PT1645567E - Cultura de lawsonia intracellularis, vacinas anti-lawsonia intracellularis e agentes de diagnóstico - Google Patents

Cultura de lawsonia intracellularis, vacinas anti-lawsonia intracellularis e agentes de diagnóstico Download PDF

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Description

DESCRIÇÃO "CULTURA DE LAWSONIA INTRACELLULARIS, VACINAS ANTI-LAWSONIA INTRACELLULARIS E AGENTES DE DIAGNÓSTICO"
Campo da Invenção A presente invenção dirige-se a vacinas anti-Lawsonia intracellularis e métodos para protecção contra e diagnóstico da infecção com Lawsonia intracellularis. Os produtos e processos da invenção são alcançáveis, em parte, como o resultado do método melhorado que foi desenvolvido para cultivar fornecimentos em grande escala de L. intracellularis.
Descrição da Técnica Relacionada L. intracellularis, o agente causador da enteropatia proliferativa porcina ("PPE"), afecta virtualmente todos os animais incluindo humanos, coelhos, furões, hamsters, raposa, cavalos e outros animais tão diversos como avestruzes e emas. L. intracellularis é uma causa particularmente grande de perda em varas de suinos. As estimativas da prevalência e incidência de PPE nos E.U.A. têm sido tão elevadas quanto 20 porcento das varas de suinos com perdas estimadas de 20 milhões de dólares anualmente.
Uma caracteristica consistente de PPE é a ocorrência de bacilos intracitoplásmicos, curvos, não ligados à membrana em 1 enterócitos em porções afectadas do intestino. As bactérias associadas com PPE foram referidas como "organismos do tipo Campylobacter". S. McOrist et al., Vet. Pathol., Vol. 26, 260-64 (1989). Subsequentemente, as bactérias causadoras foram identificadas como um novo género e espécie taxonómicos, vernaculamente referidos como Simbionte do íleo (IS) intracellularis. C. Gebhart et al., Int'l. J. of Systemic Bacteriology, Vol. 43, No. 3, 533-38 (1993). Mais recentemente, estas novas bactérias foram designadas com o nome taxonómico de Lawsonla (L.) intracellularis. S. McOrist et al., Int'l. J. of Systemic Bacteriology, Vol. 45, No. 4, 820-25 (1995). Estes três nomes têm sido utilizados indistintamente para referir o mesmo organismo aqui identificado e descrito mais adiante. Foi decidido utilizar o nome taxonómico, L. intracellularis, ao longo da discussão da presente invenção. L. intracellularis é uma bactéria intracelular obrigatória, que não pode ser cultivada através de métodos bacteriológicos normais em meios convencionais sem células e pensou-se que necessitaria de estar ligada a células epiteliais para o seu crescimento. S. McOrist et al., Infection and Immunity, Vol. 61, No. 10, 4286-92 (1993) e G. Lawson et al., J. of Clinicai Microbiology, Vol. 31, No. 5, 1136-42 (1993) discutem a cultura de L. intracellularis utilizando monocamadas de células epiteliais de intestino de rato IEC-18 em frascos convencionais de cultura de tecidos. Adicionalmente, H. Stills, Infection and Immunity, Vol. 59, No. 9, 3227-36 (1991) discute a utilização de monocamadas de células do intestino embrionário humano Intestine 407 e monocamadas de células de adenocarcinoma do cólon do cobaio GPC-16 em frascos de cultura de tecidos convencionais. Estes métodos de cultura anteriores são muito trabalhosos e não são adequados para aumento de escala. 2 0 conhecimento actual da infecção por L. intracellularis e o tratamento e controlo eficaz da doença foi seriamente impedido pelos requisitos de crescimento fastidiosos de L. intracellularis em culturas in vitro. Existe uma necessidade actual de um método melhorado para cultivar L. intracellularis. Existe também uma necessidade para vacinas anti-h. intracellularis e ferramentas eficazes para diagnosticar infecção com L. intracellularis.
Sumário da Invenção
Um objectivo da invenção é proporcionar vacinas anti-L. intracellularis.
