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Gebiet der Erfindung
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Die
Erfindung betrifft das Gebiet der Tiergesundheit und insbesondere
die Erreger einer neuen bakteriellen Geflügelkrankheit, nämlich Pasteurella
trehalosi und/oder Mannheimia haemolytica. Die Erfindung stellt diese
Pasteurella trehalosi und/oder Mannheimia haemolytica-Bakterien,
einen Impfstoff, der inaktiviertes Pasteurella trehalosi und/oder
Mannheimia haemolytica umfasst, und ein Verfahren zum Immunisieren
von Hühnern
zur Verhinderung dieser Krankheit bei Hühnern bereit.
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Hintergrund der Erfindung
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Während der
letzten 10 Jahre haben intensive Verfahren zur Bewirtschaftung von
Geflügelfarmen
mit dem Ziel der Erhöhung
der Produktivität
in sämtlichen
wichtigen geflügelerzeugenden
Ländern
zu einem Anstieg von Krankheitsausbrüchen geführt. Somit besteht ein zunehmendes
Bedürfnis
nach neuen und besseren Impfstoffen und Impfstoffprogrammen, um
diese Krankheiten zu bekämpfen.
Heutzutage werden die meisten Tiere gegen eine Anzahl von Krankheiten
viralen und bakteriellen Ursprungs immunisiert. Zu Beispielen für virale
Krankheiten bei Geflügel
gehören
die Newcastle-Krankheit, infektiöse
Bronchitis, Vogel-Pneumovirus, Geflügelpocken, infektiöse Schleimbeutelkrankheit
und dergl.
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Zu
Beispielen für
bakterielle Krankheiten gehören
Vogel-Coryza, die durch Haemophilus paragallinarum (oberer Atmungstrakt),
Bordetella avium (unterer Atmungstrakt), Ornithobacterium rhinotracheale
(unterer Atmungstrakt), Salmonella-Infektionen (Verdauungstrakt), Pasteurella
multocida, Erreger von Geflügelcholera (septikämisch) und
E. coli-Infektionen verursacht werden.
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Somit
besteht das der Erfindung zugrundeliegende technische Problem darin,
eine neue bakterielle Geflügelkrankheit
zu identifizieren, den Erreger dieser Krankheit bereitzustellen
und einen Impfstoff zur Bekämpfung
dieser Krankheit bereitzustellen.
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Figurenbeschreibung
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A. Von Krankheitsausbrüchen unter Feldbedingungen
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1)
Broiler: Nasale Ausscheidung und geschwollene Bereiche rund um die
Augen.
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2)
Broiler: Hämorrhagie
in Herz und Koronarfett.
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3)
Broiler: Konjunktivitis und Entzündungen
rund um die Augen.
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4)
Legehennen: Nasale Ausscheidungen und verschobener Kamm mit Cyanose.
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5)
Legehennen: Entzündung
und Hämorrhagie
rund um die Augen.
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6)
Legehennen: Hämorrhagie
in dermalem Gewebe hinter dem Eingang zu den Gehörgängen.
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7)
Legehennen: Entzündung
der Nieren.
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8)
Legehennen: Hämorrhagien
im Eileiter.
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9)
Legehennen: Deformierte Ovarialfollikel.
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10)
Legehennen: Hämorrhagie
in der Verbindung zwischen Proventriculus und Muskelmagen.
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11)
Legehennen: Blutstau und Hämorrhagie
im Eileiter.
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B. Experimentelle Infektion
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12)
Legehennen: Entzündung
und Hämorrhagie
in den Nieren.
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13)
SPF: Prostration.
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14)
Legehennen: Hämorrhagie
in Gelenken und Muskeln.
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15)
Legehennen: Nasale Ausscheidung und blasser Kamm.
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16)
Legehennen: Hämorrhagie
im Muskel.
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17)
SPF: Hämorrhagie
in Herz und Koronarfett.
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18)
Legehennen: Gesunde Vögel
auf der linken Seite und kranke Vögel auf der rechten Seite mit zerzausten
Federn.
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19)
Legehennen: Grünliche
Diarrhö
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20)
SPF: Hämorrhagie
in Muskeln
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21)
SPF: Prostration (lokomotorische Probleme) und grünliche Diarrhö
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22)
Legehennen: Vergrößerte Leber
mit Hämorrhagie
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Offenbarung der Erfindung
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Definitionen von in der Beschreibung verwendeten
Ausdrücken
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Vor
Beschreibung der erfindungsgemäßen Ausführungsformen
ist darauf hinzuweisen, dass die hier und in den beigefügten Ansprüchen verwendeten
Singularformen der unbestimmten und bestimmen Artikel auch den entsprechenden
Plural einschließen,
sofern der Textzusammenhang nicht deutlich etwas anderes angibt.
Beispielsweise umfasst die Bezugnahme auf "ein Pasteurella trehalosi" auch eine Mehrzahl
von derartigen Pasteurella trehalosi-Bakterien, eine Bezugnahme
auf die "Zelle" bezieht sich auf
eine oder mehrere Zellen und Äquivalente
davon, die dem Fachmann geläufig
sind, und dergl. Die Groß-
und Kleinschreibung von Produkten ist irrelevant; (im englischen
Text) haben sowohl "Arabinose" als auch "arabinose" die gleiche Bedeutung,
sofern nichts anderes angegeben ist. Weiterhin haben, sofern nichts
anderes angegeben ist, sämtliche
technischen und wissenschaftlichen Ausdrücke, die hier verwendet werden,
die gleichen Bedeutungen, wie sie der Fachmann auf dem einschlägigen Gebiet üblicherweise
versteht. Obgleich beliebige Verfahren und Materialien, die ähnlich oder
gleichwertig mit den hier beschriebenen Verfahren und Materialien
sind, bei der praktischen Ausübung
oder beim Testen der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können, werden
nachstehend bevorzugte Verfahren, Vorrichtungen und Materialien
beschrieben. Sämtliche
hier erwähnten
Publikationen werden durch Verweis zum Gegenstand der Beschreibung
gemacht, um die in diesen Publikationen, die in Verbindung mit der
vorliegenden Erfindung heranzuziehen sind, beschriebenen Zelllinien,
Vektoren und Verfahren zu beschreiben. Durch keine der hier gemachten
Ausführungen
soll eingeräumt
werden, dass die Erfindung durch eine frühere Erfindung, vorweggenommen
wird.
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Überraschenderweise
haben die Erfinder eine neue bakterielle Geflügelkrankheit beobachtet, die
vorwiegend bei Legehennen und weniger häufig bei Broilern auftritt.
Die Krankheit wurde bei Hühnern
festgestellt, die gegen das Bacterium Haemophilus paragallinarum
(Erreger von Vogel-Coryza) und Pasteurella multocida (Erreger von
Vogelcholera) geimpft worden waren. Die Symptome dieser neuen Krankheit
unterscheiden sich von den speziellen Symptomen von Coryza. Aufgrund
der Tatsache, dass die neu entdeckte Krankheit klar die klinischen
Anzeichen einer Infektion des oberen Atmungstrakts zeigt, wie nachstehend
ausgeführt
wird, kann H. paragallinarum als Erreger ausgeschlossen werden.
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Die
Erfindung betrifft in einer ersten Ausführungsform gram-negative, fakultativ
anaerobe, pleomorphe, stabförmige
Bakterien, die eine neue Krankheit des oberen Atmungstrakts und
des reproduktiven Trakts von Geflügel hervorrufen, wobei die
Bakterien aus der Gruppe von Pasteurella trehalosi und/oder Mannheimia haemolytica
ausgewählt
sind.
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Diese
erfindungsgemäßen Bakterien
können
aus infizierten Luftröhren,
Gaumenspalten, Ovarien, Leber, Herz, Nieren und Gonaden (Broiler)
isoliert werden. Sie können
als Pasteurella trehalosi und/oder Mannheimia haemolytica gemäß der Erfindung
auf der Grundlage der nachstehend aufgeführten Tests identifiziert werden:
β-Hämolyse | + |
gram-Färbung | – |
Oxidase | + |
Katalase | + |
Urease | – |
Nitrat | + |
Indol | – |
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Die
bakteriellen Isolate können
gemäß dem Verfahren
von Jaworski et al. (1) gereinigt und biotypisiert werden. Dieses
Verfahren wird auch in den Beispielen beschrieben. Wichtige Verfahren
zur Klassifizierung von Bakterien sind die DNA-DNA-Hybridisierung, REA (Restriktionsenzym-Analyse;
vergl. z. B. J. Clinical Microbiol., Bd. 31 (1993), S. 831–835) und
die Ribotypisierung. Diese Verfahren können vom Fachmann für die Feststellung
eingesetzt werden, ob Bakterien unter den Umfang der vorliegenden
Erfindung fallen. In den Beispielen wird auch ein Belastungsmodell
zur Validierung der Koch-Postulate beschrieben.
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Somit
besteht eine wichtige Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung in Pasteurella trehalosi und/oder Mannheimia
haemolytica, wobei Pasteurella und/oder Mannheimia beta(β)-Hämolyse-positiv, gram-negativ,
Oxidase-positiv, Katalase-positiv,
Urease-negativ, Nitrat-positiv und Indol-negativ sind. Vorzugsweise
sind Pasteurella trehalosi und/oder Mannheimia haemolytica gemäß der Erfindung
auch MacConkey-positiv. Besonders bevorzugt ist, dass Pasteurella
trehalosi und/oder Mannheimia haemolytica gemäß der Erfindung zusätzlich Glucose-positiv,
Saccharose-positiv, Mannit-positiv, Arabinose-negativ, Cellobiose-negativ,
Xylose-positiv,
Salicin-negativ, Ornithin-negativ, Esculin-negativ, alpha-Fucosidase-negativ
und beta-Galactosidase-positiv sind. Besonders bevorzugt ist erfindungsgemäßes Pasteurella
trehalosi, wobei das Pasteurella auch Arabinose-negativ und Trehalose-positiv ist. Bevorzugt
wird ferner erfindungsgemäßes Pasteurella trehalosi,
das je nach dem Biotyp ferner beta(β)-Glucosidase-negativ oder -positiv
ist. Insbesondere bevorzugt wird Mannheimia haemolytica gemäß der Erfindung,
wobei das Mannheimia ferner Arabinose-negativ und Trehalose-negativ
ist. Vorzugsweise sind ferner Mannheimia haemolytica gemäß der Erfindung
auch β-Glucosidase-negativ.
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Aufgrund
dieser charakteristischen Eigenschaften der erfindungsgemäßen Bakterien
sind diese erfindungsgemäßen Bakterien
gegenüber
anderen bekannten bakteriellen Geflügelpathogenen neu (Diseases
of Poultry, Tenth Edition, Herausgeber B. W. Calnek, Iowa State
University Press, Iowa, USA, 1997).
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Eine
weitere bevorzugte Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung besteht in Pasteurella trehalosi und/oder
Mannheimia haemolytica gemäß der Erfindung,
wobei das Geflügel
aus der Gruppe Hühner,
Truthahngeflügel,
Enten, Gänse,
Tauben und Wachteln ausgewählt
ist.
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Erfindungsgemäß wird ein
neuer Typ von gram-negativen, fakultativ anaeroben, pleomorphen,
stabförmigen
Bakterien bereitgestellt, wobei dieser neue Typ von Bakterien durch
die bei der American Type Culture Collection (ATCC), 1081, University
Boulevard, Manassas, VA 20110–2209,
USA unter den folgenden Hinterlegungsnummern hinterlegten Bakterien
charakterisiert ist:
- – Pasteurella trehalosi ATCC
Nr. PTA-3667 (interne Bezeichnung BIV-4985);
- – Pasteurella
trehalosi ATCC Nr. PTA-3668 (interne Bezeichnung BIV-AVICOR);
- – Mannheimia
haemolytica ATCC Nr. PTA-3669 (interne Bezeichnung BIV-07990).
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Hinterlegungstag
ist der 22. August 2001.
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Somit
handelt es sich bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung um Pasteurella trehalosi, das unter der Hinterlegungsnummer
ATCC Nr. PTA-3667 hinterlegt worden ist. Diese Bakterien werden
ferner in Tabelle 3 von Beispiel 1 erläutert.
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Eine
weitere besonders bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden
Erfindung ist Pasteurella trehalosi, das unter der Hinterlegungsnummer
ATCC Nr. PTA-3668 hinterlegt worden ist. Diese Bakterien werden ferner
in Tabelle 2 von Beispiel 1 beschrieben.
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Bei
einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden
Erfindung handelt es sich um Mannheimia haemolytica, das unter der
Hinterlegungsnummer ATCC Nr. PTA-3669 hinterlegt worden ist. Diese
Bakterien werden ferner in Tabelle 1 von Beispiel 1 erläutert.
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Die
Ergebnisse von Tests der Abschnitte A und B in den Beispielen (Tabelle
1, 2 und 3) bestätigen, dass
die Bakterien BIV-4895; ATCC Nr. PTA-3667 und BIV-AVICOR; ATCC Nr.
PTA-3668, zur Familie Pasteurellaceae (Pasteurella trehalosi, die
Trehalose-positiv und Arabinose-negativ sind) gehören, während das
Bakterium BIV-07990; ATCC Nr. PTA-3669 zur Familie Mannheimia (Mannheimia
haemolytica, das Trehalose-negativ und Arabinose-negativ ist) gehört.
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Die
Erfindung betrifft ferner eine mikrobiologische Kultur, die erfindungsgemäße Bakterien
gemäß den vorstehenden
Ausführungen
umfasst. Die Kultur kann hergestellt werden, indem man die Bakterien
bei einer Temperatur von 35 bis 37°C züchtet. Die Bakterien können unter
normalem, atmosphärischem
Sauerstoffdruck gezüchtet
werden. Die Bakterien können
in einer Vielzahl unterschiedlicher, das Bakterienwachstum fördernder
Medien für
allgemeine Zwecke, die dem Fachmann geläufig sind, gezüchtet werden,
z. B. Tryptose-Brühe (TB),
Soja-Trypticasein-Brühe oder
Hirn-Herz-Infusionsbrühe
oder beliebige angereicherte Medien. Die Bakterien können auch
auf Schafblut-Agar, das 24 Stunden bei 37°C inkubiert worden ist, gezüchtet werden.
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Es
sind verschiedene physikalische und chemische Verfahren der bakteriellen
Inaktivierung bekannt. Zu Beispielen für eine physikalische Inaktivierung
gehören
die UV-Bestrahlung, die Röntgenbestrahlung,
die gamma-Bestrahlung und das Erhitzen. Zu Beispielen für inaktivierende
Chemikalien gehören
beta-Propiolacton, Glutaraldehyd, beta-Ethylenimin und Formaldehyd.
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Vorzugsweise
werden die erfindungsgemäßen Bakterien
mit Formaldehyd inaktiviert. Überraschenderweise
stellt die Verwendung von Formaldehyd in einer Endkonzentration
von 0,2% ein hervorragendes Verfahren zur Inaktivierung der erfindungsgemäßen Bakterien
dar.
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Somit
betrifft die vorliegende Erfindung gemäß einem weiteren wichtigen
Aspekt ein Verfahren zur Inaktivierung von erfindungsgemäßen Pasteurella
trehalosi und/oder Mannheimia haemolytica, wobei das Verfahren die
Verwendung von Formaldehyd in einer Endkonzentration von 0,2% umfasst.
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Die
erfindungsgemäßen Bakterien,
die gemäß den vorerwähnten Verfahren
und durch andere Verfahren zum Inaktivieren von Bakterien, die dem
Fachmann geläufig
sind, inaktiviert worden sind, stellen Ausführungsformen der vorliegenden
Erfindung dar. Somit betrifft ein weiterer wichtiger Aspekt der
Erfindung inaktiviertes Pasteurella trehalosi und/oder Mannheimia
haemolytica, die durch ein erfindungsgemäßes Verfahren oder durch ein
dem Fachmann bekanntes Verfahren erhältlich sind. Vorzugsweise werden
inaktiviertes Pasteurella trehalosi und/oder Mannheimia haemolytica
gemäß der Erfindung
aus der Gruppe Pasteurella trehalosi ATCC Nr. PTA-3667, Pasteurella
trehalosi ATCC Nr. PTA-3668 und/oder Mannheimia haemolytica ATCC Nr.
PTA-3669 ausgewählt.
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Somit
besteht ein weiterer wichtiger Aspekt der Erfindung in lebendem,
abgeschwächtem
Pasteurella trehalosi und/oder Mannheimia haemolytica, die durch
ein bekanntes Verfahren erhältlich
sind. Vorzugsweise werden das lebende, abgeschwächte Pasteurella trehalosi
und/oder Mannheimia haemolytica gemäß der Erfindung aus der Gruppe
Pasteurella trehalosi ATCC Nr. PTA-3667, Pasteurella trehalosi ATCC
Nr. PTA-3668 und/oder Mannheimia haemolytica ATCC Nr. PTA-3669 ausgewählt. Dieses
Pasteurella trehalosi und/oder Mannheimia haemolytica gemäß der Erfindung
werden durch mehrfache Passagen in geeigneten Kulturmedien oder
durch beliebige andere bekannte Verfahren abgeschwächt.
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Der
hier verwendete Ausdruck "inaktiviert" bedeutet, dass das
erfindungsgemäße Pasteurella
trehalosi und/oder Mannheimia haemolytica abgetötet worden ist, ohne dass eine
Replikationsmöglichkeit
zur Verursachung einer klinischen Krankheit besteht.
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Der
hier verwendete Ausdruck "abgeschwächt" bedeutet, dass das
erfindungsgemäße Pasteurella
trehalosi und/oder Mannheimia haemolytica ein lebendes Bakterium
mit Replikationsmöglichkeit
darstellt, das aber keine klinische Krankheit verursacht.
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Einen
weiteren wichtigen Aspekt stellen Fraktionen oder Fragmente von
Pasteurella trehalosi und/oder Mannheimia haemolytica dar, die durch
bekannte Verfahren erhältlich
sind. Diese Fragmente können durch
Detergens-Solubilisierung von Pasteurella trehalosi und/oder Mannheimia
haemolytica gemäß der Erfindung
oder durch ein anderes bekanntes Verfahren erhalten werden. Vorzugsweise
handelt es sich bei diesen Fraktionen oder Fragmenten um gereinigte
Antigene von Pasteurella trehalosi und/oder Mannheimia haemolytica
gemäß der Erfindung.
Vorzugsweise handelt es sich bei diesen Fraktionen/Fragmenten um äußere Membranproteine
von Pasteurella trehalosi und/oder Mannheimia haemolytica gemäß der Erfindung.
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Der
Ausdruck "Fragment" bedeutet erfindungsgemäß eine beliebige
immunogene Untereinheit des erfindungsgemäßen Pasteurella trehalosi und/oder
Mannheimia haemolytica, d. h. eine beliebige Polypeptid-Untergruppe.
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Somit
betrifft die Erfindung Fragmente oder Fraktionen, die mindestens
ein Antigen von erfindungsgemäßem Pasteurella
trehalosi und/oder Mannheimia haemolytica enthalten. Insbesondere
enthalten diese Fragmente mindestens ein Antigen von Bakterien,
die aus der Gruppe Pasteurella trehalosi ATCC Nr. PTA-3667, Pasteurella
trehalosi ATCC Nr. PTA-3668 und/oder Mannheimia haemolytica ATCC
Nr. PTA-3669 ausgewählt
sind. Diese Fragmente können
vollständige
Bakterienzellen von einem oder mehreren Stämmen, bakterielle Extrakte, äußere Membranfraktionen,
bakterielle Exo- und/oder Endotoxine und gereinigte Proteine umfassen.
Antigene Polypeptide oder Fragmente davon können beispielsweise aus gereinigten
bakteriellen Proteinen oder durch Expression des entsprechenden
genetischen Materials in einem prokaryontischen oder eukaryontischen
Expressionssystem oder durch organisch-chemische Synthese erhalten
werden. Diese Verfahren sind dem Fachmann geläufig.
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Die
Erfindung betrifft ferner lebende und/oder lebende, abgeschwächte und/oder
inaktivierte Pasteurella trehalosi- und/oder Mannheimia haemolytica-Bakterien gemäß der Erfindung
und/oder Fraktionen dieser Pasteurella trehalosi und/oder Mannheimia
haemolytica zur Verwendung in einem Impfstoff.
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Erfindungsgemäß wird ferner
ein Impfstoff, der sich von den vorstehend definierten, neu identifizierten Bakterien
ableitet, bereitgestellt. Somit betrifft die Erfindung ferner eine
Impfstoffzusammensetzung, die lebendes und/oder lebendes, abgeschwächtes und/oder
inaktiviertes Pasteurella trehalosi und/oder Mannheimia haemolytica
gemäß der Erfindung
und/oder Fraktionen dieses Pasteurella trehalosi und/oder Mannheimia
haemolytica umfasst.
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Der
hier verwendete Ausdruck "Impfstoff" ist als ein Impfstoff
für die
veterinärmedizinische
Verwendung zu verstehen, der antigene Substanzen umfasst und mit
dem Ziel verabreicht wird, eine spezifische und aktive oder passive
Immunität
gegen eine Krankheit, die durch Pasteurella trehalosi und/oder Mannheimia haemolytica
hervorgerufen wird, zu induzieren. Das lebende oder lebende, abgeschwächte Pasteurella
trehalosi und/oder Mannheimia haemolytica gemäß der Erfindung verleihen eine
aktive Immunität,
die passiv über mütterliche
Antikörper
gegen die enthaltenen Immunogene und gelegentlich auch gegen antigenmäßig verwandte
Organismen übertragen
werden kann. Das erfindungsgemäße inaktivierte
Pasteurella trehalosi und/oder Mannheimia haemolytica und/oder Fraktionen
des Pasteurella trehalosi und/oder Mannheimia haemolytica verleihen
passive Immunität.
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Zusätzliche
Komponenten zur Verstärkung
der Immunreaktion sind Bestandteile, die üblicherweise als Adjuvantien
bezeichnet werden, wie Aluminiumhydroxid, Mineralöle und andere Öle oder
Hilfsmoleküle,
die dem Impfstoff zugesetzt werden oder die nach der entsprechenden
Induktion durch derartige zusätzliche
Bestandteile vom Körper
erzeugt werden, wie (ohne Beschränkung
hierauf) Interferone, Interleukine oder Wachstumsfaktoren.
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Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform
umfasst der Impfstoff inaktivierte Bakterien.
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Vorzugsweise
bezieht sich ein erfindungsgemäßer Impfstoff
auf einen Impfstoff gemäß der vorstehenden
Definition, wobei es sich bei einer immunologisch aktiven Komponente
um lebendes Pasteurella trehalosi und/oder Mannheimia haemolytica
handelt. Der Ausdruck "Lebendimpfstoff" bezieht sich auf
einen Impfstoff, der ein Teilchen umfasst, das zur Teilung/Vermehrung
befähigt
ist.
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Vorzugsweise
umfasst ein erfindungsgemäßer Impfstoff
attenuiertes Pasteurella trehalosi und/oder Mannheimia haemolytica
gemäß der Erfindung
und einen pharmazeutisch verträglichen
Träge oder
Exzipiens. Dieser Impfstoff kann auch als ein Kombinationsimpfstoff
verabreicht werden, der zwei oder mehr Stämme dieser lebenden und/oder
lebenden abgeschwächten
und/oder inaktivierten Pasteurella trehalosi- und/oder Mannheimia
haemolytica-Bakterien gemäß der Erfindung
und/oder Fraktionen von zwei oder mehr Stämmen dieser Pasteurella trehalosi-
und/oder Mannheimia haemolytica-Bakterien umfasst. Insbesondere
werden lebendes und/oder lebendes, abgeschwächtes und/oder inaktiviertes
Pasteurella trehalosi und/oder Mannheimia haemolytica gemäß der Erfindung
und/oder Fraktionen dieses Pasteurella trehalosi und/oder Mannheimia haemolytica
im Impfstoff aus der Gruppe Pasteurella trehalosi ATCC Nr. PTA-3667,
Pasteurella trehalosi ATCC Nr. PTA-3668 und/oder Mannheimia haemolytica
ATCC Nr. PTA-3669
ausgewählt.
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Vorzugsweise
umfasst ferner ein erfindungsgemäßer Impfstoff
inaktiviertes Pasteurella trehalosi und/oder Mannheimia haemolytica
gemäß der Erfindung
und einen pharmazeutisch verträglichen
Träger
oder Exzipiens. Dieser Impfstoff kann auch als ein Kombinationsimpfstoff
verabreicht werden, der zwei oder mehr Stämme von inaktiviertem Pasteurella
trehalosi und/oder Mannheimia haemolytica umfasst.
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Ferner
können
Fraktionen von vollständigen
Zellen ebenfalls als einschlägiges
Immunogen im erfindungsgemäßen Impfstoff
verwendet werden. Daher umfasst vorzugsweise ein erfindungsgemäßer Impfstoff Fraktionen
von Pasteurella trehalosi und/oder Mannheimia haemolytica gemäß der Erfindung
und einen pharmazeutisch verträglichen
Träger
oder Exzipiens. Dieser Impfstoff kann als ein Kombinationsimpfstoff
verabreicht werden, der zwei oder mehr Stämme des inaktivierten Pasteurella
trehalosi und/oder Mannheimia haemolytica umfasst.
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Insbesondere
betrifft die Erfindung Impfstoffe, die Fragmente oder Fraktionen
umfassen, die mindestens ein Antigen von erfindungsgemäßen Pasteurella
trehalosi und/oder Mannheimia haemolytica enthalten. Ganz besonders
betrifft die Erfindung Impfstoffe, die Fragmente umfassen, die mindestens
ein Antigen von Bakterien enthalten, die aus der Gruppe Pasteurella
trehalosi ATCC Nr. PTA-3667, Pasteurella trehalosi ATCC Nr. PTA-3668
und/oder Mannheimia haemolytica ATCC Nr. PTA-3669 ausgewählt sind. Dieses Fragment kann vollständige bakterielle
Zellen, bakterielle Extrakte, äußere Membranfraktionen,
bakterille Exo- oder Endotoxine und gereinigte Proteine umfassen.
Antigene Polypeptide oder Fragmente davon können beispielsweise aus gereinigten
bakteriellen Proteinen oder durch Expression des entsprechenden
genetischen Materials in prokaryontischen oder eukaryontischen Expressionssystemen
oder durch organisch-chemische Synthese erhalten werden. Diese Verfahren
sind dem Fachmann geläufig.
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Vorzugsweise
umfasst der erfindungsgemäße Impfstoff
auch ein Adjuvans. Daher betrifft die Erfindung ferner eine Impfstoffzusammensetzung
gemäß der Erfindung,
die ferner ein oder mehr geeignete Adjuvantien und/oder Exzipientien
und/oder Träger
enthält.
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Die
hier verwendeten Adjuvantien umfassen Substanzen, die die Immunreaktion
des der Injektion unterzogenen Tiers auffrischen. Eine Anzahl verschiedener
Adjunvantien ist aus dem Stand der Technik bekannt. Die hier verwendeten
Adjuvantien umfassen komplettes und inkomplettes Adjuvans gemäß Freund,
Vitamin E, nicht-ionische Blockcopolymere, Muramyldipeptide, Quil
A, mineralische und nicht-mineralische Öle, pflanzliche Öle und Carbopol
(ein Homopolymeres). Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform
umfasst der erfindungsgemäße Impfstoff
ein Wasser-in-Öl-Emulsions-Adjuvans.
Ein derartiger Impfstoff wird auch als Bakterin bezeichnet, das
inaktivierte (abgetötete)
Bakterien gemäß der Erfindung
und ein Wasser-in-Öl-Emulsions-Adjuvans
umfasst. Weitere Wege zur Unterstützung der Bakterien, die dem
Fachmann geläufig
sind, sind ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
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Ferner
kann der erfindungsgemäße Impfstoff
vorzugsweise ein oder mehr geeignete Emulgatoren, z. B. Span oder
Tween, enthalten.
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Vorzugsweise
werden das lebende und/oder lebende, abgeschwächte und/oder inaktivierte
Pasteurella trehalosi und/oder Mannheimia haemolytica gemäß der Erfindung
und/oder Fraktionen des Pasteurella trehalosi und/oder Mannheimia
haemolytica im Impfstoff aus der Gruppe Pasteurella trehalosi ATCC
Nr. PTA-3667, Pasteurella trehalosi ATCC Nr. PTA-3668 und/oder Mannheimia
haemolytica ATCC Nr. PTA-3669 ausgewählt.
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Vorzugsweise
umfasst der erfindungsgemäße Impfstoff
mindestens ein Antigen aus Bakterien, die aus der Gruppe Pasteurella
trehalosi ATCC Nr. PTA-3667, Pasteurella trehalosi ATCC Nr. PTA-3668
und/oder Mannheimia haemolytica ATCC Nr. PTA-3669 ausgewählt sind.
Dieser Impfstoff kann vollständige
bakterielle Zellen dieser Stämme,
Bakterienextrakte, äußere Membranfraktionen,
bakterielle Exo- und/oder
Endotoxine und gereinigte Proteine umfassen. Antigene Polypeptide
oder Fragmente davon können
beispielsweise aus gereinigten bakteriellen Proteinen oder durch
Expression des entsprechenden genetischen Materials in prokaryontischen
oder eukaryontischen Expressionssystemen oder durch organisch-chemische
Synthese erhalten werden. Diese Verfahren sind dem Fachmann geläufig.
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Insbesondere
betrifft die Erfindung ferner eine Impfstoffzusammensetzung gemäß der Erfindung,
die ferner mindestens ein weiteres Antigen aus einem Virus oder
Mikroorganismus, die für
Geflügel
pathogen sind, umfasst. Vorzugsweise liegt dieses Antigen in Form
von lebenden, abgeschwächten
oder inaktivierten Viren oder Mikroorganismen oder Fragmenten davon
vor. Dieses Fragment kann vollständige
bakterielle Zellen oder virale Teilchen, bakterielle Extrakte, virale
Antigene, virale Untereinheiten, äußere Membranfraktionen, bakterielle
Exo- und/oder Endotoxine und gereinigte Proteine umfassen. Antigene
Polypeptide oder Fragmente davon können beispielsweise aus gereinigten
bakteriellen Proteinen oder durch Expression des entsprechenden genetischen
Materials in prokaryontischen oder eukaryontischen Expressionssystemen
oder durch organisch-chemische Synthese erhalten werden. Diese Verfahren
sind dem Fachmann geläufig.
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Insbesondere
betrifft die vorliegende Erfindung eine erfindungsgemäße Impfstoffzusammensetzung, die
ferner mindestens ein weiteres Antigen aus einem Virus oder Mikroorganismus,
die für
Geflügel
pathogen sind, umfasst, wobei das Virus oder der Mikroorganismus
aus der folgenden Gruppe (ohne Beschränkung hierauf) ausgewählt ist:
infektiöses
Bronchitis-Virus, Newcastle-Krankheit-Virus, infektiöses Schleimbeutelkrankheit-Virus
(Krankheit: Gumboro), Hühneranämie-Erreger, Vogel-Reovirus,
Mycoplasma gallisepticum, Vogel-Pneumovirus, Haemophilus paragallinarum
(Krankheit: Coryza), Hühner-Pockenvirus,
Vogel-Encephalomyelitis-Virus,
Pasteurella multocida und E. coli.
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Eine "pharmazeutische Zusammensetzung" besteht im wesentlichen
aus einem oder mehreren Bestandteilen, die zur Modifikation von
physiologischen, z. B. immunologischen Funktionen des Organismus, dem
sie verabreicht wird, oder von Organismen, die im oder auf dem Organismus
leben, befähigt
sind. Der Ausdruck umfasst (ohne Beschränkung hierauf) Antibiotika
oder Antiparasitika sowie andere Bestandteile, die üblicherweise
verwendet werden, um bestimmte Ziele zu erreichen, z. B. (ohne Beschränkung hierauf)
Bearbeitung von Merkmalen, Sterilität, Stabilität, Möglichkeit zur Verabreichung
der Zusammensetzung über
enterale oder parenterale Wege, wie oral, intranasal, intravenös, intramuskulär, subkutan,
intradermal oder ein anderer geeigneter Weg, Verträglichkeit
nach der Verabreichung und kontrollierte Freisetzungseigenschaften. Somit
betrifft ein weiterer wichtiger Aspekt der Erfindung eine pharmazeutische
Zusammensetzung, die ein lebendes und/oder lebendes, abgeschwächtes und/oder
inaktiviertes Pasteurella trehalosi und/oder Mannheimia haemolytica
gemäß der Erfindung
und/oder Fraktionen dieses Pasteurella trehalosi und/oder Mannheimia haemolytica
umfasst.
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Die
Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Behandlung eines mit
Pasteurella trehalosi und/oder Mannheimia haemolytica infizierten
Tiers (z. B. mit den lebenden Bakterien gemäß der vorstehenden Beschreibung),
wobei das Tier zur Gruppe von Geflügeltieren gehört, wobei
das lebende, abgeschwächte,
inaktivierte Pasteurella trehalosi und/oder Mannheimia haemolytica
gemäß der Erfindung
und/oder Fraktionen und/oder Fragmente davon gemäß der Erfindung (wie vorstehend
beschrieben) dem behandlungsbedürftigen
Geflügeltier
in ausreichenden Dosen, die dem Fachmann bekannt sind, verabreicht
werden, wobei die Verringerung der Symptome, die durch die Infektion
durch Pasteurella trehalosi und/oder Mannheimia haemolytica hervorgerufen
werden, überwacht
wird. Diese Behandlung kann vorzugsweise wiederholt werden.
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Eine
weitere wichtige Ausführungsform
besteht in einem Verfahren zum Immunisieren von Geflügel gegen
die Krankheit des Atmungstrakts und des reproduktiven Trakts, die
durch Pasteurella trehalosi und/oder Mannheimia haemolytica (z.
B. durch die vorstehend beschriebenen lebenden Bakterien) hervorgerufen
wird, wobei die Behandlung die Verabreichung einer immunologisch
wirksamen Menge eines erfindungsgemäßen Impfstoffes und die Überwachung
der Verringerung der Symptome, die durch die Infektion durch Pasteurella trehalosi
und/oder Mannheimia haemolytica hervorgerufen werden, umfasst.
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Eine
weitere wichtige Ausführungsform
besteht in der Verwendung eines erfindungsgemäßen inaktivierten Pasteurella
trehalosi und/oder Mannheimia haemolytica und/oder eines erfindungsgemäßen lebenden Pasteurella
trehalosi und/oder Mannheimia haemolytica und/oder eines erfindungsgemäßen lebenden,
abgeschwächten
Pasteurella trehalosi und/oder Mannheimia haemolytica gemäß der Erfindung
und/oder von Fragmenten oder Fraktionen des erfindungsgemäßen Pasteurella
trehalosi und/oder Mannheimia haemolytica bei der Herstellung eines
Impfstoffes für
die Prophylaxe von Pasteurella trehalosi- und/oder Mannheimia haemolytica-Infektionen.
-
Die
Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Diagnose einer Krankheit,
das die folgenden Stufen umfasst: Das Gewinnen einer Probe aus Geflügel, wobei
die Probe aus der Gruppe Blut, Serum, Plasma, Gewebeabschabungen,
Waschflüssigkeiten,
Abstriche und Gewebe besteht, und das Analysieren der Probe auf
die Anwesenheit von erfindungsgemäßem Pasteurella trehalosi und/oder
Mannheimia haemolytica.
-
In
einer bevorzugten Ausführungsform
wird die Anwesenheit von Pasteurella trehalosi und/oder Mannheimia
haemolytica durch einen Immuntest bestimmt. Ein Immuntest bedient
sich monoklonaler Antikörper oder
monoklonaler Antiseren, die für
Pasteurella trehalosi und/oder Mannheimia haemolytica spezifisch
sind. Die Erzeugung von monoklonalen Antikörpern ist aus dem Stand der
Technik bekannt (3, 4).
-
Immuntests
umfassen die vorstehend beschriebenen Verfahren, wie den ELISA-Test
(enzymgebundener Immunosorbens-Test) oder den so genannten Sandwich-ELISA-Test,
Dot-Blots, Immunoblots, Radioimmuntests (Radioimmunoassay, RIA),
den auf Diffusion basierenden Ouchterlony-Test, Raketen-Immunofluoreszenztests
oder Agglutinationstests (rascher Platten- oder Mikroplatten-Agglutinationstest).
Ein weiterer Immuntest ist der so genannte Western-Blot (auch bekannt
als Western-Transferverfahren oder Western-Blotting). Der Zweck
des Western-Blots besteht in der Übertragung von Proteinen oder
Polypeptiden, die durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese aufgetrennt
worden sind, auf ein Nitrocellulosefilter oder einen anderen geeigneten
Träger
und gleichzeitig in der Bestimmung der relativen Position der Proteine
oder Polypeptide, die durch Gelelektrophorese erhalten worden sind.
Der Western-Blot wird sodann mit einem Antikörper inkubiert, der spezifisch
an das in Betracht kommende Protein oder Polypeptid bindet. Diese
Nachweisverfahren können vom
Fachmann zur Ausführung
der hier beschriebenen Erfindung herangezogen werden. Nachstehend
sind Literaturstellen aufgeführt,
in denen der Fachmann die vorstehend erwähnten Verfahren und weitere
Nachweisverfahren findet.: An Introduction to Radioimmunoassay and
Related Techniques, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, Niederlande
(1986); Bullock et al., Techniques in Immunocytochemistry, Academic
Press, Orlando, FL, Bd. 1 (1982), Bd. 2 (1983), Bd. 3 (1985); Tijssen,
Practice and Theory of Enzyme Immunoassays: Laborstory Techniques
in Biochemistry and Molecular Biology, Elsevier Science Publishers,
Amsterdam, Niederlande (1985).
-
Gemäß einer
weiteren, besonders speziellen Ausführungsform wird die vorstehend
beschriebene Probe mit Antikörpern
inkubiert, die spezifisch für
Pasteurella trehalosi und/oder Mannheimia haemolytica sind, und
der dabei gebildete Antigen/Antikörper-Komplex wird bestimmt.
-
Bei
einer besonders bevorzugten Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
wird die Anwesenheit von Pasteurella trehalosi und/oder Mannheimia
haemolytica in einer Probe gemäß den vorstehenden
Ausführungen
durch molekularbiologische Verfahren bestimmt. Unter dem hier verwendeten
Ausdruck "molekularbiologische
Verfahren" sind
Nachweisverfahren zu verstehen, die beispielsweise die Polymerase-Kettenreaktion
(PCR), die reverse Transcriptase- Polymerase-Kettenreaktion
(RT-PCR) oder die Northern- oder Southern-Blots umfassen und die
der Fachmann in Standardwerken findet (z. B. Sambrook et al., Molecular
Cloning: A Laborstory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laborstory
Press, Cold Spring Harbor, New York (1989); und S. Bertram und H.
G. Gassen, Gentechnissche Methoden, G. Fischer Verlag, Stuttgart,
New York (1991)).
-
Die
Erfindung umfasst ferner ein diagnostisches Testkit gemäß der Erfindung,
das dadurch gekennzeichnet ist, dass es sämtliche für den Nachweis von Pasteurella
trehalosi und/oder Mannheimia haemolytica erforderlichen Bestandteile
enthält.
-
Bei
einem diagnostischen Testkit handelt es sich um eine Ansammlung
sämtlicher
Komponenten zur Durchführung
des erfindungsgemäßen Diagnoseverfahrens.
Zu einigen Beispielen (nicht-erschöpfende Aufzählung) von weiteren Bestandteilen
zur Durchführung
eines erfindungsgemäßen Verfahrens
gehören
Behälter,
wie Platten mit 96 Vertiefungen oder Mikrotiterplatten, Teströhrchen,
weitere geeignete Behälter,
Oberflächen
und Substrate, Membranen, wie Nitrocellulose-Filter, Waschreagenzien
und Puffer. Ein diagnostisches Testkit kann auch Reagenzien enthalten,
die gebundene Antikörper
erfassen, z. B. markierte sekundäre
Antikörper,
Chromophore, Enzyme (z. B. mit Antikörpern konjugiert) und Substrate
davon oder andere Substanzen, die zur Bindung von Antikörpern befähigt sind.
-
Die
Erfindung umfasst ferner ein erfindungsgemäßes diagnostisches Testkit,
das dadurch gekennzeichnet ist, dass es sämtliche zur Durchführung einer
PCR oder RT-PCR zum Nachweis von Pasteurella trehalosi- und/oder
Mannheimia haemolytica-spezifischer DNA oder -RNA erforderlichen
Bestandteile enthält. Dieses
Kit kann (ohne Beschränkung
hierauf) zusätzlich
zu Teströhrchen
oder Platten mit 96 Vertiefungen oder Mikrotiterplatten weitere
geeignete Behälter,
Oberflächen
und Substrate, Membranen, wie Nitrocellulosefilter, Waschreagenzien
und Reaktionspuffer (die in bezug auf pH-Wert und Magnesiumkonzentrationen
variieren können),
steriles Wasser, Mineralöl,
BSA (Rinderserumalbumin), MgCl2, (NH4)2SO4,
DMSO (Dimethylsulfoxid), Mercaptoethanol, Nucleotide (dNTPs), Enyzme,
wie Taq-Polymerase und reverse Transcriptase und als DNA-Matrix
die für
Pasteurella trehalosi- und/oder Mannheimia haemolytica-spezifische
DNA oder cDNA, für Pasteurella
trehalosi- und/oder Mannheimia haemolytica-DNA oder -RNA spezifische
Oligonucleotide, Kontrollmatrizen, DEPC-Wasser, DNAse, RNAse und
ferner dem Fachmann geläufige
Verbindungen enthalten. Erfindungsgemäße Oligonucleotide sind kurze
Nucleinsäuremoleküle mit einer
Länge von
etwa 15 bis etwa 100 Nucleotiden, die unter stringenten Bedingungen
an die Nucleinsäuresequenz
binden, die komplementär zu
einem Pasteurella trehalosi- und/oder
Mannheimia haemolytica-Protein ist. Unter stringenten Bedingungen versteht
der Fachmann Bedingungen, die eine Selektion auf eine Homologie
von mehr als 85% und vorzugsweise von mehr als 90% vornehmen (vergl.
Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laborstory Manual, 2. Auflage,
Cold Spring Harbor Laborstory Press, Cold Spring Harbor, New York
(1989); und S. Bertram und H. G. Gassen, Gentechnische Methoden,
G. Fischer Verlag, Stuttgart, New York, 1991).
-
Die
folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der vorliegenden Erfindung,
sind aber nicht als Beschränkung
des Schutzumfangs der Erfindung anzusehen.
-
Beispiel 1
-
Ausbruch
der mit Pasteurella trehalosi und/oder Mannheimia haemolytica assoziierten
Krankheit unter Feldbedingungen Klinische
Anzeichen
Aus Feldbeobachtungen
Legehennen | Broiler |
milde
Symptome des oberen Atmungstrakts/reproduktiven Trakts | schwere
Symptome des oberen Atmungstrakts/reproduktiven Trakts |
Alter:
22 Wochen | Alter:
7 Wochen |
nasale
Ausscheidung | Niesen
mit Raschelgeräuschen |
geschwollene
Bereiche rund um die Augen | geschwollener
Kopf |
geringe
Nahrungsaufnahme | geringe
Nahrungsaufnahme |
weißlicher
Durchfall | Mattheit |
verringerte
Eierzeugung | ungleichmäßiges Wachstum |
geringe
Mortalität | zerzauste
Federn |
verschobener
Kamm | Prostration |
Cyanose
des Kamms | Mortalität: 8% |
Starke
Läsionen | |
Eierstockatrophie
mit Hämorrhagien
und Regression | Hämorrhagien
in den Gonaden |
Deformierte
Ovarialfollikel | Oberer
Bereich der Luftröhre
mit Hämorrhagien |
Vergrößerte Leber | Vergrößerte Leber
mit Hämorrhagien |
Entzündung der
Nieren | Luft-Sakkulitis |
Hämorrhagien
im abdominalen Fett | Vergrößerte Milz
mit Hämorrhagien |
Hämorrhagien
in der Thoraxhöhle | Hämorrhagien
in den Muskeln |
Hämorrhagien
im Eileiter | Hämorrhagien
in Herz und Hydropericard |
Hämorrhagien
im Koronarfett | Hämorrhagien
in der Thoraxhöhle |
-
Drei
Stämme
eines neuartigen Typs von gram-negativen, fakultativ anaeroben,
pleomorphen, stabförmigen
Bakterien wurden bei der American Type Culture Collection (ATCC),
1081, University Boulevard, Manassas, VA 20110–2209, USA, unter den folgenden
Hinterlegungsnummern hinterlegt: ATCC Nr. PTA-3667 für BIV-4985 Pasteurella
trehalosi; ATCC Nr. PTA-3668 für
BIV-AVICOR Pasteurella trehalosi und ATCC Nr. PTA-3669 für BIV-07990,
Mannheimia haemolytica. Hinterlegungstag ist der 22. August 2001.
-
Die
hinterlegten Bakterien wurden gemäß typischen Bestimmungsverfahren
typisiert, wobei man sich des Bergey's Manual of Systematic Bacteriology,
Bd. I (1984), Williams and Wilkins, 428 East Preston Street, Baltimore,
USA) bediente.
-
Tabelle 1
-
Mannheimia haemolytica: BIV-07990 (Biotyp
1); ATCC Nr. PTA-3669
-
Makroskopische Morphologie
-
Kolonien,
die 24 Stunden auf Schafblut-Agar gezüchtet worden sind, weisen einen
Durchmesser im Bereich von 1,0 bis 1,5 mm auf, sind hell durchscheinend,
geringfügig
konvex, glatt und cremig und zeigen β-Hämolyse.
-
Mikroskopische Morphologie
-
Gram-negative,
nicht-bewegliche, pleomorphe Stäbchen,
die häufig
eine bipolare Färbung
zeigen.
-
Biochemische und andere Tests
-
Abschnitt A
Test | Reaktion |
Oxidase | + |
Katalase | + |
Indol | – |
Glucose | + |
Saccharose | + |
MacConkey | + |
Urease | – |
Nitrat | + |
Abschnitt B
Maltose | + |
Mannit | + |
Arabinose | – |
Cellobiose | – |
Sorbit | + |
Xylose | + |
Trehalose | – |
Salicin | – |
Ornithin | – |
Esculin | – |
β-Glucosidase | – |
α-Fucosidase | – |
β-Galactosidase | + |
-
Tabelle 2
-
Pasteurella trehalosi: BIV-AVICOR (Biotyp
2); ATCC Nr. PTA-3668
-
Makroskopische Morphologie
-
Kolonien,
die 24 Stunden auf Schafblut-Agar gezüchtet worden sind, weisen einen
Durchmesser im Bereich von 1,0 bis 1,5 mm auf, sind hell durchscheinend,
geringfügig
konvex, glatt und cremig und zeigen β-Hämolyse.
-
Mikroskopische Morphologie
-
Gram-negative,
nicht-bewegliche, pleomorphe Stäbchen,
die häufig
eine bipolare Färbung
zeigen.
-
Biochemische und andere Tests
-
Abschnitt A
Test | Reaktion |
Oxidase | + |
Katalase | + |
Indol | – |
Glucose | + |
Saccharose | + |
MacConkey | + |
Urease | – |
Nitrat | + |
Abschnitt B
Maltose | + |
Mannit | + |
Arabinose | – |
Cellobiose | – |
Sorbit | + |
Xylose | + |
Trehalose | + |
Salicin | – |
Ornithin | – |
Esculin | – |
β-Glucosidase | +α |
α-Fucosidase | – |
β-Galactosidase | + |
-
Tabelle 3
-
Pasteurella trehalosi: BIV-4895 (Biotyp
4); ATCC Nr. PTA-3667
-
Makroskopische Morphologie
-
Kolonien,
die 24 Stunden auf Schafblut-Agar gezüchtet worden sind, weisen einen
Durchmesser im Bereich von 1,0 bis 1,5 mm auf, sind hell durchscheinend,
geringfügig
konvex, teilchenförmig
und trocken und zeigen β-Hämolyse.
-
Mikroskopische Morphologie
-
Gram-negative,
nicht-bewegliche, pleomorphe Stäbchen,
die häufig
eine bipolare Färbung
zeigen.
-
Biochemische und andere Tests
-
Abschnitt A
Test | Reaktion |
Oxidase | + |
Katalase | + |
Indol | – |
Glucose | + |
Saccharose | + |
MacConkey | + |
Urease | – |
Nitrat | + |
Abschnitt
Maltose | – |
Mannit | + |
Arabinose | – |
Cellobiose | – |
Sorbit | + |
Xylose | + |
Trehalose | + |
Salicin | – |
Ornithin | – |
Esculin | – |
β-Glucosidase | – |
α-Fucosidase | – |
β-Galactosidase | + |
-
Die
Ergebnisse der Tests von Abschnitt A und B (Tabellen 1, 2 und 3)
bestätigen,
dass die Bakterien BIV-4895; ATCC Nr. PTA-3667 und BIV-AVICOR; ATCC
Nr. PTA-3668 zur Familie Pasteurellaceae gehören (Pasteurella trehalosi,
die Trehalose-positiv und Arabinose-negativ sind), während die
Bakterien BIV-07990; ATCC Nr. PTA-3669 zur Familie Mannheimia gehören (Mannheimia
haemolytica, die Trehalose-negativ und Arabinose-negativ sind).
-
Identifikation des Erregers
-
Bakterien
wurden aus infizierten Luftröhren,
Gaumenspalten, Ovarien, Leber, Herz, Nieren und Gonaden (Broiler)
isoliert. Sie wurden auf der Grundlage der nachstehend aufgeführten Tests
als Pasteurella trehalosi und Mannheimia haemolytica identifiziert:
beta-Hämolyse | + |
gram-Färbung | – |
Oxidase | + |
Katalase | + |
Mac
Conkey | + |
Urease | – |
Nitrat | + |
Indol | – |
-
Es
wurde keine Isolierung von Viren oder anderer Bakterien durchgeführt.
-
Biotypisierung
-
Bakterielle
Isolate wurden gereinigt und gemäß dem Verfahren
von Jaworski et al. (1) biotypisiert. Drei verschiedene Biotypen
(4, 2, 1) wurden identifiziert. Kurz zusammengefasst, wurde aus
den gereinigten Isolaten eine einzige Kolonie auf Röhrchen mit
einem Gehalt an 3 ml Tryptose-Brühe
inokuliert und 8 Stunden bei 37°C
inkubiert. Eine Öse
mit Inoculum (20 μl)
aus dem Röhrchen
wurde sodann auf ein weiteres Röhrchen
mit einem Gehalt an 3 ml von 1% des zu testenden Zuckers übertragen
und 7 Tage bei 37°C
inkubiert, wonach die Ergebnisse aufgezeichnet wurden.
-
Belastungsmodell
-
Im
Anschluss an die Reinigung der Bakterien wurden Isolate in Tryptose-Medium gezüchtet, um
große Mengen
an reinen Pathogenen zu erhalten. Um die Koch-Postulate zu verifizieren,
wurden drei verschiedene Gruppen (20 Vögel pro Gruppe) von speziellen,
pathogenfreien (SPF) Hühnern
im Alter von 13 Wochen mit jedem Biotyp (0,2 ml/Vogel; 3 × 108 CFU/ml) auf intravenösem Weg infiziert. Die Vögel wurden
täglich
drei Tage lang auf Morbidität
und Mortalität
beobachtet. Nach dem dritten Tag wurden sämtliche Vögel getötet. Die Läsionen wurden nach dem Tod
aufgezeichnet und Organproben (Leber und Gonaden) wurden zur Reisolierung gewonnen.
Die post mortem-Läsionen
der eingegangenen Vögel
wurden ebenfalls aufgezeichnet.
-
Ergebnisse
-
Klinische
Symptome: Erschöpfung,
Lahmen, verschobener Kamm, zerzauste Federn, Cyanose an der Kammspitze. Läsionen:
Läsion | BIV-4895
(Biotyp 4) | BIV-AVICOR
(Biotyp 2) | BIV-07990
(Biotyp 1) |
| | | |
Herzödem | 73% | 37% | 90% |
Herzhämorrhagien | 90% | - | 70% |
Hämorrhagien
im Koronarfett | 90% | 37% | 50% |
Perikarditis | 73% | 46% | 30% |
Hämorrhagien
in der Thoraxhöhle | - | 19% | 40% |
Hämorrhagien
im Eierstock | 64% | 9% | 20% |
Entzündung der
Nieren | 64% | 46% | 60% |
Hämorrhagien
in den Nieren | 55% | 46% | 20% |
Vergrößerte Leber
mit Hämorrhagien | - | 73% | - |
Bildung
von Luftsäcken | 64% | - | - |
Hämorrhagien
im Muskel | - | 37% | - |
Mortalität | 46% | 19% | - |
-
Beispiel II
-
Wachstum der erfindungsgemäßen Bakterien,
Herstellung des Impfstoffes und Impfung von SPF-Vögeln.
-
Stämme wurden
auf Tryptose-Brühe
(TB) gezüchtet.
Die Ernte wurde in der logarithmischen Wachstumsphase etwa 6 bis
8 Stunden nach der Inokulation, und zwar in Abhängigkeit vom Stamm, durchgeführt. Die
Auszählung
der Platten wurde in Schafblut-Agar für die Titration durchgeführt. Die
kolonienbildenden Einheiten pro Milliliter (CFU/ml) wurden unter
Verwendung von 1:10-Verdünnungen
des Erntematerials bestimmt. Zellen wurden durch Zugabe von Formaldehyd
bis zu einer Endkonzentration von 0,2% abgetötet. Nach einer Sterilitätsprüfung dieser
Suspension wurde der endgültige
Impfstoff mit einem minimalen Titer von 108 CFU/ml versetzt.
-
Der
Impfstoff wurde durch Vermischen der beiden Stämme (BIV-4895, ATCC Nr. PTA-3667
und BIV-AVICOR, ATCC Nr. PTA-3668) und Öl-Adjuvans (eine Wasser-in-Öl-Emulsion
auf der Basis eines Mineralöls
in einem Verhältnis
von 60% Öl/40%
Wasser) bis zu einer minimalen Konzentration von 107,0 CFU/Stamm/ml
hergestellt.
-
Spezielle
pathogenfreie (SPF) Hühner
wurden im Alter von 2, 5 und 9 Wochen durch Injektion von 0,5 ml
Impfstoff auf subkutanem Weg auf halber Höhe des Halses geimpft.
-
Beispiel III
-
Herstellung von Belastungsstämmen und
Belastung von geimpften und Kontrollgruppen
-
Die
bakteriellen Stämme
BIV-4895, ATCC Nr. PTA-3667 und BIV-AVICOR, ATCC Nr. PTA-3668 wurden
24 Stunden bei 37°C
auf Schafblut-Agar gezüchtet.
Die Zellen wurden in Tryptose-Brühe
(TB) geerntet, nachdem eine Suspension mit einer optischen Dichte
von 2,0 erhalten worden war, was mit einem Spektrophotometer bei
einer Wellenlänge
von 540 nm bestimmt wurde. Für
die Belastung wurden Präparate
hergestellt, die die nachstehend angegebene Anzahl an Zellen im
endgültigen
Belastungsvolumen enthielten:
3 × 109 CFU/ml
BIV-AVICOR; ATCC Nr. PTA-3668
1,45 × 1010 CFU/ml
BIV-4895, ATCC Nr. PTA-3667
-
Im
Alter von 13 Wochen wurden 20 geimpfte und 20 nicht geimpfte Vögel auf
intravenösem
Weg durch Verabreichen von 0,2 ml Inoculum (mindestens 10
8,0 CFU/Vogel) belastet. Die Vögel wurden
3 Tage lang auf Morbidität
und Mortalität
beobachtet. Nach der 3-tägigen
Beobachtung wurden sämtliche
verbleibenden Vögel getötet und
eine Reisolierung der Bakterien aus Leber und Gonaden wurde bei
jedem Vogel durchgeführt.
Die post-mortem-Läsionen
der Vögel,
die eingegangen waren, wurden ebenfalls aufgezeichnet. Ergebnisse
Gruppe
von Vögeln | Belastungsinokulum | Mortalität + Reisolierung | Schutz,
% |
negative
Kontrolle | N/A | 0 | N/A |
positive
Kontrolle | ATCC
Nr. PTA-3667 | 77 | 23 |
positive
Kontrolle | ATCC
Nr. PTA-3668 | 54 | 46 |
Impfgruppe | ATCC
Nr. PTA-3667 | 0 | 100 |
Impfgruppe | ATCC
Nr. PTA-3668 | 5 | 95 |
-
Beispiel IV
-
Wachstum der erfindungsgemäßen Bakterien,
Herstellung des Impfstoffes und Impfung von SPF-Vögeln
-
Stämme wurden
auf Tryptose-Brühe
(TB) gezüchtet.
Die Ernte wurde in der logarithmischen Wachstumsphase etwa 6 bis
8 Stunden nach der Inokulation, und zwar in Abhängigkeit vom Stamm, durchgeführt. Die
Auszählung
der Platten wurde in Schafblut-Agar für die Titration durchgeführt. Die
kolonienbildenden Einheiten pro Milliliter (CFU/ml) wurden unter
Verwendung von 1:10-Verdünnungen
des Erntematerials bestimmt. Zellen wurden durch Zugabe von Formaldehyd
bis zu einer Endkonzentration von 0,2% abgetötet. Nach einer Sterilitätsprüfung dieser
Suspension wurde der endgültige
Impfstoff mit einem minimalen Titer von 108 CFU/ml versetzt.
-
Der
Impfstoff wurde durch Vermischen der drei Stämme (BIV-4895, ATCC Nr. PTA-3667,
BIV-AVICOR, ATCC Nr. PTA-3668 und BIV-07990, ATCC Nr. PTA-3669)
und Öl-Adjuvans
(eine Wasser-in-Öl-Emulsion
auf der Basis eines Mineralöls
in einem Verhältnis
von 60% Öl/40%
Wasser) bis zu einer minimalen Konzentration von 107,0 CFU/Stamm/ml
hergestellt.
-
Spezielle
pathogenfreie (SPF) Hühner
wurden im Alter von 2, 5 und 9 Wochen durch Injektion von 0,5 ml
Impfstoff auf subkutanem Weg auf halber Höhe des Halses geimpft.
-
Beispiel V
-
Herstellung von Belastungsstämmen und
Belastung von geimpften Gruppen und Kontrollgruppen
-
Die
bakteriellen Stämme
BIV-4895, ATCC Nr. PTA-3667, BIV-AVICOR, ATCC Nr. PTA-3668 und BIV-07990,
ATCC Nr. PTA-3669 wurden 24 Stunden bei 37°C auf Schafblut-Agar gezüchtet. Die
Zellen wurden in Tryptose-Brühe
(TB) geerntet, nachdem eine Suspension mit einer optischen Dichte
von 2,0 erhalten worden war, was mit einem Spektrophotometer bei
einer Wellenlänge
von 540 nm bestimmt wurde. Für
die Belastung wurden Präparate
hergestellt, die die nachstehend angegebene Anzahl an Zellen im
endgültigen
Belastungsvolumen enthielten:
8,3 × 109 CFU/ml
BIV-AVICOR; ATCC Nr. PTA-3668
2,2 × 109 CFU/ml
BIV-4895, ATCC Nr. PTA-3667
1,0 × 1010 CFU/ml
BIV-07990; ATCC Nr. PTA-3669
-
Im
Alter von 13 Wochen wurden 20 geimpfte und 20 nicht geimpfte Vögel auf
intravenösem
Weg durch Verabreichen von 0,2 ml Inoculum (mindestens 10
8,0 CFU/Vogel) belastet. Die Vögel wurden
3 Tage lang auf Morbidität
und Mortalität
beobachtet. Nach der 3-tägigen
Beobachtung wurden sämtliche
verbleibenden Vögel getötet und
eine Reisolierung der Bakterien aus Leber und Gonaden wurde bei
jedem Vogel durchgeführt.
Die post-mortem-Läsionen
der Vögel,
die eingegangen waren, wurden ebenfalls aufgezeichnet. Ergebnisse
Gruppe
von Vögeln | Belastungsinokulum | Mortalität + Reisolierung | Schutz,
% |
geimpfte
negative Kontrollgruppe | N/A | 0 | N/A |
ungeimpfte
negative Kontrollgruppe | N/A | 0 | N/A |
geimpfte
Gruppe | ATCC
Nr. PTA-3669 | 27,3 | 72,7 |
geimpfte
Gruppe | ATCC
Nr. PTA-3668 | 20,9 | 79,1 |
geimpfte
Gruppe | ATCC
Nr. PTA-3667 | 16,7 | 83,7 |
positive
Kontrollgruppe | ATCC
Nr. PTA-3669 | 53,3 | 46,7 |
positive
Kontrollgruppe | ATCC
Nr. PTA-3668 | 53,3 | 46,7 |
positive
Kontrollgruppe | ATCC
Nr. PTA-3667 | 64,3 | 35,7 |
-
Serologischer Test
-
Hyperimmunseren
wurden in Kaninchen gemäß dem Verfahren
von Biberstein et al. (2) mit einem jeden Biotyp repräsentierenden
Isolat hergestellt.
-
Die
Isolate wurden über
Nacht aus Blutagar gezüchtet,
sodann in Kochsalzlösung
mit einem Gehalt an 0,3% Formalin geerntet. Die Zellen wurden einmal
gewaschen und für
die Injektion auf eine Durchlässigkeit von
10% bei 575 nm eingestellt. Die Injektionen wurden auf intravenösem Weg
gemäß dem folgenden
Schema durchgeführt:
0,5 ml, 1,0, 2,0, 3,0, 3,0, 3,0 in Abständen von 4 Tagen. 4 Tage nach
der letzten Injektion wurde sämtlichen
Kaninchen Blut entnommen.
-
Das
Hyperimmunserum wurde auf die Spezifität unter Verwendung der 3 Biotyp-Stämme getestet
und mit homologem und heterologem Kaninchen-Antiserum (2-fache Verdünnungen)
durch rasche Plattenagglutination getestet.
-
Antiserum
für jeden
Biotyp wurde bis zum Erreichen des Endpunkts verdünnt, um
die höchste
Verdünnung,
die sich als positiv erwies, zu bestimmen. Verdünnung
(log
2) Antigen-Biotyp 1
Antiserum | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 |
1 | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
2 | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – |
4 | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – |
Verdünnung
(log
2) Antien-Biotyp 4
Antiserum | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 |
1 | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – |
2 | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – |
4 | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
Verdünnung
(log
2) Antigen-Biotyp 2
Antiserum | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
1 | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – |
2 | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
4 | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – |
-
Die
biotypspezifischen Hyperimmunseren wurden sodann als positive Kontrollen
beim Mikroplatten-Serum-Agglutinationstest verwendet.
-
Beispiel VI
-
Herstellung von Belastungsstämmen und
Belastung von geimpften Gruppen und Kontrollgruppen
-
Die
bakteriellen Stämme
BIV-4895, ATCC Nr. PTA-3667, BIV-AVICOR, ATCC Nr. PTA-3668 und BIV-07990,
ATCC Nr. PTA-3669 wurden 24 Stunden bei 37°C auf Schafblut-Agar gezüchtet. Die
Zellen wurden in Tryptose-Brühe
(TB) geerntet, nachdem eine Suspension mit einer optischen Dichte
von 2,0 erhalten worden war, was mit einem Spektrophotometer bei
einer Wellenlänge
von 540 nm bestimmt wurde. Für
die Belastung wurden Präparate
hergestellt, die die nachstehend angegebene Anzahl an Zellen im
endgültigen
Belastungsvolumen enthielten:
1,5 × 1010 CFU/ml
BIV-AVICOR; ATCC Nr. PTA-3668
1,7 × 1010 CFU/ml
BIV-4895, ATCC Nr. PTA-3667
1,6 × 1010 CFU/ml
BIV-07990; ATCC Nr. PTA-3669
-
Im
Alter von 13 Wochen wurden 20 geimpfte und 20 nicht geimpfte Vögel auf
intravenösem
Weg durch Verabreichen von 0,2 ml Inoculum (mindestens 108,0 CFU/Vogel) belastet. Die Vögel wurden
3 Tage lang auf Morbidität
und Mortalität
beobachtet. Nach der 3-tägigen
Beobachtung wurden sämtliche
verbleibenden Vögel getötet, post-mortem-Läsionen wurden
aufgezeichnet und eine Reisolierung der Bakterien aus Leber und
Gonaden wurde bei jedem Vogel durchgeführt.
-
Ergebnisse
-
Tabelle 1. Bewertung des Einflusses des Impfstoffes
auf der Basis von Mortalität
und Reisolierung
Gruppe
von Vögeln | Belastungsinokulum | Mortalität + Reisolierung | Schutz,
% |
nicht
geimpfte negative Kontrollgruppe | N/A | N/A | N/A |
positive
Kontrollgruppe | BIV-4895 | 70 | 30 |
positive
Kontrollgruppe | BIV-AVICOR | 80 | 20 |
positive
Kontrollgruppe | BIV-07990 | 88,8 | 11,2 |
geimpfte
Gruppe | BIV-4895 | 10 | 90 |
geimpfte
Gruppe | BIV-AVICOR | 10 | 90 |
geimpfte
Gruppe | BIV-07990 | 15 | 85 |
Tabelle 2 Bewertung des Einflusses des Impfstoffes
auf der Grundlage von starken Läsionen
nach der Belastung
Gruppe
von Vögeln | Belastungsinokulum | %
Läsionen | Schutz,
% |
nicht
geimpfte negative Kontrollgruppe | N/A | N/A | N/A |
positive
Kontrollgruppe | BIV-4895 | 74,4 | 25,6 |
positive
Kontrollgruppe | BIV-AVICOR | 27,0 | 73,0 |
positive
Kontrollgruppe | BIV-07990 | 7,0 | 93,0 |
geimpfte
Gruppe | BIV-4895 | 4,0 | 96,0 |
geimpfte
Gruppe | BIV-AVICOR | 1,1 | 99,0 |
geimpfte
Gruppe | BIV-07990 | 2,4 | 98,0 |
-
Literatur
-
- 1) Jaworski M. D., D. L. Hunter, A. C. S. Ward. Biovariants
of isolates of Pasteurella from domestic and wild ruminants. J.
Vet. Invest. 1988, 10: 49–55.
- 2) Biberstein EL., Meyer M. E., and Kenedy P. C. Colonial variation
of Pasteurella haemolytica isolated from sheep. J. Bact. 1958, 76:
445–452.
- 3) Kearney, J. F., Radbruch A., Liesegang B., Rajewski K. A
new mouse myeloma cell line that has lost imunoglobulin expression
but permits construction of antibody-secreting hybrid cell lines.
J. Immunol. 1979, 123: 1548–1550.
- 4) Köhler,
G., Milstein, C. Continous culture of fused cells secreting antibody
of predefined specifity. Nature 1975, 265: 495–497.