ES2304466T3 - Bacteria causante de una enfermedad de las aves de corral y vacuna derivada de la misma. - Google Patents
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Abstract
Bacteria Gram-negativa, con forma de bastón pleomórfico que causa una enfermedad del tracto respiratorio superior y del tracto reproductivo de pollos, donde dicha bacteria se selecciona del grupo de Pasteurella trehalosi o Mannheimia haemolytica, y en donde dicha bacteria es beta-hemólisis-positiva, oxidasa-positiva, catalasa-positiva, ureasa-negativa, nitrato-positiva, indol-negativa, MacConkey-positiva, glucosa-positiva, sacarosa-positiva, manitolpositiva, arabinosa-negativa, celobiosa-negativa, xilosa-positiva, salicina-negativa, ornitina-negativa, esculina-negativa, alfa-fucosidasa-negativa y beta-galactosidasa-positiva.
Description
Bacteria causante de una enfermedad de las aves
de corral y vacuna derivada de la misma.
La invención pertenece al campo de la salud
animal y en particular a los agentes causantes de una nueva
enfermedad bacteriana de las aves de corral, Pasteurella
trehalosi y/o Mannheimia haemolytica. La invención
proporciona dichas bacterias Pasteurella trehalosi y/o
Mannheimia haemolytica, una vacuna que comprende
Pasteurella trehalosi y/o Mannheimia haemolytica
inactivadas, y un método de inmunización de los pollos para prevenir
dicha enfermedad en los pollos.
Durante la última década, los métodos intensivos
de crianza de aves de corral en granjas para aumentar la
productividad, han dado como resultado un aumento de manifestación
de enfermedades en todos los principales países productores de aves
de corral. Esto ha provocado un aumento de la necesidad de nuevas y
mejores vacunas y programas de vacunación para controlar estas
enfermedades. Actualmente, la mayoría de los animales se inmunizan
frente a varias enfermedades de origen viral y bacteriano.
Ejemplos de enfermedades virales en las aves de
corral son la enfermedad de Newcastle, bronquitis infecciosa,
neumovirus aviar, viruela aviar, enfermedad bursal infecciosa,
etc.
Ejemplos de enfermedades bacterianas son coriza
aviar causada por Haemophilus paragallinarum (del tracto
respiratorio superior), Bordetella avium (del tracto
respiratorio superior), Ornithobacterium rhinotracheale (del
tracto respiratorio inferior), infecciones por Salmonella
(tracto digestivo), Pasteurela multocida, que es el agente
causante del cólera de las aves de corral (septicémico), e
infecciones por E. Coli.
Por tanto, el problema técnico fundamental de
esta invención fue identificar una nueva enfermedad bacteriana de
las aves de corral, para proporcionar el agente causante de dicha
enfermedad y proporcionar una vacuna para evitar dicha
enfermedad.
Fig. 1) Pollos broilers: descarga nasal y área
hinchadas alrededor del ojo.
Fig. 2) Pollos broilers: hemorragia en el
corazón y grasa coronaria.
Fig. 3) Pollos broilers: conjuntivitis e
inflamación alrededor del ojo.
Fig. 4) Gallinas ponedoras: descarga nasal y
cresta desplazada con cianosis.
Fig. 5) Gallinas ponedoras: inflamación y
hemorragia alrededor del ojo.
Fig. 6) Gallinas ponedoras: hemorragia en el
tejido dérmico detrás de la entrada del orificio del oído.
Fig. 7) Gallinas ponedoras: inflamación de los
riñones.
Fig. 8) Gallinas ponedoras: hemorragias en el
oviducto.
Fig. 9) Gallinas ponedoras: folículos ováricos
deformados.
Fig. 10) Gallinas ponedoras: hemorragia en la
unión entre el pro-ventrículo y el buche.
Fig. 11) Gallinas ponedoras: congestión y
hemorragia en el oviducto.
\vskip1.000000\baselineskip
Fig. 12) Gallinas ponedoras: inflamación y
hemorragia en el riñón.
Fig. 13) SPF: postración.
Fig. 14) Gallinas ponedoras: hemorragia en la
articulación y en el músculo.
Fig. 15) Gallinas ponedoras: descarga nasal y
cresta pálida.
Fig. 16) Gallinas ponedoras: hemorragia en el
músculo.
Fig. 17) SPF: hemorragia en el corazón y grasa
coronaria.
Fig. 18) Gallinas ponedoras: ave sana a la
izquierda y ave enferma a la derecha con las plumas erizadas.
Fig. 19) Gallinas ponedoras: diarrea
verdosa.
Fig. 20) SPF: hemorragia en el músculo.
Fig. 21) SPF: postración (problemas locomotores)
y diarrea verdosa.
Fig. 22) Gallinas ponedoras: hígado agrandado
con hemorragia.
\vskip1.000000\baselineskip
Antes de las realizaciones de la presente
invención se debe notar que como se usan aquí y en las
reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un, una",
"uno, una" y "el, la" incluyen referencias al plural a no
ser que el contexto indique claramente otra cosa. Por tanto, por
ejemplo, la referencia a "una Pasteurella trehalosi"
incluye una pluralidad de tales bacterias Pasteurella
trehalosi, la referencia a la "célula" es una referencia a
una o más células y sus equivalentes conocidos por los expertos en
la técnica, y así sucesivamente. Es irrelevante si una palabra está
en mayúsculas o no, por tanto "Arabinosa" y "arabinosa"
tienen el mismo significado, a no ser que se indique otra cosa. A
menos que se defina otra cosa, todos los términos técnicos y
científicos usados aquí tienen los mismos significados que
comúnmente se entienden por una persona de experiencia normal en la
técnica a la que esta invención pertenece. Aunque se pueden usar
todos los métodos y materiales similares o equivalentes a los
descritos aquí en la práctica o ensayos de la presente invención,
los métodos, dispositivos, y materiales preferidos se describen
ahora. Todas las publicaciones mencionadas aquí se incorporan a esta
memoria como referencia con el propósito de describir y exponer las
líneas celulares, vectores, y metodologías como se expresan en las
publicaciones que se pueden usar en conexión con la invención. Nada
aquí debe ser interpretado como una admisión de que la invención no
está autorizada para anticipar tal descripción en virtud de la
invención previa.
Sorprendentemente, en la presente invención se
ha observado una nueva enfermedad bacteriana de las aves de corral,
que aparece principalmente en gallinas ponedoras y menos
frecuentemente en pollos broilers. La enfermedad se vio en pollos
que habían sido vacunados frente a la bacteria Haemophilus
paragallinarum (agente causante de la coriza aviar), y
Pasteurella multocida (agente causante del cólera de las aves
de corral). Los síntomas de esta nueva enfermedad difieren de los
síntomas específicos de la coriza. Dado el hecho de que la
enfermedad recientemente descubierta muestra claramente los signos
clínicos de una infección del tracto respiratorio superior como se
describe más adelante, H. paragallinarum puede ser eliminado
como el agente causante.
La presente invención se refiere en una primera
realización a bacterias Gram-negativas, anaeróbicas
facultativas, con forma de bastón pleomórfico que causan una nueva
enfermedad del tracto respiratorio superior y del tracto
reproductivo de las aves de corral, en la que dichas bacterias se
seleccionan del grupo de Pasteurella trehalosi y/o
Mannheimia haemolytica.
Tales bacterias según las invención se pueden
aislar a partir de traquea, hendidura del paladar, ovario, hígado,
corazón, riñón y gónadas, infectados (pollos broiler). Se pueden
identificar como Pasteurella trehalosi y/o
Mannheimia haemolytica según la invención basándose en los
ensayos listados a continuación:
- Beta-Hemólisis
- +
- Tinción por Gram
- -
- Oxidasa
- +
- Catalasa
- +
- Ureasa
- -
- Nitrato
- +
- Indol
- -
\vskip1.000000\baselineskip
Los aislados bacterianos se pueden purificar y
hacer determinación de su biotipo según el método descrito por
Jaworski et al (1). Este método también está explicado en los
ejemplos. Métodos importantes para clasificar las bacterias son la
hibridación DNA-DNA, REA (análisis de la enzima de
restricción, véase, por ejemplo, J. Clinical Microbiol,
1993, 31:831-835) y determinación del ribotipo.
Dichos métodos pueden ser aplicados por el técnico para ver si las
bacterias están dentro del alcance de la presente invención. También
se explica en los ejemplos un modelo de exposición para validar los
postulados de Koch.
Por tanto, una importante realización de la
presente invención son las Pasteurella trehalosi y/o
Mannheimia haemolytica, en la que dichas Pasteurella
y/o Mannheimia son
beta(\beta)-hemólisis-positivas,
Gram-negativas, oxidasa-positivas,
catalasa-positivas,
ureasa-negativas, nitrato-positivas
e indol-negativas. Preferiblemente, dichas
Pasteurella trehalosi y/o Mannheimia
haemolytica según la invención son también
MacConkey-positivas. Incluso es más preferido, que
dichas Pasteurella trehalosi y/o Mannheimia
haemolytica según la invención sean adicionalmente
glucosa-positivas,
sacarosa-positivas,
manitol-positivas,
arabinosa-negativas,
celobiosa-negativas,
xilosa-positivas,
salicina-negativas,
ornitina-negativas,
esculina-negativas,
alfa-fucosidasa-negativas,
beta-galactosidasa-positivas. Las
más preferidas son las Pasteurella trehalosi según la
invención, en las que dichas Pasteurella son también
arabinosa-negativas y
trehalosa-positivas. Preferiblemente también,
dichas Pasteurella trehalosi según la invención son
también
beta(\beta)-glucosidasa-negativas
o -positivas, dependiendo del biotipo. También las más preferidas
son las Mannheimia haemolytica según la invención, donde
dichas Mannheimia son además
arabinosa-negativas y
trehalosa-negativas. Preferiblemente también,
dichas Mannheimia haemolytica según la invención son también
beta-glucosidasa-
negativas.
negativas.
Estas propiedades características de las
bacterias según la invención hacen que las bacterias según la
invención sean nuevas en relación con otros patógenos bacterianos
de las aves de corral conocidos (Diseases of Poultry, décima
edición, editado por B.W. Calnek, Iowa State University Press, Iowa,
U.S.A. 1997).
Otra realización preferida de la presente
invención son las Pasteurella trehalosi y/o
Mannheimia haemolytica según la invención, en la que dichas
aves de corral se seleccionan del grupo de pollos, pavos, patos,
gansos, palomas, pichones y codornices.
La invención proporciona un nuevo tipo de
bacterias Gram-negativas, anaeróbicas facultativas,
de forma de bastón pleomórfico, estando caracterizado dicho nuevo
tipo de bacterias por las bacterias depositadas ante la American
Type Culture Collection (ATCC), 1081, University Boulevard,
Manassas, VA 20110-2209, USA, con los siguientes
números de depósito:
- -
- Pasteurella trehalosi ATCC Nº PTA-3667 (designación interna BIV-4985);
- -
- Pasteurella trehalosi ATCC Nº PTA-3668 (designación interna BIV-AVICOR);
- -
- Mannheimia haemolytica ATCC Nº PTA-3669 (designación interna BIV-07990)
\vskip1.000000\baselineskip
La fecha del depósito fue 22 de agosto de
2001.
Por tanto, una realización más preferida de la
presente invención son las Pasteurella trehalosi
depositadas con el número de registro ATCC Nº
PTA-3667. En la tabla 3 del ejemplo 1 se dan
ejemplos adicionales de estas bacterias.
Otra realización más preferida de la presente
invención son Pasteurella trehalosi depositadas con
el número de registro ATCC Nº PTA-3668. En la tabla
2 del ejemplo 1 se dan ejemplos adicionales de estas bacterias.
Otra realización más preferida de la presente
invención son Mannheimia haemolytica con el número de
registro ATCC Nº PTA-3669. En la tabla 1 del
ejemplo 1 se dan ejemplos adicionales de estas bacterias.
Los resultados de los ensayos de las secciones A
y B de los ejemplos (tablas 1, 2 y 3) confirman que las bacterias
BIV-4895; ATCC Nº PTA-3667 y
BIV-AVICOR; ATCC Nº PTA-3668
pertenecen a la familia Pasteurellaceae (Pasteurella
trehalosi , que son trehalosa-positivas y
arabinosa-negativas), mientras que la bacteria
BIV-07990; ATCC Nº PTA-3669
pertenece a la familia Mannheimia(Mannheimia haemolytica, que
son trehalosa-negativas y
arabinosa-negativas).
La invención se refiere también al cultivo
microbiológico que comprende bacterias según la invención como se
ha descrito antes. El cultivo se puede preparar haciendo crecer
dichas bacterias a una temperatura entre 35 y 37ºC. Las bacterias
pueden ser cultivadas bajo presión de oxígeno atmosférico normal.
Las bacterias pueden ser cultivadas en una variedad de medios
diferentes de promoción del crecimiento bacteriano con propósitos
generales conocidos por los expertos, por ejemplo, caldo de triptosa
(TB), caldo de tripticaseína de soja o caldo de infusión de cerebro
y corazón o cualquier medio enriquecido. Las bacterias también
pueden ser cultivadas en agar con sangre de oveja incubado a 37ºC
durante 24 horas.
Son conocidos en la técnica diferentes métodos
físicos y químicos de inactivación bacteriana. Ejemplos de
inactivación física son la radiación UV, radiación de rayos X,
radiación gamma y calentamiento. Ejemplos de inactivantes químicos
son beta-propiolactona, glutaraldehído,
beta-etilenimina y formaldehído.
\newpage
Preferiblemente las bacterias según la invención
se inactivan con formaldehído. Sorprendentemente, el uso de
formaldehído hasta una concentración final del 0,2% es un método
excelente para inactivar las bacterias según la invención.