Outro objectivo da invenção é proporcionar métodos para detectar a presença de anticorpos contra L. intracellularis em amostras biológicas.
Outro objectivo é proporcionar um método de cultura melhorado permitindo a cultura de L. intracellularis em larga escala para a produção de vacinas e agentes de diagnóstico.
Para alcançar estes e outros objectivos e de acordo com a finalidade da invenção como aqui realizada e descrita de um modo lato, a presente invenção proporciona um método para cultivar L. intracellularis e preparações de bactérias em larga escala produzidas através dele. De acordo com o método, as bactérias L. intracellularis são incubadas a uma concentração de oxigénio desde cerca de 0 porcento até cerca de 18 porcento, enquanto se agitam as bactérias para cultivar as L. intracellularis enquanto se mantêm as bactérias em suspensão. 3
De acordo com outra forma de realização, é proporcionado um método para cultivar bactérias L. intracellularis inoculando uma monocamada de células HEp-2, McCoys, ou IEC-18, que está a cerca de 30 porcento de confluência, com um inoculo compreendendo bactérias L. intracellularis de modo a infectar as células com as bactérias. As células infectadas são então incubadas a uma temperatura de cerca de 36 até cerca de 38 °C a uma concentração de oxigénio de cerca de 0 porcento até cerca de 8,0 porcento até as células atingirem a confluência. As células infectadas e o meio de cultura são, então, colocados num fermentador, biorreactor, frasco de agitação ou outro recipiente adequado para manter as células em suspensão. As células infectadas são incubadas enquanto se agitam de modo a cultivar as bactérias L. intracellularis enquanto se mantêm as células infectadas em suspensão. Uma porção das L. intracellularis cultivadas é então passada para células em cultura fresca para aumentar a produção de bactérias L. intracellularis. A invenção proporciona vacinas anti-A. intracellularis e métodos para produzir vacinas contra A. intracellularis. Uma bactéria A. intracellularis avirulenta é produzida passando as bactérias L. intracellularis cultivadas um número suficiente de vezes e seleccionando uma estirpe atenuada ou submetendo as bactérias cultivadas a meios de atenuação químicos. Também são preparadas vacinas de L. intracellularis mortas, utilizando os métodos de cultura da invenção. De acordo com uma forma de realização particularmente preferida, as bactérias são cultivadas em contínuo durante, pelo menos, cerca de 6 a 8 meses enquanto são passadas, pelo menos, cerca de 7 a 12 vezes para produzir uma estirpe atenuada para utilização como uma vacina. A bactéria atenuada é então misturada com um veículo farmaceuticamente aceitável e administrada a um animal numa 4 quantidade eficaz para produzir uma resposta imunitária. A estirpe atenuada presentemente preferida (N343NP40wk) foi depositada na American Type Culture Collection. A invenção também proporciona um método para determinar a presença de anticorpos que reagem especificamente com bactérias L. intracellularis numa amostra biológica recolhendo, pelo menos, uma porção das bactérias L. intracellularis cultivadas, contactando uma amostra biológica de um animal com bactérias L. intracellularis recolhidas ou um componente destas em condições nas quais o anticorpo presente na amostra biológica reage com a L. intracellularis ou seu componente, e determinando se ocorreu uma reacção anticorpo-antigénio.
Serão apresentadas caracteristicas e vantagens adicionais da invenção na descrição que se segue e serão óbvias a partir da descrição ou podem ser aprendidas pela prática da invenção.
Descrição das Formas de Realização Preferidas
Como aqui utilizado, o termo "L. intracellularis" significa a bactéria intracelular, curvada, gram-negativa descrita em detalhe por C. Gebhart et al., Int'l. J. of Systemic Bacteriology, Vol. 43, No. 3, 533-38 (1993) e S. McOrist et al. Int'l. J. of Systemic Bacteriology, Vol. 45, No. 4, 820-25 (1995) (cada um dos quais é aqui incorporado por referência na sua totalidade) e inclui, mas não está limitado à bactéria depositada como ATCC 55672 na American Type Culture Collection, Rockville, MD; a bactéria depositada como NCTC 12656 e 12657 na National Collection of Type Cultures, Colindale, Londres; a bactéria causadora que pode ser obtida de suínos ou outros 5 animais infectados com PPE em todo o Mundo, dado o conhecimento na técnica e os ensinamentos aqui apresentados; e variantes ou mutantes de qualquer uma das bactérias acima, quer obtidas espontaneamente ou artificialmente.
Como aqui utilizado, o termo "estirpe atenuada" significa qualquer estirpe de L. intracellularis que é preparada de acordo com as técnicas de cultura e passagem aqui ensinadas para alcançar avirulência, mantendo, simultaneamente, as propriedades imunogénicas quando administrada a um animal hospedeiro. Como demonstrado abaixo, várias estirpes diferentes de L. intracellularis foram cultivadas e atenuadas, de acordo com os presentes ensinamentos, para obter estirpes imunogénicas atenuadas possuindo eficácia como vacinas em suinos e outros animais susceptiveis a infecção por L. intracellularis. É esperado que as estirpes atenuadas da invenção possuam utilidade como imunogénios em vacinas antimicrobianas para animais, incluindo pássaros, peixes, gado, suínos, cavalos, mamíferos e primatas em geral, e humanos. Essas vacinas podem ser preparadas por técnicas conhecidas dos especialistas na matéria, dados os ensinamentos aqui contidos. Uma tal vacina compreenderia uma quantidade imunologicamente eficaz da estirpe atenuada num veículo farmaceuticamente aceitável. A vacina seria administrada em uma ou mais doses. Uma quantidade imunologicamente eficaz é determinável por meios conhecidos na técnica sem experimentação excessiva, dados os ensinamentos aqui contidos. A quantidade de bactérias avirulentas seria suficiente para estimular uma resposta imunitária em animais susceptiveis de doença embora ainda mantendo-se avirulentas. Esta iria depender do animal, bactéria, e doença particulares envolvidas. A dose recomendada a ser administrada ao animal susceptível é, 6 de um modo preferido cerca de 103 a 109 bactérias/Kg de peso corporal e, de um modo muito preferido, cerca de 105 a 107 bactérias/Kg de peso corporal. Os veículos são conhecidos dos especialistas na técnica e incluem estabilizadores e diluentes. Uma tal vacina também pode conter um adjuvante apropriado. As vacinas da invenção podem ser utilizadas em combinação com outras vacinas, por exemplo, como um diluente de outra vacina liofilizada ou combinada antes da liofilização com outra vacina. As preparações de vacina também podem ser desidratadas, por exemplo, por liofilização para efeitos de armazenamento ou para formulação subsequente em vacinas líquidas.
Consequentemente, a invenção também compreende um método para induzir uma resposta imunitária contra bactérias L. intracellularis virulentas, de tipo selvagem, num hospedeiro animal com o objectivo de proteger o hospedeiro dessas bactérias. O método compreende administrar uma quantidade imunologicamente eficaz da bactéria atenuada ou bactéria morta da invenção ao hospedeiro e, de um modo preferido, administrar a vacina da invenção ao hospedeiro.
Como aqui utilizado, o termo "cultura em larga escala" significa um nível de cultura de L. intracellularis superior a aproximadamente 2,0 a 3,0 litros e inclui a produção numa escala de 100 litros ou mais. "Cultura" como aqui utilizado, significa o processo de promover o crescimento, reprodução e/ou proliferação de L. intracellularis.
Na realização do método de cultura da invenção, as células em cultura podem ser, primeiro, inoculadas com um inoculo compreendendo bactérias L. intracellularis, de modo a infectar as células com a bactéria. Podem ser utilizadas numerosas linhas 7 celulares na realização da invenção, incluindo, mas não limitadas a, IEC-18 (ATCC 1589) - células epiteliais de intestino de rato, HEp-2 (ATCC 23) - células de carcinoma epidermóide humano, McCoys (ATCC 1696) - células de murganho (não especificadas), MDCK (ATCC 34) - células de rim de canino Madin-Darby, bgmk (Biowhittaker m° 71-176) - células de rim de macaco verde búfalo, e células do epitélio do intestino de suínos. As células em cultura preferidas são células HEp-2, McCoys ou IEC-18. Alternativamente, as bactérias podem ser cultivadas num sistema livre de células desde que as bactérias sejam mantidas na concentração apropriada de O2 dissolvido como aqui ensinado.
Se são utilizadas células em cultura, antes de serem inoculadas, as células estão, de um modo preferido, mas não precisam de estar, na forma de uma monocamada. Para formar uma monocamada, as células podem ser semeadas em frascos convencionais. Cada frasco é geralmente semeado com, entre cerca de 1 X 105 células até cerca de 10 X 105 células por frasco de 25 cm2, misturadas com meio de crescimento. O meio de crescimento pode ser qualquer meio para cultura de células que inclui uma fonte de azoto, factores de crescimento necessários para as células em cultura escolhidas e uma fonte de carbono, tais como glucose ou lactose. O meio preferido é DMEM com 2-5% de soro fetal de bovino, embora possam ser utilizados vários outros meios disponíveis comercialmente com bons resultados.
Verificou-se que a cultura com sucesso de L. intracellularis é aumentada mantendo as células em cultura num estado constante de crescimento. Por isso, a monocamada de células em cultura deve estar a cerca de 20 porcento até cerca de 50 porcento de confluência no momento da inoculação. De um modo preferido, as células devem estar a cerca de 30 porcento até cerca de 40 porcento de confluência no momento da inoculação, sendo o mais preferido cerca de 30 porcento de confluência.
O inoculo pode ser uma cultura pura de L. intracellularis obtida, por exemplo, do depósito ATCC 55672, depósitos NCTC 12656 ou 12657, ou de suínos infectados ou outros animais, utilizando os ensinamentos de isolamento e purificação aqui discutidos.
De acordo com uma forma de realização, o inoculo para realizar a invenção é um homogenato intestinal preparado eliminando, por raspagem a mucosa do íleo de um suíno ou outro animal infectado com PPE. Quando se prepara um homogenato intestinal, as secções de íleo seleccionadas para cultura devem apresentar graves lesões com espessamento grosseiro do intestino. Devido à natureza frágil das bactérias, as amostras devem, de um modo preferido, ser armazenadas a -70 °C tão rapidamente quanto possível após necropsia. Um antibiótico para o qual L. intracellularis é resistente, tais como Vancomicina, Anfotericina B ou membros do grupo aminoglucósido dos antibióticos, incluindo Gentamicina e Neomicina, para referir apenas alguns é, de um modo preferido, adicionado ao inoculo para suprimir bactérias contaminantes permitindo, simultaneamente, o crescimento de L. intracellularis. Quer o inoculo seja uma cultura pura ou um homogenato intestinal, a inoculação das células em cultura pode ser realizada por várias técnicas conhecidas na matéria dados os ensinamentos aqui apresentados.
As bactérias e/ou as células de cultura inoculadas são, então, incubadas sob uma concentração reduzida de 02 dissolvido. 9 A concentrações de oxigénio dissolvido superiores a 18%, o crescimento de L. intracellularis é inferior ao óptimo com a cessação do crescimento ocorrendo, eventualmente, a concentrações de oxigénio fora deste intervalo. De um modo preferido, as células em cultura inoculadas são incubadas numa concentração de oxigénio dissolvido no intervalo desde cerca de 0% até cerca de 10%. De um modo mais preferido, as células são incubadas numa concentração de oxigénio no intervalo desde cerca de 0% até cerca de 8%, sendo muito preferida uma concentração de oxigénio de cerca de 0% até cerca de 3,0%. A concentração apropriada de dióxido de carbono é também importante para o crescimento apropriado de L. intracellularis. A concentrações de dióxido de carbono superiores a 10% e inferiores a 4%, o crescimento não óptimo ocorre com a terminação do crescimento ocorrendo, eventualmente, a concentrações de dióxido de carbono fora deste intervalo. De um modo preferido, a concentração de dióxido de carbono está no intervalo desde cerca de 6% até cerca de 9%, sendo muito preferida uma concentração de dióxido de carbono de cerca de 8, 8%.
Adicionalmente, as células são, de um modo preferido, incubadas a uma concentração de hidrogénio na gama desde cerca de 73% até cerca de 94%. Pode ser utilizado azoto em vez de algum ou todo o hidrogénio presente. De acordo com uma forma de realização particularmente preferida, as células são incubadas em cerca de 0-8,0% de 02, cerca de 8,8% de C02, e cerca de 83,2% de h2.
As células inoculadas podem ser incubadas numa incubadora dupla de gás ou outra câmara de gás que contém as concentrações 10 apropriadas de oxigénio e dióxido de carbono e que permite que as células sejam suspensas durante a incubação. A câmara deve compreender um meio para manter as células inoculadas em suspensão e um monitor de gás e fonte de fornecimento para fornecer e manter as concentrações de gás apropriadas. A temperatura de incubação deve estar no intervalo entre 30 °C e 45 °C e de um modo mais preferido, está no intervalo entre cerca de 36 °C até cerca de 38 °C. De um modo muito preferido, a temperatura é de cerca de 37 °C. O equipamento necessário para os métodos de cultura e atenuação da invenção está rapidamente disponível dos especialistas na técnica dados os ensinamentos aqui apresentados. Um exemplo de equipamento adequado para realizar a presente invenção é uma incubadora dupla de gás, e. g., modelo 480 disponível na Lab-Line, Melrose Park, Illinois, em conjunto com frascos de agitação para manter as células em suspensão. O equipamento presentemente preferido compreende um fermentador, biorreactor ou agitador rotativo contendo, pelo menos, cerca de 2 litros de meio e capaz de manter as células de cultura em suspensão através de aspersão do gás da concentração apropriada ou outro meio de agitação mecânica, e monitorizando continuamente os níveis de 02 dissolvido no meio. New Brunswick:, Braun e outras companhias produzem fermentadores e biorreactores adequados para este objectivo.
Mantendo as células inoculadas num estado de suspensão durante a incubação, o crescimento máximo das células, e desse modo L. intracellularis, é alcançado aumentando cada exposição da célula individual ao meio de crescimento e a mistura apropriada de oxigénio e dióxido de carbono. As células em cultura podem ser agitadas e mantidas em suspensão através de uma variedade de métodos conhecidos na técnica, incluindo, por 11 exemplo, frascos de cultura, garrafas de rolo, culturas em membrana e frascos de agitação. As células podem ser mantidas em suspensão durante a incubação, incubando as células num frasco de agitação dentro de uma incubadora dupla de gás ou dispositivo semelhante. 0 termo "frasco de agitação", como aqui utilizado, significa um frasco ou outro recipiente que emprega uma pá, hélice ou outro meio para agitar a cultura e manter as células ai contidas em suspensão.
Numa forma de realização particularmente preferida da invenção, as células inoculadas são incubadas até que as células atinjam a confluência e depois as células são colocadas num frasco de agitação contendo meio de crescimento e incubadas numa incubadora dupla de gás enquanto se mantém a agitação do frasco. De um modo preferido, as células inoculadas são raspadas para o frasco de agitação. Isto pode ser alcançado através de uma variedade de métodos conhecidos na técnica, tal como utilizando um raspador de células para destacar as células. Assim que as células são introduzidas no frasco de agitação, a pá do frasco de agitação é tipicamente rodada no intervalo desde cerca de 30 até cerca de 60 rpm de modo a manter as células infectadas em suspensão.
Uma porção de L. intracellularis cultivada é então passada para células em cultura frescas para aumentar a produção de bactérias L. intracellularis. O termo "passagem" ou variações deste, significa aqui o processo de transferir uma porção da L. intracellularis cultivada para células em cultura frescas de modo a infectar as células frescas com a bactéria. O termo "frescas", como aqui utilizado, significa células que ainda não foram infectadas por L. intracellularis. De um modo preferido, 12 essas células são, em média, não superiores a, aproximadamente, um dia de idade. A passagem de L. intracellularis em culturas em suspensão pode ser realizada removendo uma porção da cultura original e adicionando-o a um novo frasco contendo células de cultura fresca. Se a cultura original possui um número elevado de bactérias/mL, por exemplo, superior a cerca de 104 bactérias/mL, é preferida a adição entre cerca de 1 a 10% (volume por volume) de cultura do frasco infectado para um novo frasco contendo células frescas. Isto é, de um modo preferido, realizado quando 50-100% das células estão infectadas. Se menos de 50% das células estão infectadas, a passagem é realizada, de um modo preferido, separando a cultura 1:2 para um novo frasco e aumentando o volume adicionando meio fresco. Em qualquer dos casos, não são necessários a lise celular e outros passos, em contraste directo com a passagem de culturas em monocamada, como na técnica anterior.
Após crescimento suficiente das células em cultura e subsequente infecção por L. intracellularis a mais de cerca de 70% de infectividade das células, como determinado por IFA, TCID50 ou outro método comparável, pelo menos uma porção das bactérias cultivadas de L. intracellularis é então recolhida. O passo de recolha pode ser realizado separando as bactérias da suspensão através de várias técnicas conhecidas dos especialistas na matéria, dados os ensinamentos aqui apresentados. De um modo preferido, a bactéria L. intracellularis é recolhida por centrifugação do conteúdo da totalidade ou de uma porção da suspensão para sedimentar as células em cultura, ressuspendendo os sedimentos de células resultantes, e lisando as células infectadas. Tipicamente, pelo 13 menos uma porção dos conteúdos é centrifugada a cerca de 3000 X g durante cerca de 20 minutos de modo a sedimentar as células e bactérias. O sedimento pode ser então ressuspenso em, por exemplo, uma solução de sacarose-fosfato-glutamato (SPG) e passado aproximadamente quatro vezes através de uma agulha de calibre 25 de modo a lisar as células. Se for desejada purificação adicional, as amostras podem ser centrifugadas a cerca de 145 X g durante cerca de cinco minutos para remover núcleos de resíduos celulares. O sobrenadante pode ser então centrifugado a cerca de 3000 X g durante cerca de vinte minutos e o sedimento resultante ressuspenso num diluente apropriado, tal como SPG com soro de bovino fetal (para preparar bactérias recolhidas adequadas para congelação ou utilização como um inoculante) ou meio de crescimento (para preparar bactérias recolhidas mais adequadas para passar para células frescas).
Como mencionado anteriormente, o crescimento eficaz de L. intracellularis para a produção em larga escala é aumentado mantendo as células do tecido em crescimento activo. Com monocamadas, quando as culturas se tornam confluentes, a taxa de divisão celular diminui substancialmente. As tentativas para cultivar L. intracellularis em culturas de tecido em monocamada tiveram um sucesso limitado e o aumento de escala não foi possível. Todavia, a utilização de culturas em suspensão facilita grandemente manter as células em crescimento activo e permite a expansão e o aumento de escala da cultura em contínuo. Utilizando um fermentador e entre cerca de 0-3% de 02 dissolvido, como explicado acima, foi possível cultivar até 108 bactérias/mL. Também foi possível manter as bactérias cultivadas a crescer activamente durante muitos meses e espera-se que seja possível fazê-lo indefinidamente. 14
Antes da presente invenção, acreditava-se, de um modo geral, que as células devem ser ligadas a uma superfície de modo a serem infectadas por L. intracellularis. As suspensões celulares da presente invenção são únicas e contradizem esta teoria. Quando se utilizam células McCoys ou IEC-18, é preferido adicionar gelatina, agarose, colagénio, acrilamida ou esferas de silica, tais como microveiculos porosos Cultisphere-G fabricados por HyClone Laboratories, Logan, UT, juntamente com o meio de crescimento. Todavia, as células HEp-2 e outras não requerem microveiculos, de acordo com o método de cultura da invenção. Isto proporciona uma via, especialmente, vantajosa e económica para a cultura em larga escala.
Para objectivos de manutenção de cultura, com culturas HEp-2, de um modo preferido 25-50% da cultura é removida e substituída com meio fresco a intervalos semanais. