekannt sind, verabreicht werden, wobei die Verringerung der Symptome, die durch die Infektion durch Pasteurella trehalosi und/oder Mannheimia haemolytica hervorgerufen werden, überwacht wird. Diese Behandlung kann vorzugsweise wiederholt werden.
  • Eine weitere wichtige Ausführungsform besteht in einem Verfahren zum Immunisieren von Geflügel gegen die Krankheit des Atmungstrakts und des reproduktiven Trakts, die durch Pasteurella trehalosi und/oder Mannheimia haemolytica (z. B. durch die vorstehend beschriebenen lebenden Bakterien) hervorgerufen wird, wobei die Behandlung die Verabreichung einer immunologisch wirksamen Menge eines erfindungsgemäßen Impfstoffes und die Überwachung der Verringerung der Symptome, die durch die Infektion durch Pasteurella trehalosi und/oder Mannheimia haemolytica hervorgerufen werden, umfasst.
  • Eine weitere wichtige Ausführungsform besteht in der Verwendung eines erfindungsgemäßen inaktivierten Pasteurella trehalosi und/oder Mannheimia haemolytica und/oder eines erfindungsgemäßen lebenden Pasteurella trehalosi und/oder Mannheimia haemolytica und/oder eines erfindungsgemäßen lebenden, abgeschwächten Pasteurella trehalosi und/oder Mannheimia haemolytica gemäß der Erfindung und/oder von Fragmenten oder Fraktionen des erfindungsgemäßen Pasteurella trehalosi und/oder Mannheimia haemolytica bei der Herstellung eines Impfstoffes für die Prophylaxe von Pasteurella trehalosi- und/oder Mannheimia haemolytica-Infektionen.
  • Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Diagnose einer Krankheit, das die folgenden Stufen umfasst: Das Gewinnen einer Probe aus Geflügel, wobei die Probe aus der Gruppe Blut, Serum, Plasma, Gewebeabschabungen, Waschflüssigkeiten, Abstriche und Gewebe besteht, und das Analysieren der Probe auf die Anwesenheit von erfindungsgemäßem Pasteurella trehalosi und/oder Mannheimia haemolytica.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Anwesenheit von Pasteurella trehalosi und/oder Mannheimia haemolytica durch einen Immuntest bestimmt. Ein Immuntest bedient sich monoklonaler Antikörper oder monoklonaler Antiseren, die für Pasteurella trehalosi und/oder Mannheimia haemolytica spezifisch sind. Die Erzeugung von monoklonalen Antikörpern ist aus dem Stand der Technik bekannt (3, 4).
  • Immuntests umfassen die vorstehend beschriebenen Verfahren, wie den ELISA-Test (enzymgebundener Immunosorbens-Test) oder den so genannten Sandwich-ELISA-Test, Dot-Blots, Immunoblots, Radioimmuntests (Radioimmunoassay, RIA), den auf Diffusion basierenden Ouchterlony-Test, Raketen-Immunofluoreszenztests oder Agglutinationstests (rascher Platten- oder Mikroplatten-Agglutinationstest). Ein weiterer Immuntest ist der so genannte Western-Blot (auch bekannt als Western-Transferverfahren oder Western-Blotting). Der Zweck des Western-Blots besteht in der Übertragung von Proteinen oder Polypeptiden, die durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese aufgetrennt worden sind, auf ein Nitrocellulosefilter oder einen anderen geeigneten Träger und gleichzeitig in der Bestimmung der relativen Position der Proteine oder Polypeptide, die durch Gelelektrophorese erhalten worden sind. Der Western-Blot wird sodann mit einem Antikörper inkubiert, der spezifisch an das in Betracht kommende Protein oder Polypeptid bindet. Diese Nachweisverfahren können vom Fachmann zur Ausführung der hier beschriebenen Erfindung herangezogen werden. Nachstehend sind Literaturstellen aufgeführt, in denen der Fachmann die vorstehend erwähnten Verfahren und weitere Nachweisverfahren findet.: An Introduction to Radioimmunoassay and Related Techniques, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, Niederlande (1986); Bullock et al., Techniques in Immunocytochemistry, Academic Press, Orlando, FL, Bd. 1 (1982), Bd. 2 (1983), Bd. 3 (1985); Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays: Laborstory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, Niederlande (1985).
  • Gemäß einer weiteren, besonders speziellen Ausführungsform wird die vorstehend beschriebene Probe mit Antikörpern inkubiert, die spezifisch für Pasteurella trehalosi und/oder Mannheimia haemolytica sind, und der dabei gebildete Antigen/Antikörper-Komplex wird bestimmt.
  • Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Anwesenheit von Pasteurella trehalosi und/oder Mannheimia haemolytica in einer Probe gemäß den vorstehenden Ausführungen durch molekularbiologische Verfahren bestimmt. Unter dem hier verwendeten Ausdruck "molekularbiologische Verfahren" sind Nachweisverfahren zu verstehen, die beispielsweise die Polymerase-Kettenreaktion (PCR), die reverse Transcriptase- Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) oder die Northern- oder Southern-Blots umfassen und die der Fachmann in Standardwerken findet (z. B. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laborstory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laborstory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989); und S. Bertram und H. G. Gassen, Gentechnissche Methoden, G. Fischer Verlag, Stuttgart, New York (1991)).
  • Die Erfindung umfasst ferner ein diagnostisches Testkit gemäß der Erfindung, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es sämtliche für den Nachweis von Pasteurella trehalosi und/oder Mannheimia haemolytica erforderlichen Bestandteile enthält.
  • Bei einem diagnostischen Testkit handelt es sich um eine Ansammlung sämtlicher Komponenten zur Durchführung des erfindungsgemäßen Diagnoseverfahrens. Zu einigen Beispielen (nicht-erschöpfende Aufzählung) von weiteren Bestandteilen zur Durchführung eines erfindungsgemäßen Verfahrens gehören Behälter, wie Platten mit 96 Vertiefungen oder Mikrotiterplatten, Teströhrchen, weitere geeignete Behälter, Oberflächen und Substrate, Membranen, wie Nitrocellulose-Filter, Waschreagenzien und Puffer. Ein diagnostisches Testkit kann auch Reagenzien enthalten, die gebundene Antikörper erfassen, z. B. markierte sekundäre Antikörper, Chromophore, Enzyme (z. B. mit Antikörpern konjugiert) und Substrate davon oder andere Substanzen, die zur Bindung von Antikörpern befähigt sind.
  • Die Erfindung umfasst ferner ein erfindungsgemäßes diagnostisches Testkit, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es sämtliche zur Durchführung einer PCR oder RT-PCR zum Nachweis von Pasteurella trehalosi- und/oder Mannheimia haemolytica-spezifischer DNA oder -RNA erforderlichen Bestandteile enthält. Dieses Kit kann (ohne Beschränkung hierauf) zusätzlich zu Teströhrchen oder Platten mit 96 Vertiefungen oder Mikrotiterplatten weitere geeignete Behälter, Oberflächen und Substrate, Membranen, wie Nitrocellulosefilter, Waschreagenzien und Reaktionspuffer (die in bezug auf pH-Wert und Magnesiumkonzentrationen variieren können), steriles Wasser, Mineralöl, BSA (Rinderserumalbumin), MgCl2, (NH4)2SO4, DMSO (Dimethylsulfoxid), Mercaptoethanol, Nucleotide (dNTPs), Enyzme, wie Taq-Polymerase und reverse Transcriptase und als DNA-Matrix die für Pasteurella trehalosi- und/oder Mannheimia haemolytica-spezifische DNA oder cDNA, für Pasteurella trehalosi- und/oder Mannheimia haemolytica-DNA oder -RNA spezifische Oligonucleotide, Kontrollmatrizen, DEPC-Wasser, DNAse, RNAse und ferner dem Fachmann geläufige Verbindungen enthalten. Erfindungsgemäße Oligonucleotide sind kurze Nucleinsäuremoleküle mit einer Länge von etwa 15 bis etwa 100 Nucleotiden, die unter stringenten Bedingungen an die Nucleinsäuresequenz binden, die komplementär zu einem Pasteurella trehalosi- und/oder Mannheimia haemolytica-Protein ist. Unter stringenten Bedingungen versteht der Fachmann Bedingungen, die eine Selektion auf eine Homologie von mehr als 85% und vorzugsweise von mehr als 90% vornehmen (vergl. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laborstory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laborstory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989); und S. Bertram und H. G. Gassen, Gentechnische Methoden, G. Fischer Verlag, Stuttgart, New York, 1991).
  • Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der vorliegenden Erfindung, sind aber nicht als Beschränkung des Schutzumfangs der Erfindung anzusehen.