Por tanto, en otro aspecto importante, la
invención se refiere a un método para la inactivación de una
Pasteurella trehalosi y/o Mannheimia
haemolytica según la invención que comprende el uso de
formaldehído a una concentración final del 0,2%.
Dichas bacterias según la invención que se
inactivan por los métodos descritos antes y por otros métodos de
inactivación de bacterias conocidos por los expertos son
realizaciones de la presente invención. Por tanto, otro aspecto
importante son las Pasteurella trehalosi y/o
Mannheimia haemolytica inactivadas obtenibles por un método
según la invención o por un método conocido en la técnica.
Preferiblemente, dichas Pasteurella trehalosi y/o
Mannheimia haemolytica inactivadas según la invención se
seleccionan del grupo de Pasteurella trehalosi ATCC
Nº PTA-3667, Pasteurella trehalosi
ATCC Nº PTA-3668 y/o Mannheimia haemolytica
ATCC Nº PTA-3669.
Por tanto, otro aspecto importante son las
Pasteurella trehalosi y/o Mannheimia
haemolytica vivas atenuadas obtenibles por un método conocido
en la técnica. Preferiblemente, dichas Pasteurella
trehalosi y/o Mannheimia haemolytica vivas atenuada
según la invención se seleccionan del grupo de Pasteurella
trehalosi ATCC Nº PTA-3667,
Pasteurella trehalosi ATCC Nº PTA-3668
y/o Mannheimia haemolytica ATCC Nº PTA-3669.
Dichas Pasteurella trehalosi y/o Mannheimia
haemolytica según la invención se atenúan por múltiples pases
en medios de cultivo adecuados o por cualquier otro método conocido
en la técnica.
Inactivado como se entiende aquí significa, que
las Pasteurella trehalosi y/o Mannheimia
haemolytica según la invención están muertas sin replicación
posible que cause enfermedad clínica.
Atenuado como se entiende aquí significa, que
las Pasteurella trehalosi y/o Mannheimia
haemolytica según la invención son bacterias vivas con
replicación posible pero que no causarán enfermedad clínica.
Otro aspecto importante adicional son las
fracciones o fragmentos de las Pasteurella trehalosi
y/o Mannheimia haemolytica obtenibles por un método conocido
en la técnica. Dichos fragmentos se pueden preparar por
solubilización con detergente de las Pasteurella
trehalosi y/o Mannheimia haemolytica según la
invención o por cualquier otro método conocido en la técnica.
Preferiblemente, dichas fracciones o fragmentos
son antígenos purificados de dichas Pasteurella
trehalosi y/o Mannheimia haemolytica según la
invención. Preferiblemente, dichas fracciones/fragmentos son
proteínas de la membrana externa de las Pasteurella
trehalosi y/o Mannheimia haemolytica según la
invención.
Un "fragmento" según la invención es
cualquier subunidad inmunogénica de dichas Pasteurella
trehalosi y/o Mannheimia haemolytica según la
invención, es decir, un subconjunto polipetídico.
Por tanto, la invención se refiere a fragmentos
o fracciones que contienen al menos un antígeno de las
Pasteurella trehalosi y/o Mannheimia
haemolytica según la invención. Lo más preferiblemente, dichos
fragmentos contienen al menos un antígeno de las bacterias
seleccionadas del grupo Pasteurella trehalosi ATCC Nº
PTA-3667, Pasteurella trehalosi ATCC
Nº PTA-3668 y/o Mannheimia haemolytica ATCC
Nº PTA-3669. Dicho fragmento puede comprender
células bacterianas enteras de dichas cepas, extractos bacterianos,
fracciones de la membrana externa, exo- y/o endotoxinas
bacterianas, y proteínas purificadas. Los polipéptidos antigénicos
o sus fragmentos pueden, por ejemplo, obtenerse a partir de
proteínas bacterianas purificadas o por expresión del material
genético correspondiente en algunos sistemas de expresión
procarióticos o eucarióticos o por síntesis organoquímica. Dichos
métodos son conocidos por los expertos.
La invención se refiere además a las
Pasteurella trehalosi y/o Mannheimia
haemolytica vivas, y/o vivas atenuadas, y/o inactivadas según
la invención y/o a fracciones de dichas Pasteurella
trehalosi y/o Mannheimia haemolytica para uso en una
vacuna.
La invención proporciona además una vacuna
derivada de las bacterias identificadas como nuevas descritas antes.
Por tanto, la invención se refiere además a una composición de una
vacuna que comprende una Pasteurella trehalosi y/o
Mannheimia haemolytica viva, y/o viva atenuada, y/o
inactivada según la invención y/o a fracciones de dicha
Pasteurella trehalosi y/o Mannheimia
haemolytica.
El término "vacuna" como se entiende aquí
es una vacuna para uso veterinario que comprende sustancias
antigénicas y que se administra con el propósito de inducir una
inmunidad específica activa o pasiva frente a una enfermedad
provocada por dichas Pasteurella trehalosi y/o
Mannheimia haemolytica. Las Pasteurella
trehalosi y/o Mannheimia haemolytica vivas o
atenuadas vivas según la invención confieren inmunidad activa que
puede ser transferida pasivamente a través de los anticuerpos
maternos frente a los inmunógenos que contiene y algunas veces
también frente a organismos antigénicamente relacionados. Las
Pasteurella trehalosi y/o Mannheimia
haemolytica inactivadas según la invención y/o las fracciones de
dichas Pasteurella trehalosi y/o Mannheimia
haemolytica confieren inmunidad pasiva.
\newpage
Componentes adicionales para potenciar la
respuesta inmune son constituyentes a los que se denomina comúnmente
adyuvantes, como por ejemplo, hidróxido de aluminio, aceite mineral
u otros aceites o moléculas relacionadas añadidas a la vacuna o
generadas por el cuerpo después de la inducción respectiva por tales
componentes adicionales, semejantes, pero sin restringirse a ellos,
a interferones, interleuquinas o factores de crecimiento.
En una realización preferida, dicha vacuna
comprende bacterias inactivadas.
Preferiblemente, una vacuna de la invención se
refiere a una vacuna como se ha definido antes, en la que un
componente inmunológicamente activo es una Pasteurella
trehalosi y/o Mannheimia haemolytica viva. El término
"vacuna viva" se refiere a una vacuna que comprende una
partícula capaz de división/multiplicación.
Preferiblemente también, una vacuna según la
invención comprende Pasteurella trehalosi y/o
Mannheimia haemolytica atenuadas según la invención y un
vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Dicha vacuna
puede ser administrada también como una vacuna combinada que
comprende dos o más cepas de dichas Pasteurella
trehalosi y/o Mannheimia haemolytica vivas, y/o vivas
atenuadas, y/o inactivadas de la invención y/o las fracciones de
dos o mas cepas de dichas Pasteurella trehalosi y/o
Mannheimia haemolytica. Lo más preferiblemente dichas
Pasteurella trehalosi y/o Mannheimia
haemolytica vivas, y/o vivas atenuadas, y/o inactivadas según
la invención y/o las fracciones de dichas Pasteurella
trehalosi y/o Mannheimia haemolytica en la vacuna se
seleccionan del grupo de Pasteurella trehalo-
si ATCC Nº PTA-3667, Pasteurella trehalosi ATCC Nº PTA-3668 y/o Mannheimia haemolytica ATCC Nº PTA-3669.
si ATCC Nº PTA-3667, Pasteurella trehalosi ATCC Nº PTA-3668 y/o Mannheimia haemolytica ATCC Nº PTA-3669.
Preferiblemente también, una vacuna según la
invención comprende Pasteurella trehalosi y/o
Mannheimia haemolytica inactivadas según la invención y un
vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptables. Dicha vacuna se
puede administrar también como una vacuna combinada que comprende
dos o más cepas de dichas Pasteurella trehalosi y/o
Mannheimia haemolytica inactivadas.
Además, se pueden usar también las fracciones de
las células enteras como el inmunógeno relevante en la vacuna según
la invención. Por tanto, preferiblemente una vacuna según la
invención comprende fracciones de Pasteurella
trehalosi y/o Mannheimia haemolytica según la
invención y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptables.
Dicha vacuna se puede administrar también como una vacuna combinada
que comprende dos o más cepas de dichas Pasteurella
trehalosi y/o Mannheimia haemolytica inactivadas. En
particular, la invención se refiere a vacunas que comprenden
fragmentos o fracciones que contienen al menos un antígeno de
Pasteurella trehalosi y/o Mannheimia
haemolytica según la invención. Lo más preferiblemente, la
invención se refiere a vacunas que contienen fragmentos que
contienen al menos un antígeno de las bacterias seleccionadas del
grupo Pasteurella trehalosi ATCC Nº
PTA-3667, Pasteurella trehalosi ATCC
Nº PTA-3668 y/o Mannheimia haemolytica ATCC
Nº PTA-3669. Dicho fragmento puede comprender
células bacterianas enteras, extractos bacterianos, fracciones de
la membrana exterior, exo- y/o endotoxinas bacterianas, y proteínas
purificadas. Los polipéptidos antigénicos o sus fragmentos, por
ejemplo, pueden obtenerse a partir de proteínas bacterianas
purificadas o por expresión del material genético correspondiente
en algunos sistemas de expresión procarióticos o eucarióticos o por
síntesis organoquímica. Dichos métodos son conocidos por los
expertos.
Preferiblemente, la vacuna según la invención
comprende también un adyuvante. Por tanto, la invención se refiere
además a una composición de una vacuna según la invención, que
comprende además uno o más adyuvantes adecuados y/o excipientes y/o
vehículos.
Los adyuvantes como se usan aquí comprenden
sustancias que refuerzan la respuesta inmune del animal inyectado.
Se conocen en la técnica una serie de adyuvantes diferentes. Los
adyuvantes como se usa aquí incluyen adyuvante de Freund completo e
incompleto, vitamina E, polímeros de bloque no iónicos,
muramildipéptidos, Quil A, aceite mineral y no mineral, aceite
vegetal, y Carpobol (un homopolímero). En una realización preferida,
la vacuna según la invención, bacterina, comprende un adyuvante en
emulsión de agua en aceite. Dicha vacuna se llama también una
bacterina que comprende bacterias inactivadas (muertas) según la
invención y un adyuvante en emulsión de agua en aceite. Otros modos
para añadir adyuvantes a las bacterias conocidos por los expertos
son también realizaciones de la presente invención.
Preferiblemente también, la vacuna según la
invención puede comprender uno o más emulsificantes adecuados, por
ejemplo, Span o Tween.
Preferiblemente también, dichas
Pasteurella trehalosi y/o Mannheimia
haemolytica vivas, y/o vivas atenuadas, y/o inactivadas según
la invención y/o las fracciones de dichas Pasteurella
trehalosi y/o Mannheimia haemolytica en la vacuna se
seleccionan del grupo de Pasteurella trehalosi ATCC Nº
PTA-3667, Pasteurella trehalosi ATCC
Nº PTA-3668 y/o Mannheimia haemolytica ATCC
Nº PTA-3669.
Preferiblemente, la vacuna de la presente
invención comprende al menos un antígeno de las bacterias
seleccionadas del grupo Pasteurella trehalosi ATCC Nº
PTA-3667, Pasteurella trehalosi ATCC
Nº PTA-3668 y/o Mannheimia haemolytica ATCC
Nº PTA-3669. Dicha vacuna puede comprender células
bacterianas enteras de dichas cepas, extractos bacterianos,
fracciones de la membrana externa, exo- y/o endotoxinas bacterianas,
y proteínas purificadas. Los polipéptidos antigénicos o sus
fragmentos, por ejemplo, se pueden obtener a partir de proteínas
bacterianas purificadas o por expresión del material genético
correspondiente en algunos sistemas de expresión procarióticos o
eucarióticos o por síntesis organoquímica. Dichos métodos son
conocidos por los expertos.
Lo más preferiblemente, la invención se refiere
además a una composición de vacuna según la invención, que
comprende además al menos otro antígeno procedente de un virus o
microorganismo patógeno para las aves de corral. Preferiblemente,
dicho antígeno está en forma de virus o microorganismos vivos,
atenuados o inactivados o sus fragmentos. Dicho fragmento puede
comprender células bacterianas enteras o partículas virales,
extractos bacterianos, antígenos virales, subunidades virales,
fracciones de la membrana externa, exo- y/o endotoxinas
bacterianas, y proteínas purificadas. Los polipéptidos antigénicos o
sus fragmentos, se pueden obtener, por ejemplo, a partir de
proteínas bacterianas purificadas o por expresión del material
genético correspondiente en algunos sistemas de expresión
procarióticos o eucarióticos o por síntesis organoquímica. Dichos
métodos son conocidos por los expertos.
Los más preferiblemente, la invención se refiere
además a una composición de vacuna según la invención, que
comprende además al menos otro antígeno procedente de un virus o
microorganismo patógeno para las aves de corral, en la que dicho
virus o microorganismo se selecciona del grupo constituido por virus
de la bronquitis infecciosa, virus de la enfermedad de Newcastle,
virus de la enfermedad bursal infecciosa (enfermedad: Gumboro),
agente de la anemia de los pollos, reovirus aviar, Micoplasma
gallisepticum, neumovirus aviar, Haemophilus
paragallinarum (enfermedad: coriza), poxvirus de los pollos,
virus de la encefalomielitis aviar, Pasteurella multocida y
E. Coli , pero sin restringirse a ellos.
Una "composición farmacéutica" consta
esencialmente de uno o más ingredientes capaces de modificar las
funciones fisiológicas, por ejemplo, funciones inmunológicas del
organismo al que se administra, o de los organismos vivientes en o
sobre el organismo. El término incluye, pero sin restringirse a
ellos, antibióticos o antiparasitarios, así como otros
constituyentes usados comúnmente para lograr otros objetivos como
características de preparación, esterilidad, estabilidad,
posibilidad para administrar la composición por las vías enteral o
parenteral tales como las vías oral, intranasal, intravenosa,
intramuscular, subcutánea, intradérmica u otras vías adecuadas,
tolerancia después de la administración, propiedades de liberación
controlada. Por tanto, en otro aspecto importante de la invención,
la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende
una Pasteurella trehalosi y/o Mannheimia
haemolytica viva, y/o viva atenuada, y/o inactivada según la
invención y/o fracciones de dicha Pasteurella
trehalosi y/o Mannheimia haemolytica.
La invención se refiere a un método para tratar
un animal infectado con Pasteurella trehalosi y/o
Mannheimia haemolytica (por ejemplo, la bacteria viva que se
ha descrito antes) perteneciente al grupo de las aves de corral,
donde dicha Pasteurella trehalosi y/o Mannheimia
haemolytica viva, atenuada, inactivada y/o sus fracciones y/o
sus fragmentos según la invención como se ha descrito antes, se
administran al ave de corral que los necesita a las dosis adecuadas
como es conocido por los expertos y se hace seguimiento de la
reducción de los síntomas causados por dicha infección por
Pasteurella trehalosi y/o Mannheimia
haemolytica. Dicho tratamiento preferiblemente se puede
repetir.
Otra realización importante adicional es un
método para inmunizar las aves de corral frente a la enfermedad del
tracto respiratorio y del tracto reproductivo causada por una
Pasteurella trehalosi y/o Mannheimia
haemolytica (por ejemplo, las bacterias vivas como se ha
descrito antes) que comprende la administración de una cantidad
inmunológicamente eficaz de una vacuna según la invención y se hace
seguimiento de la reducción de los síntomas causados por dicha
infección por Pasteurella trehalosi y/o Mannheimia
haemolytica.
Otra realización importante es el uso de una
Pasteurella trehalosi y/o Mannheimia
haemolytica inactivada según la invención y/o de una
Pasteurella trehalosi y/o Mannheimia
haemolytica viva según la invención y/o de una
Pasteurella trehalosi y/o Mannheimia
haemolytica viva atenuada según la invención y/o fragmentos o
fracciones de dicha Pasteurella trehalosi y/o
Mannheimia haemolytica según la invención en la fabricación
de una vacuna para la profilaxis de las infecciones por
Pasteurella trehalosi y/o Mannheimia
haemolytica.
La invención también se refiere a un método de
diagnóstico de una enfermedad causada por, que comprende las etapas
de obtener una muestra de un ave de corral, en el que dicha muestra
se selecciona del grupo de la sangre, suero, plasma, raspaduras,
lavados y frotes de tejido y tejido y analizar dicha muestra en
cuanto a la presencia de Pasteurella trehalosi y/o
Mannheimia haemolytica según la invención.
En una realización preferida la presencia de
Pasteurella trehalosi y/o Mannheimia
haemolytica se determina por un ensayo inmune. Un ensayo inmune
usa anticuerpos monoclonales o antisueros policlonales específicos
para la Pasteurella trehalosi y/o Mannheimia
haemolytica. La generación de los anticuerpos monoclonales es
conocida en la técnica (3,4). Los ensayos inmunes incluyen los
métodos de detección conocidos en la técnica tales como el ensayo
ELISA (ensayo de inmunosorbente ligado a enzimas) o el llamado
ensayo sándwich-ELISA, transferencias,
inmunotransferencias, radioinmunoensayos (radioinmunoensayo RIA),
ensayo de Ouchterlony basado en la difusión o ensayos
inmunofluorescentes rocket o ensayos de aglutinación (ensayos
de aglutinación en placa rápida o en microplaca). Otro ensayo
inmune es el llamado transferencia Western (también conocido como
procedimiento de transferencia Western o transferencia Western). El
propósito de la transferencia Western es transferir proteínas o
polipéptidos separados por electroforesis en gel de poliacrilamida
sobre un filtro de nitrocelulosa u otro vehículo adecuado y al
mismo tiempo retener las posiciones relativas de las proteínas y
los polipéptidos obtenidos de la electroforesis en gel. La
transferencia Western es incubada después con un anticuerpo que se
une específicamente a la proteína o el polipéptido en consideración.
Se pueden usar estos métodos de detección por la persona experta
con experiencia media para realizar la invención descrita aquí. Se
listan a continuación las referencias bibliográficas en las que los
expertos pueden encontrar los métodos antes mencionados y otros
métodos de detección: An Introduction to Radioimmunoassay and
Related Techniques, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, The
Netherlands (1986); Bullock et al., Techniques in
Immunocytochemistry, Academic Press, Orlando, FL Vol. 1 (1982),
Vol. 2 (1983), Vol. 3 (1985); Tijssen, Practice and Theory of
Enzyme Immunoassays: Laboratory Techniques in Biochemistry and
Molecular Biology; Elsevier Science Plublishers, Amsterdam, the
Netherlands (1985).
En otra realización más particular, se incuba la
muestra como se ha descrito antes con anticuerpos que son
específicos para la Pasteurella trehalosi y/o
Mannheimia haemolytica y se determina el complejo
antígeno/anticuerpo así formado.
En una realización particularmente preferida del
método según la invención, se determina la presencia de la
Pasteurella trehalosi y/o Mannheimia
haemolytica en una muestra como se ha descrito antes por
métodos de biología molecular. Los métodos de biología molecular
como se usa aquí significan métodos de detección que incluyen, por
ejemplo, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la reacción
en cadena de la transcriptasa inversa-polimerasa
(RT-PCR) o pueden ser transferencias Northern o
Southern que los expertos pueden encontrar en los libros de
referencia estándar (por ejemplo, Sambrook et al. (1989)
Molecular Cloning: A Laboratory manual, 2^{nd} ed., cold Spring
Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York and bertram,
S. and Gassen, H.G. Gentechnische Methoden, G. Fischer Verlag,
Stuttgart, New York, 1991).
La invención incluye también un kit de ensayo de
diagnóstico según la invención que se caracteriza porque contiene
todo los elementos necesarios para detectar la Pasteurella
trehalosi y/o Mannheimia haemolytica.
Un kit de ensayo de diagnóstico es una colección
de todos los componentes para llevar a cabo un método de
diagnóstico según la invención. Algunos ejemplos (no una lista
exhaustiva) de otros elementos para desarrollar un método según la
invención incluyen recipientes tales como placas de 96 pocillos o
placas de microtitulación, tubos de ensayo, otros recipientes,
superficies y sustratos adecuados, membranas tales como filtro de
nitrocelulosa, reactivos de lavado y tampones. Un kit de ensayo de
diagnóstico puede contener también reactivos que pueden detectar
los anticuerpos unidos, tal como por ejemplo, anticuerpos
secundarios marcados, cromóforos, enzimas (por ejemplo, conjugadas
con anticuerpos) y sus sustratos u otras sustancias que son capaces
de unirse a los anticuerpos.
La invención se refiere además a un kit de
ensayo de diagnóstico según la invención que se caracteriza porque
contiene todos los elementos necesarios para llevar a cabo una PCR o
RT-PCR para detectar el DNA o RNA específicos para
la Pasteurella trehalosi y/o Mannheimia
haemolytica. Dicho kit contiene en adición a los tubos de
ensayo o placas de 96 pocillos o placas de microtitulación, otros
recipientes, superficies y sustratos adecuados, membranas tales
como filtro de nitrocelulosa, reactivos de lavado y tampones (que
pueden variar en pH y en concentración de magnesio), agua estéril,
aceite mineral, BSA (seraalbúmina bovina), MgCl_{2},
(NH_{4})_{2}SO_{4}, DMSO (dimetilsulfóxido),
mercaptoetanol, nucleótidos (dNTPs), enzimas tales como
Taq-polimerasa y transcriptasa inversa y, como
matriz del DNA, el DNA o cDNA específico para la Pasteurella
trehalosi y/o Mannheimia haemolytica, oligonucleótidos
específicos para un DNA o RNA de una Pasteurella
trehalosi y/o Mannheimia haemolytica, patrón de
control, DEPC-agua, DNAsa, RNAsa y compuestos
adicionales conocidos por el técnico experto, pero sin limitarse a
ellos. Los oligonucleótidos según la invención son moléculas de
ácido nucleico cortas de aproximadamente 15 a aproximadamente 100
nucleótidos de longitud, que se unen bajo condiciones rigurosas a
la secuencia de ácido nucleico que es complementaria a una proteína
de la Pasteurella trehalosi y/o Mannheimia
haemolytica. Por condiciones rigurosas los expertos quieren
indicar condiciones que seleccionan más del 85%, preferiblemente más
del 90% de homología (cf. Sambrook et al., (1989) Molecular
Cloning:A Laboratory Manual, 2^{nd} ed., Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York and bertram, S. And
gassen, H. G. Gentechnische methoden, G. Fischer verlag, Stuttgart,
New York, 1991).
Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar
adicionalmente la presente invención; pero no se debe considerar a
los mismos como limitantes del alcance de la invención descrita
aquí.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
A partir de observaciones en el campo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Tres cepas de un nuevo tipo de bacterias
Gram-negativas, anaeróbicas facultativas, con forma
de bastón pleomórfico, fueron depositadas en el American Type
Culture Collection (ATCC), 1081, University Boulevard, Manassas, VA
20110-2209, USA, bajo el número de depósito: ATCC
No. PTA-3667 para BIV-4985
Pasteurella trehalosi; ATCC No. PTA-3668
para BIV-AVICOR Pasteurella trehalosi y ATCC
No. PTA-3669 para BIV-07990,
Mannheimia haemolytica. Siendo la fecha del depósito el 22
de agosto de 2001.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Se hizo la determinación del tipo las bacterias
depositadas de acuerdo con métodos de determinación estándar,
usando el Bergey's Manual of Systematic Bacteriology Volume I (1984.
Williams and Wilkins, 428 East Preston Street. Baltimore, USA.)
\newpage
\hrule
\vskip1.000000\baselineskip
Colonias cultivadas en agar con sangre de oveja
durante 24 horas, intervalo desde 1,0 a 1,5 mm de diámetro,
translúcidas brillantes, convexas bajas, suaves y cremosas, con
\beta-hemolisis.
Gram-negativas, no móviles,
bastones pleomórficos, presentan a menudo tinción bipolar.
\vskip1.000000\baselineskip
Sección A
\vskip1.000000\baselineskip
Sección B
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hrule
\vskip1.000000\baselineskip
Colonias cultivadas en agar con sangre de oveja
durante 24 horas, intervalo desde 1,0 a 1,5 mm de diámetro,
translúcidas brillantes, convexas bajas, suaves y cremosas, con
\beta-hemolisis.
Gram-negativas, no móviles,
bastones pleomórficos, presentan a menudo tinción bipolar.
\vskip1.000000\baselineskip
Sección A
\vskip1.000000\baselineskip
Sección B
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\hrule
\vskip1.000000\baselineskip
Colonias cultivadas en agar de sangre de oveja
durante 24 horas, intervalo desde 1,0 a 1,5 mm de diámetro,
translúcidas brillantes, convexas bajas, suaves y cremosas, con
\beta-hemolisis.
Gram-negativas, no móviles,
bastones pleomórficos, presentan a menudo tinción bipolar.
\vskip1.000000\baselineskip
Sección A
\vskip1.000000\baselineskip
Sección B
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados de los ensayos de las secciones A
y B (tablas 1, 2 y 3) confirman que las bacterias
BIV-4895; ATCC Nº PTA-3667 y
BIV-AVICOR; ATCC Nº PTA- 3668 pertenecen a la
familia Pasteurellaceae, (Pasteurella trehalosi, que son
trehalosa-positivas y
arabinosa-negativas), mientras que las bacterias
BIV-07990; ATCC Nº PTA-3669
pertenece a la familia Mannheimia (Mannheimia haemolytica,
que son trehalosa-negativas y arabinosa-
negativas).
negativas).
\newpage
\global\parskip0.900000\baselineskip
Se aislaron las bacterias de la traquea,
hendidura del paladar, ovario, hígado, corazón, riñón y gónadas,
infectados (pollos broiler). Se identificaron como
Pasteurella trehalosi y Mannheimia haemolytica
basándose en los ensayos listados a continuación:
- Beta-Hemólisis
- +
- Tinción por Gram
- -
- Oxidasa
- +
- Catalasa
- +
- Mac Conkey
- +
- Ureasa
- -
- Nitrato
- +
- Indol
- -
No se hicieron aislamientos de virus ni de
ninguna otra bacteria.
Los aislados bacterianos se purificaron y se
hizo la determinación de su biotipo según el método descrito por
Jaworski et al. (1). Se identificaron tres biotipos
diferentes (4, 2, 1).
En resumen, a partir de los aislados
purificados, se inoculó una única colonia en los tubos que contienen
3 ml de caldo de triptosa y se incubaron a 37ºC durante 8 horas. Un
asa de inóculo (20 \mul) del tubo se transfirió después a otro
tubo que contenía 3 ml de azúcar al 1% para ser ensayado e incubado
durante 7 días a 37ºC antes de que se registrasen los
resultados.
Después de la purificación de las bacterias, se
cultivaron los aislados en medios de triptosa para obtener grandes
cantidades de patógenos puros. Para validar los postulados de Koch,
3 grupos diferentes (20 aves por grupo) de pollos de 13 semanas de
edad libres de patógenos específicos (SPF) se infectaron con cada
biotipo (0,2 ml/ave; 3x10^{8} CFU/ml) por vía intravenosa. Se
observó a las aves diariamente durante 3 días en cuanto a la
morbididad y mortandad. Al final del tercer día, se sacrificaron
todas las aves, se registraron las lesiones
post-muerte y se recogieron muestras de órganos
(hígado y gónadas) para re-aislamiento. Se
registraron también las lesiones post-muerte de las
aves que murieron.
Señales clínicas: postración, cojera,
cresta descolocada, plumas erizadas, cianosis en la punta de la
cresta.
Lesiones:
Se cultivaron las cepas en caldo de triptosa
(TB). La recolección se realizó en fase de crecimiento logarítmico
alrededor de 6-8 horas después de la inoculación
dependiendo de la cepa. El recuento de la placa se realizó en agar
con sangre de oveja para titulación. Se determinaron las unidades
formadoras de colonias por mililitro (CFU/ml) usando diluciones
1:10 de la recolección. Las células se mataron añadiendo
formaldehído hasta una concentración final del 0,2%. Después de un
ensayo de esterilidad de esta suspensión, se añadió un título
mínimo de 10^{8} CFU/ml a la vacuna final.
Se preparó la vacuna mezclando las dos cepas
(BIV-4895, ATCC Nº PTA-3667 y
BIV-AVICOR, ATCC Nº PTA-3668) y
adyuvante oleoso (una emulsión de agua en aceite sobre la base de un
aceite mineral con una proporción de 60% de aceite/40% de agua)
hasta una concentración mínima de 10^{7,0} CFU/cepa/ml.
Se vacunaron los pollos libres de patógenos
específicos (SPF) a las 2,5 y 9 semanas de edad por inyección de
0,5 ml de la vacuna subcutáneamente hacia la mitad del cuello.
Las cepas bacterianas BIV-4895,
ATCC Nº PTA-3667 y BIV-AVICOR, ATCC
Nº PTA-3668, fueron cultivadas sobre agar con
sangre de oveja durante 24 horas a 37ºC. Se recolectaron las células
en caldo de triptosa (TB) hasta que se obtuvo una suspensión con
una densidad óptica de 2,0, usando un espectrofotómetro a una
longitud de onda de 540 nm. Para la exposición, se hicieron las
preparaciones que contienen el siguiente número de células en el
volumen final de exposición:
3 x 10^{9} CFU/ml BIV-AVICOR;
ATCC Nº PTA-3668
1,45 x 10^{10} CFU/ml
BIV-4895; ATCC Nº PTA-3667
\vskip1.000000\baselineskip
A las 13 semanas de edad, 20 aves vacunadas y 20
aves no vacunadas fueron expuestas por vía intravenosa a 0,2 ml de
inóculo (al menos 10^{8,0} CFU/ave). Se observaron las aves
durante 3 días en cuanto a la morbididad y mortandad. Después de
tres días de observación se sacrificaron todas las aves restantes y
volvieron a aislar las bacterias del hígado y de las gónadas de
cada ave. Se registraron también las lesiones
post-muerte de las aves que murieron.
Se cultivaron las cepas en caldo de triptosa
(TB). La recolección se realizó en fase de crecimiento logarítmico
alrededor de 6-8 horas después de la inoculación
dependiendo de la cepa. El recuento de la placa se realizó en agar
con sangre de oveja para titulación. Se determinaron las unidades
formadoras de colonias por mililitro (CFU/ml) usando diluciones
1:10 de la recolección. Las células se mataron añadiendo
formaldehído hasta una concentración final del 0,2%. Después de un
ensayo de esterilidad de esta suspensión, se añadió un título
mínimo de 10^{8} CFU/ml a la vacuna final.
Se preparó la vacuna mezclando las tres cepas
(BIV-4895, ATCC Nº PTA-3667;
BIV-AVICOR, ATCC Nº PTA-3668 y
BIV-07990, ATCC Nº PTA-3669) y
adyuvante oleoso (una emulsión de agua en aceite sobre la base de un
aceite mineral con una proporción de 60% de aceite/40% de agua)
hasta una concentración mínima de 10^{7,0} CFU/cepa/ml.
Se vacunaron los pollos libres de patógenos
específicos (SPF) a las 2,5 y 9 semanas de edad por inyección de
0,5 ml de la vacuna subcutáneamente hacia la mitad del cuello.
Las cepas bacterianas BIV-4895,
ATCC Nº PTA-3667; BIV-AVICOR, ATCC
Nº PTA-3668 y BIV-07990, ATCC Nº
PTA-3669, fueron cultivadas sobre agar con sangre
de oveja durante 24 horas a 37ºC. Se recolectaron las células en
caldo de triptosa (TB) hasta que se obtuvo una suspensión con una
densidad óptica de 2,0, usando un espectrofotómetro a una longitud
de onda de 540 nm. Para la exposición, se hicieron las preparaciones
que contienen el siguiente número de células en el volumen final de
exposición:
8.3 x 10^{9} CFU/ml
BIV-AVICOR; ATCC Nº PTA-3668
2,2 x 10^{9} CFU/ml BIV-4895;
ATCC Nº PTA-3667
1,0 x 10^{10} CFU/ml
BIV-07990; ATCC Nº PTA-3669
\vskip1.000000\baselineskip
A las 13 semanas de edad, 20 aves vacunadas y 20
aves no vacunadas fueron expuestas por vía intravenosa a 0,2 ml de
inóculo (al menos 10^{8.0} CFU/ave). Se observaron las aves
durante 3 días en cuanto a la morbididad y mortandad. Después de
tres días de observación se sacrificaron todas las aves restantes y
se volvieron a aislar las bacterias del hígado y de las gónadas de
cada ave. Se registraron también las lesiones
post-muerte de las aves que
murieron.
murieron.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se produjeron sueros hiperinmunes en conejos con
el aislado que representa a cada biotipo, según el método de
Biberstein et al.(2)
Los aislados fueron cultivados sobre agar con
sangre durante la noche, después se recogieron en solución salina
que contenía 0,3% de formalina. Se lavaron las células una vez y se
ajustaron hasta una transmitancia del 10% a 575 nm para inyección.
Las inyecciones se realizaron por la vía IV de acuerdo con el
siguiente programa: 0,5 ml, 1,0, 2,0, 3,0, 3,0, 3,0 a intervalos de
4 días y todos los conejos se sangraron 4 días después de la
inyección final.
Se ensayó el suero hiperinmune en cuanto a su
especificidad usando las cepas de los 3 biotipos y se hicieron
reaccionar con antisuero de conejo homólogo y heterólogo (diluciones
de 2 veces) por aglutinación en placa rápida.
Se diluyó el antisuero de cada biotipo hasta que
se alcanzó el punto final para determinar la dilución más alta que
fuese positiva.
\newpage
Dilución
(log^{2})
Antígeno Biotipo
1
\vskip1.000000\baselineskip
Dilución
(log^{2})
Antígeno Biotipo
4
\vskip1.000000\baselineskip
Dilución
(log^{2})
Antígeno Biotipo
2
Los sueros hiperhinmunes específicos de un
biotipo se usaron después como testigo positivo en el ensayo de
aglutinación del suero en micro-placas.
Las cepas bacterianas BIV-4895,
ATCC Nº PTA-3667; BIV-AVICOR, ATCC
Nº PTA-3668 y BIV-07990, ATCC Nº
PTA-3669, fueron cultivadas sobre agar con sangre
de oveja durante 24 horas a 37ºC. Se recolectaron las células en
caldo de triptosa (TB) hasta que se obtuvo una suspensión con una
densidad óptica de 2,0, usando un espectrofotómetro a una longitud
de onda de 540 nm. Para la exposición, se hicieron las preparaciones
que contienen el siguiente número de células en el volumen final de
exposición:
1,5 x 10^{10} CFU/ml
BIV-AVICOR; ATCC Nº PTA-3668
1,7 x 10^{10} CFU/ml BIV-4895;
ATCC Nº PTA-3667
1,6 x 10^{10} CFU/ml
BIV-07990; ATCC Nº PTA-3669
\vskip1.000000\baselineskip
A las 13 semanas de edad, se expusieron 20 aves
vacunadas y 20 aves no vacunadas por vía intravenosa a 0,2 ml de
inóculo (al menos 10^{8,0} CFU/ave). Se observaron las aves
durante 3 días en cuanto a la morbididad y mortandad. Después de
tres días de observación se sacrificaron todas las aves restantes,
se registraron las lesiones post-muerte y se
volvieron a aislar las bacterias del hígado y de las gónadas de cada
ave.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
1) Jaworski M.D., D. L. Hunter, A.
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4) Köhler, G., Milstein, C.
Continous culture of fused cells secreting antibody of predefined
specifity. Nature 1975, 265:
495-497.
Claims (21)
1. Bacteria Gram-negativa, con
forma de bastón pleomórfico que causa una enfermedad del tracto
respiratorio superior y del tracto reproductivo de pollos, donde
dicha bacteria se selecciona del grupo de Pasteurella
trehalosi o Mannheimia haemolytica, y en donde dicha
bacteria es beta-hemólisis-positiva,
oxidasa-positiva,
catalasa-positiva, ureasa-negativa,
nitrato-positiva, indol-negativa,
MacConkey-positiva,
glucosa-positiva,
sacarosa-positiva, manitol-positiva,
arabinosa-negativa,
celobiosa-negativa, xilosa-positiva,
salicina-negativa,
ornitina-negativa,
esculina-negativa,
alfa-fucosidasa-negativa y
beta-galactosidasa-positiva.
2. La bacteria de acuerdo con la reivindicación
1, en la que dicha bacteria es
trehalosa-positiva.
3. La bacteria de acuerdo con la reivindicación
1, en la que dicha bacteria es
trehalosa-negativa.
4. La bacteria de acuerdo con la reivindicación
2, en donde dicha bacteria está depositada con el número de
registro ATCC Nº PTA-3667.
5. La bacteria de acuerdo con la reivindicación
2, en donde dicha bacteria está depositadacon el número de registro
ATCC Nº PTA-3668.
6. La bacteria de acuerdo con la reivindicación
3, en donde dicha bacteria está depositada con el número de
registro ATCC Nº PTA-3669.
7. La bacteria de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 6, en donde dicha bacteria está
inactivada.
8. La bacteria inactivada de acuerdo con la
reivindicación 7, en donde dicha bacteria se selecciona de una
cualquiera de las bacterias depositadas con el número de registro
ATCC Nº PTA-3667,ATCC Nº PTA-3668 o
ATCC Nº PTA-3669.
9. La bacteria de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 6, en donde dicha bacteria está viva
atenuada.
10. La bacteria de acuerdo con la reivindicación
9, en donde dicha bacteria viva atenuada se obtiene de las
bacterias depositadas con el número de registro ATCC Nº
PTA-3667,ATCC Nº PTA-3668 o ATCC Nº
PTA-3669.
11. Una composición de una vacuna que comprende
una bacteria inactivada de acuerdo con la reivindicación 7 u 8 o
una bacteria viva atenuada de acuerdo con la reivindicación 9 ó
10.
12. Una composición de vacuna que comprende un
fragmento o fracción de una cualquiera de las bacterias de acuerdo
con las reivindicaciones 1 a 6, en donde dicho fragmento o fracción
contiene al menos un antígeno para la profilaxis de infecciones por
Pasteurella trehalosi o Mannheimia
haemolytica.
13. La composición de una vacuna según la
reivindicación 11 ó 12, que comprende, además, uno o más adyuvantes
y/o excipientes y/o vehículos adecuados.
14. La composición de una vacuna según las
reivindicaciones 11 a 13, en donde dicha vacuna comprende dos o más
cepas de la bacteria inactivada según las reivindicaciones 7 u 8,
dos o más cepas de la bacteria viva atenuada según la
reivindicación 9 ó 10, o fragmentos o fracciones que contienen al
menos un antígeno para la profilaxis de infecciones por
Pasteurella trehalosi o Mannheimia haemolytica
de dos o más cepas de bacterias de la bacteria según las
reivindicaciones 1 a 6.
15. La composición de una vacuna según una
cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, en donde dichas
bacterias vivas o vivas atenuadas, o bacteria/bacterias
inactivada(s) se seleccionan de bacterias depositadas con el
número de registro ATCC Nº PTA-3667,ATCC Nº
PTA-3668 o ATCC Nº PTA-3669.
16. La composición de una vacuna según una
cualquiera de las reivindicaciones 11 a 15, que comprende, además,
al menos otro antígeno procedente de un virus o microorganismo
patógeno para pollos.
17. La composición de una vacuna según la
reivindicación 16, en la que dicho virus o microorganismo se
selecciona del grupo constituido por virus de la bronquitis
infecciosa, virus de la enfermedad de Newcastle, virus de la
enfermedad bursal infecciosa, agente de la anemia de los pollos,
reovirus aviar, Micoplasma gallisepticum, neumovirus aviar,
Haemophilus paragallinarum, poxvirus de los pollos, virus de
la encefalomielitis aviar, Pasteurella multocida y E.
coli.
18. Uso de la bacteria según una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 10, o fragmentos o fracciones que
contienen al menos un antígeno de dicha bacteria para la profilaxis
de infecciones por Pasteurella trehalosi o
Mannheimia haemolytica en la fabricación de una vacuna para
la profilaxis de infecciones por Pasteurella
trehalosi o Mannheimia haemolytica.
19. Método para detectar una bacteria de acuerdo
con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 que provoca una
enfermedad del tracto respiratorio y del tracto reproductivo, in
vitro en una muestra, que comprende la etapa de analizar dicha
muestra en cuanto a la presencia de dicha bacteria.
20. El método según la reivindicación 19, en el
que la presencia de cualquiera de las bacterias según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 se determina por un ensayo
inmune.
21. El método según la reivindicación 20, en el
que la presencia de cualquiera de las bacterias según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 se determina por un método
de biología molecular.
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