  • Beispiel 1
  • Ausbruch der mit Pasteurella trehalosi und/oder Mannheimia haemolytica assoziierten Krankheit unter Feldbedingungen Klinische Anzeichen Aus Feldbeobachtungen
    Legehennen Broiler
    milde Symptome des oberen Atmungstrakts/reproduktiven Trakts schwere Symptome des oberen Atmungstrakts/reproduktiven Trakts
    Alter: 22 Wochen Alter: 7 Wochen
    nasale Ausscheidung Niesen mit Raschelgeräuschen
    geschwollene Bereiche rund um die Augen geschwollener Kopf
    geringe Nahrungsaufnahme geringe Nahrungsaufnahme
    weißlicher Durchfall Mattheit
    verringerte Eierzeugung ungleichmäßiges Wachstum
    geringe Mortalität zerzauste Federn
    verschobener Kamm Prostration
    Cyanose des Kamms Mortalität: 8%
    Starke Läsionen
    Eierstockatrophie mit Hämorrhagien und Regression Hämorrhagien in den Gonaden
    Deformierte Ovarialfollikel Oberer Bereich der Luftröhre mit Hämorrhagien
    Vergrößerte Leber Vergrößerte Leber mit Hämorrhagien
    Entzündung der Nieren Luft-Sakkulitis
    Hämorrhagien im abdominalen Fett Vergrößerte Milz mit Hämorrhagien
    Hämorrhagien in der Thoraxhöhle Hämorrhagien in den Muskeln
    Hämorrhagien im Eileiter Hämorrhagien in Herz und Hydropericard
    Hämorrhagien im Koronarfett Hämorrhagien in der Thoraxhöhle
  • Drei Stämme eines neuartigen Typs von gram-negativen, fakultativ anaeroben, pleomorphen, stabförmigen Bakterien wurden bei der American Type Culture Collection (ATCC), 1081, University Boulevard, Manassas, VA 20110–2209, USA, unter den folgenden Hinterlegungsnummern hinterlegt: ATCC Nr. PTA-3667 für BIV-4985 Pasteurella trehalosi; ATCC Nr. PTA-3668 für BIV-AVICOR Pasteurella trehalosi und ATCC Nr. PTA-3669 für BIV-07990, Mannheimia haemolytica. Hinterlegungstag ist der 22. August 2001.
  • Die hinterlegten Bakterien wurden gemäß typischen Bestimmungsverfahren typisiert, wobei man sich des Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Bd. I (1984), Williams and Wilkins, 428 East Preston Street, Baltimore, USA) bediente.
  • Tabelle 1
  • Mannheimia haemolytica: BIV-07990 (Biotyp 1); ATCC Nr. PTA-3669
  • Makroskopische Morphologie
  • Kolonien, die 24 Stunden auf Schafblut-Agar gezüchtet worden sind, weisen einen Durchmesser im Bereich von 1,0 bis 1,5 mm auf, sind hell durchscheinend, geringfügig konvex, glatt und cremig und zeigen β-Hämolyse.
  • Mikroskopische Morphologie
  • Gram-negative, nicht-bewegliche, pleomorphe Stäbchen, die häufig eine bipolare Färbung zeigen.
  • Biochemische und andere Tests
  • Abschnitt A
    Test Reaktion
    Oxidase +
    Katalase +
    Indol –
    Glucose +
    Saccharose +
    MacConkey +
    Urease –
    Nitrat +
    Abschnitt B
    Maltose +
    Mannit +
    Arabinose –
    Cellobiose –
    Sorbit +
    Xylose +
    Trehalose –
    Salicin –
    Ornithin –
    Esculin –
    β-Glucosidase –
    α-Fucosidase –
    β-Galactosidase +
  • Tabelle 2
  • Pasteurella trehalosi: BIV-AVICOR (Biotyp 2); ATCC Nr. PTA-3668
  • Makroskopische Morphologie
  • Kolonien, die 24 Stunden auf Schafblut-Agar gezüchtet worden sind, weisen einen Durchmesser im Bereich von 1,0 bis 1,5 mm auf, sind hell durchscheinend, geringfügig konvex, glatt und cremig und zeigen β-Hämolyse.
  • Mikroskopische Morphologie
  • Gram-negative, nicht-bewegliche, pleomorphe Stäbchen, die häufig eine bipolare Färbung zeigen.
  • Biochemische und andere Tests
  • Abschnitt A
    Test Reaktion
    Oxidase +
    Katalase +
    Indol –
    Glucose +
    Saccharose +
    MacConkey +
    Urease –
    Nitrat +
    Abschnitt B
    Maltose +
    Mannit +
    Arabinose –
    Cellobiose –
    Sorbit +
    Xylose +
    Trehalose +
    Salicin –
    Ornithin –
    Esculin –
    β-Glucosidase +α
    α-Fucosidase –
    β-Galactosidase +
    • α 80% sind positiv
  • Tabelle 3
  • Pasteurella trehalosi: BIV-4895 (Biotyp 4); ATCC Nr. PTA-3667
  • Makroskopische Morphologie
  • Kolonien, die 24 Stunden auf Schafblut-Agar gezüchtet worden sind, weisen einen Durchmesser im Bereich von 1,0 bis 1,5 mm auf, sind hell durchscheinend, geringfügig konvex, teilchenförmig und trocken und zeigen β-Hämolyse.
  • Mikroskopische Morphologie
  • Gram-negative, nicht-bewegliche, pleomorphe Stäbchen, die häufig eine bipolare Färbung zeigen.
  • Biochemische und andere Tests
  • Abschnitt A
    Test Reaktion
    Oxidase +
    Katalase +
    Indol –
    Glucose +
    Saccharose +
    MacConkey +
    Urease –
    Nitrat +
    Abschnitt
    Maltose –
    Mannit +
    Arabinose –
    Cellobiose –
    Sorbit +
    Xylose +
    Trehalose +
    Salicin –
    Ornithin –
    Esculin –
    β-Glucosidase –
    α-Fucosidase –
    β-Galactosidase +
  • Die Ergebnisse der Tests von Abschnitt A und B (Tabellen 1, 2 und 3) bestätigen, dass die Bakterien BIV-4895; ATCC Nr. PTA-3667 und BIV-AVICOR; ATCC Nr. PTA-3668 zur Familie Pasteurellaceae gehören (Pasteurella trehalosi, die Trehalose-positiv und Arabinose-negativ sind), während die Bakterien BIV-07990; ATCC Nr. PTA-3669 zur Familie Mannheimia gehören (Mannheimia haemolytica, die Trehalose-negativ und Arabinose-negativ sind).
  • Identifikation des Erregers
  • Bakterien wurden aus infizierten Luftröhren, Gaumenspalten, Ovarien, Leber, Herz, Nieren und Gonaden (Broiler) isoliert. Sie wurden auf der Grundlage der nachstehend aufgeführten Tests als Pasteurella trehalosi und Mannheimia haemolytica identifiziert:
    beta-Hämolyse +
    gram-Färbung –
    Oxidase +
    Katalase +
    Mac Conkey +
    Urease –
    Nitrat +
    Indol –
  • Es wurde keine Isolierung von Viren oder anderer Bakterien durchgeführt.
  • Biotypisierung
  • Bakterielle Isolate wurden gereinigt und gemäß dem Verfahren von Jaworski et al. (1) biotypisiert. Drei verschiedene Biotypen (4, 2, 1) wurden identifiziert. Kurz zusammengefasst, wurde aus den gereinigten Isolaten eine einzige Kolonie auf Röhrchen mit einem Gehalt an 3 ml Tryptose-Brühe inokuliert und 8 Stunden bei 37°C inkubiert. Eine Öse mit Inoculum (20 μl) aus dem Röhrchen wurde sodann auf ein weiteres Röhrchen mit einem Gehalt an 3 ml von 1% des zu testenden Zuckers übertragen und 7 Tage bei 37°C inkubiert, wonach die Ergebnisse aufgezeichnet wurden.
  • Belastungsmodell
  • Im Anschluss an die Reinigung der Bakterien wurden Isolate in Tryptose-Medium gezüchtet, um große Mengen an reinen Pathogenen zu erhalten. Um die Koch-Postulate zu verifizieren, wurden drei verschiedene Gruppen (20 Vögel pro Gruppe) von speziellen, pathogenfreien (SPF) Hühnern im Alter von 13 Wochen mit jedem Biotyp (0,2 ml/Vogel; 3 × 108 CFU/ml) auf intravenösem Weg infiziert. Die Vögel wurden täglich drei Tage lang auf Morbidität und Mortalität beobachtet. Nach dem dritten Tag wurden sämtliche Vögel getötet. Die Läsionen wurden nach dem Tod aufgezeichnet und Organproben (Leber und Gonaden) wurden zur Reisolierung gewonnen. Die post mortem-Läsionen der eingegangenen Vögel wurden ebenfalls aufgezeichnet.
  • Ergebnisse
  • Klinische Symptome: Erschöpfung, Lahmen, verschobener Kamm, zerzauste Federn, Cyanose an der Kammspitze. Läsionen:
    Läsion BIV-4895 (Biotyp 4) BIV-AVICOR (Biotyp 2) BIV-07990 (Biotyp 1)
    Herzödem 73% 37% 90%
    Herzhämorrhagien 90% - 70%
    Hämorrhagien im Koronarfett 90% 37% 50%
    Perikarditis 73% 46% 30%
    Hämorrhagien in der Thoraxhöhle - 19% 40%
    Hämorrhagien im Eierstock 64% 9% 20%
    Entzündung der Nieren 64% 46% 60%
    Hämorrhagien in den Nieren 55% 46% 20%
    Vergrößerte Leber mit Hämorrhagien - 73% -
    Bildung von Luftsäcken 64% - -
    Hämorrhagien im Muskel - 37% -
    Mortalität 46% 19% -
  • Beispiel II
  • Wachstum der erfindungsgemäßen Bakterien, Herstellung des Impfstoffes und Impfung von SPF-Vögeln.
  • Stämme wurden auf Tryptose-Brühe (TB) gezüchtet. Die Ernte wurde in der logarithmischen Wachstumsphase etwa 6 bis 8 Stunden nach der Inokulation, und zwar in Abhängigkeit vom Stamm, durchgeführt. Die Auszählung der Platten wurde in Schafblut-Agar für die Titration durchgeführt. Die kolonienbildenden Einheiten pro Milliliter (CFU/ml) wurden unter Verwendung von 1:10-Verdünnungen des Erntematerials bestimmt. Zellen wurden durch Zugabe von Formaldehyd bis zu einer Endkonzentration von 0,2% abgetötet. Nach einer Sterilitätsprüfung dieser Suspension wurde der endgültige Impfstoff mit einem minimalen Titer von 108 CFU/ml versetzt.
  • Der Impfstoff wurde durch Vermischen der beiden Stämme (BIV-4895, ATCC Nr. PTA-3667 und BIV-AVICOR, ATCC Nr. PTA-3668) und Öl-Adjuvans (eine Wasser-in-Öl-Emulsion auf der Basis eines Mineralöls in einem Verhältnis von 60% Öl/40% Wasser) bis zu einer minimalen Konzentration von 107,0 CFU/Stamm/ml hergestellt.
  • Spezielle pathogenfreie (SPF) Hühner wurden im Alter von 2, 5 und 9 Wochen durch Injektion von 0,5 ml Impfstoff auf subkutanem Weg auf halber Höhe des Halses geimpft.
  • Beispiel III
  • Herstellung von Belastungsstämmen und Belastung von geimpften und Kontrollgruppen
  • Die bakteriellen Stämme BIV-4895, ATCC Nr. PTA-3667 und BIV-AVICOR, ATCC Nr. PTA-3668 wurden 24 Stunden bei 37°C auf Schafblut-Agar gezüchtet. Die Zellen wurden in Tryptose-Brühe (TB) geerntet, nachdem eine Suspension mit einer optischen Dichte von 2,0 erhalten worden war, was mit einem Spektrophotometer bei einer Wellenlänge von 540 nm bestimmt wurde. Für die Belastung wurden Präparate hergestellt, die die nachstehend angegebene Anzahl an Zellen im endgültigen Belastungsvolumen enthielten:
    3 × 109 CFU/ml BIV-AVICOR; ATCC Nr. PTA-3668
    1,45 × 1010 CFU/ml BIV-4895, ATCC Nr. PTA-3667
  • Im Alter von 13 Wochen wurden 20 geimpfte und 20 nicht geimpfte Vögel auf intravenösem Weg durch Verabreichen von 0,2 ml Inoculum (mindestens 108,0 CFU/Vogel) belastet. Die Vögel wurden 3 Tage lang auf Morbidität und Mortalität beobachtet. Nach der 3-tägigen Beobachtung wurden sämtliche verbleibenden Vögel getötet und eine Reisolierung der Bakterien aus Leber und Gonaden wurde bei jedem Vogel durchgeführt. Die post-mortem-Läsionen der Vögel, die eingegangen waren, wurden ebenfalls aufgezeichnet. Ergebnisse
    Gruppe von Vögeln Belastungsinokulum Mortalität + Reisolierung Schutz, %
    negative Kontrolle N/A 0 N/A
    positive Kontrolle ATCC Nr. PTA-3667 77 23
    positive Kontrolle ATCC Nr. PTA-3668 54 46
    Impfgruppe ATCC Nr. PTA-3667 0 100
    Impfgruppe ATCC Nr. PTA-3668 5 95
  • Beispiel IV
  • Wachstum der erfindungsgemäßen Bakterien, Herstellung des Impfstoffes und Impfung von SPF-Vögeln
  • Stämme wurden auf Tryptose-Brühe (TB) gezüchtet. Die Ernte wurde in der logarithmischen Wachstumsphase etwa 6 bis 8 Stunden nach der Inokulation, und zwar in Abhängigkeit vom Stamm, durchgeführt. Die Auszählung der Platten wurde in Schafblut-Agar für die Titration durchgeführt. Die kolonienbildenden Einheiten pro Milliliter (CFU/ml) wurden unter Verwendung von 1:10-Verdünnungen des Erntematerials bestimmt. Zellen wurden durch Zugabe von Formaldehyd bis zu einer Endkonzentration von 0,2% abgetötet. Nach einer Sterilitätsprüfung dieser Suspension wurde der endgültige Impfstoff mit einem minimalen Titer von 108 CFU/ml versetzt.
  • Der Impfstoff wurde durch Vermischen der drei Stämme (BIV-4895, ATCC Nr. PTA-3667, BIV-AVICOR, ATCC Nr. PTA-3668 und BIV-07990, ATCC Nr. PTA-3669) und Öl-Adjuvans (eine Wasser-in-Öl-Emulsion auf der Basis eines Mineralöls in einem Verhältnis von 60% Öl/40% Wasser) bis zu einer minimalen Konzentration von 107,0 CFU/Stamm/ml hergestellt.
  • Spezielle pathogenfreie (SPF) Hühner wurden im Alter von 2, 5 und 9 Wochen durch Injektion von 0,5 ml Impfstoff auf subkutanem Weg auf halber Höhe des Halses geimpft.
  • Beispiel V
  • Herstellung von Belastungsstämmen und Belastung von geimpften Gruppen und Kontrollgruppen
  • Die bakteriellen Stämme BIV-4895, ATCC Nr. PTA-3667, BIV-AVICOR, ATCC Nr. PTA-3668 und BIV-07990, ATCC Nr. PTA-3669 wurden 24 Stunden bei 37°C auf Schafblut-Agar gezüchtet. Die Zellen wurden in Tryptose-Brühe (TB) geerntet, nachdem eine Suspension mit einer optischen Dichte von 2,0 erhalten worden war, was mit einem Spektrophotometer bei einer Wellenlänge von 540 nm bestimmt wurde. Für die Belastung wurden Präparate hergestellt, die die nachstehend angegebene Anzahl an Zellen im endgültigen Belastungsvolumen enthielten:
    8,3 × 109 CFU/ml BIV-AVICOR; ATCC Nr. PTA-3668
    2,2 × 109 CFU/ml BIV-4895, ATCC Nr. PTA-3667
    1,0 × 1010 CFU/ml BIV-07990; ATCC Nr. PTA-3669
  • Im Alter von 13 Wochen wurden 20 geimpfte und 20 nicht geimpfte Vögel auf intravenösem Weg durch Verabreichen von 0,2 ml Inoculum (mindestens 108,0 CFU/Vogel) belastet. Die Vögel wurden 3 Tage lang auf Morbidität und Mortalität beobachtet. Nach der 3-tägigen Beobachtung wurden sämtliche verbleibenden Vögel getötet und eine Reisolierung der Bakterien aus Leber und Gonaden wurde bei jedem Vogel durchgeführt. Die post-mortem-Läsionen der Vögel, die eingegangen waren, wurden ebenfalls aufgezeichnet. Ergebnisse
    Gruppe von Vögeln Belastungsinokulum Mortalität + Reisolierung Schutz, %
    geimpfte negative Kontrollgruppe N/A 0 N/A
    ungeimpfte negative Kontrollgruppe N/A 0 N/A
    geimpfte Gruppe ATCC Nr. PTA-3669 27,3 72,7
    geimpfte Gruppe ATCC Nr. PTA-3668 20,9 79,1
    geimpfte Gruppe ATCC Nr. PTA-3667 16,7 83,7
    positive Kontrollgruppe ATCC Nr. PTA-3669 53,3 46,7
    positive Kontrollgruppe ATCC Nr. PTA-3668 53,3 46,7
    positive Kontrollgruppe ATCC Nr. PTA-3667 64,3 35,7
  • Serologischer Test
  • Hyperimmunseren wurden in Kaninchen gemäß dem Verfahren von Biberstein et al. (2) mit einem jeden Biotyp repräsentierenden Isolat hergestellt.
  • Die Isolate wurden über Nacht aus Blutagar gezüchtet, sodann in Kochsalzlösung mit einem Gehalt an 0,3% Formalin geerntet. Die Zellen wurden einmal gewaschen und für die Injektion auf eine Durchlässigkeit von 10% bei 575 nm eingestellt. Die Injektionen wurden auf intravenösem Weg gemäß dem folgenden Schema durchgeführt: 0,5 ml, 1,0, 2,0, 3,0, 3,0, 3,0 in Abständen von 4 Tagen. 4 Tage nach der letzten Injektion wurde sämtlichen Kaninchen Blut entnommen.
  • Das Hyperimmunserum wurde auf die Spezifität unter Verwendung der 3 Biotyp-Stämme getestet und mit homologem und heterologem Kaninchen-Antiserum (2-fache Verdünnungen) durch rasche Plattenagglutination getestet.
  • Antiserum für jeden Biotyp wurde bis zum Erreichen des Endpunkts verdünnt, um die höchste Verdünnung, die sich als positiv erwies, zu bestimmen. Verdünnung (log2) Antigen-Biotyp 1
    Antiserum 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
    1 + + + + + + + + + + +
    2 – – – – – – – – – – –
    4 – – – – – – – – – – –
    Verdünnung (log2) Antien-Biotyp 4
    Antiserum 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
    1 – – – – – – – – – – –
    2 – – – – – – – – – – –
    4 + + + + + + + + + + +
    Verdünnung (log2) Antigen-Biotyp 2
    Antiserum 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
    1 – – – – – – – – – – – –
    2 + + + + + + + + + + + +
    4 – – – – – – – – – – – –
  • Die biotypspezifischen Hyperimmunseren wurden sodann als positive Kontrollen beim Mikroplatten-Serum-Agglutinationstest verwendet.
  • Beispiel VI
  • Herstellung von Belastungsstämmen und Belastung von geimpften Gruppen und Kontrollgruppen
  • Die bakteriellen Stämme BIV-4895, ATCC Nr. PTA-3667, BIV-AVICOR, ATCC Nr. PTA-3668 und BIV-07990, ATCC Nr. PTA-3669 wurden 24 Stunden bei 37°C auf Schafblut-Agar gezüchtet. Die Zellen wurden in Tryptose-Brühe (TB) geerntet, nachdem eine Suspension mit einer optischen Dichte von 2,0 erhalten worden war, was mit einem Spektrophotometer bei einer Wellenlänge von 540 nm bestimmt wurde. Für die Belastung wurden Präparate hergestellt, die die nachstehend angegebene Anzahl an Zellen im endgültigen Belastungsvolumen enthielten:
    1,5 × 1010 CFU/ml BIV-AVICOR; ATCC Nr. PTA-3668
    1,7 × 1010 CFU/ml BIV-4895, ATCC Nr. PTA-3667
    1,6 × 1010 CFU/ml BIV-07990; ATCC Nr. PTA-3669
  • Im Alter von 13 Wochen wurden 20 geimpfte und 20 nicht geimpfte Vögel auf intravenösem Weg durch Verabreichen von 0,2 ml Inoculum (mindestens 108,0 CFU/Vogel) belastet. Die Vögel wurden 3 Tage lang auf Morbidität und Mortalität beobachtet. Nach der 3-tägigen Beobachtung wurden sämtliche verbleibenden Vögel getötet, post-mortem-Läsionen wurden aufgezeichnet und eine Reisolierung der Bakterien aus Leber und Gonaden wurde bei jedem Vogel durchgeführt.
  • Ergebnisse
  • Tabelle 1. Bewertung des Einflusses des Impfstoffes auf der Basis von Mortalität und Reisolierung
    Gruppe von Vögeln Belastungsinokulum Mortalität + Reisolierung Schutz, %
    nicht geimpfte negative Kontrollgruppe N/A N/A N/A
    positive Kontrollgruppe BIV-4895 70 30
    positive Kontrollgruppe BIV-AVICOR 80 20
    positive Kontrollgruppe BIV-07990 88,8 11,2
    geimpfte Gruppe BIV-4895 10 90
    geimpfte Gruppe BIV-AVICOR 10 90
    geimpfte Gruppe BIV-07990 15 85
    Tabelle 2 Bewertung des Einflusses des Impfstoffes auf der Grundlage von starken Läsionen nach der Belastung
    Gruppe von Vögeln Belastungsinokulum % Läsionen Schutz, %
    nicht geimpfte negative Kontrollgruppe N/A N/A N/A
    positive Kontrollgruppe BIV-4895 74,4 25,6
    positive Kontrollgruppe BIV-AVICOR 27,0 73,0
    positive Kontrollgruppe BIV-07990 7,0 93,0
    geimpfte Gruppe BIV-4895 4,0 96,0
    geimpfte Gruppe BIV-AVICOR 1,1 99,0
    geimpfte Gruppe BIV-07990 2,4 98,0
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Claims (21)

  1. Gram-negatives, pleomorphes, stabförmiges Bakterium, das eine Krankheit des oberen Atmungstrakts und des reproduktiven Trakts von Hühnern hervorruft, wobei das Bakterium aus der Gruppe Pasteurella trehalosi oder Mannheimia haemolytica ausgewählt ist und wobei das Bakterium beta-Hämolyse-positiv, Oxidase-positiv, Katalase-positiv, Urease-negativ, Nitrat-positiv, Indol-negativ, MacConkey-positiv, Glucose-positiv, Saccharose-positiv, Mannit-positiv, Arabinose-negativ, Cellobiose-negativ, Xylose-positiv, Salicin-negativ, Ornithin-negativ, Esculin-negativ, alpha-Fucosidase-negativ und beta-Galactosidase-positiv ist.
  2. Bakterium nach Anspruch 1, wobei das Bakterium Trehalose-positiv ist.
  3. Bakterium nach Anspruch 1, wobei das Bakterium Trehalose-negativ ist.
  4. Bakterium nach Anspruch 2, wobei das Bakterium unter der Hinterlegungsnummer ATCC Nr. PTA-3667 hinterlegt ist.
  5. Bakterium nach Anspruch 2, wobei das Bakterium unter der Hinterlegungsnummer ATCC Nr. PTA-3668 hinterlegt ist.
  6. Bakterium nach Anspruch 3, wobei das Bakterium unter der Hinterlegungsnummer ATCC Nr. PTA-3669 hinterlegt ist.
  7. Bakterium nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Bakterium inaktiviert ist.
  8. Inaktiviertes Bakterium nach Anspruch 7, wobei das Bakterium aus unter den Hinterlegungsnummern ATCC Nr. PTA-3667, ATCC Nr. PTA-3668 oder ATCC Nr. PTA-3669 hinterlegten Bakterien ausgewählt ist.
  9. Bakterium nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Bakterium attenuiert ist.
  10. Bakterium nach Anspruch 9, wobei das attenuierte Bakterium aus den Bakterien, die unter den Hinterlegungsnummern ATCC Nr. PTA-3667, ATCC Nr. PTA-3668 oder ATCC Nr. PTA-3669 hinterlegt sind, erhalten worden ist.
  11. Impfstoffzusammensetzung, umfassend ein inaktiviertes Bakterium nach Anspruch 7 oder 8 oder ein attenuiertes Bakterium nach Anspruch 9 oder 10.
  12. Impfstoffzusammensetzung, umfassend ein Fragment oder eine Fraktion von einem der Bakterien nach den Ansprüchen 1 bis 6, wobei das Fragment oder die Fraktion mindestens ein Antigen für die Prophylaxe von Pasteurella trehalos- oder Mannheimia haemolytica-Infektionen enthält.
  13. Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 11 oder 12, ferner umfassend ein oder mehr geeignete Adjuvantien und/oder Exzipientien oder Trägerstoffe.
  14. Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 11 bis 13, wobei der Impfstoff zwei oder mehr Stämme des inaktivierten Bakteriums nach den Ansprüchen 7 oder 8, zwei oder mehr Stämme des attenuierten Bakteriums nach Anspruch 9 oder 10 oder Fragmente oder Fraktionen, die mindestens ein Antigen für die Prophylaxe von Pasteurella trehalosi- oder Mannheimia haemolytica-Infektionen von zwei oder mehr Bakterienstämmen der Bakterien nach den Ansprüchen 1 bis 6 umfasst.
  15. Impfstoffzusammensetzung nach irgendeinem der Ansprüche 11 bis 14, wobei das oder die lebenden, attenuierten oder inaktivierten Bakterien aus den unter den Hinterlegungsnummern ATCC Nr. PTA-3667, ATCC Nr. PTA-3668 oder ATCC Nr. PTA-3669 hinterlegten Bakterien ausgewählt sind.
  16. Impfstoffzusammensetzung nach irgendeinem der Ansprüche 11 bis 15, ferner umfassend mindestens ein weiteres Antigen aus einem Virus oder Mikroorganismus, die für Hühner pathogen sind.
  17. Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 16, wobei das Virus oder der Mikroorganismus aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus infektiöse Bronchitis-Virus, Newcastle Disease-Virus, infektiöse Schleimbeutelkrankheit-Virus, Hühner-Anämie-Erreger, Vogel-Reovirus, Mycoplasma gallisepticum, Vögel-Pneumovirus, Haemophilus paragallinarum, Hühner-Pockenvirus, Vogel-Encephalomyelitis-Virus, Pasteurella multocida und E. coli besteht.
  18. Verwendung des Bakteriums nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 10 oder Fragmente oder Fraktionen, die mindestens ein Antigen des Bakteriums enthalten, für die Prophylaxe von Pasteurella trehalosi- oder Mannheimia haemolytica-Infektionen bei der Herstellung eines Impfstoffes für die Prophylaxe von Pasteurella trehalosi- oder Mannheimia haemolytica-Infektionen.
  19. Verfahren zum Nachweis eines Bakteriums nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6, das eine Krankheit des Atmungstrakts und des Reproduktionstrakts hervorruft, wobei der Nachweis in vitro in einer Probe erfolgt, umfassend die Stufe des Analysierens der Probe auf das Vorliegen des Bakteriums.
  20. Verfahren nach Anspruch 19, wobei das Vorliegen irgendeines der Bakterien nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6 durch einen Immuntest bestimmt wird.
  21. Verfahren nach Anspruch 20, wobei das Vorliegen irgendeines der Bakterien nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6 durch ein molekularbiologisches Verfahren bestimmt wird.
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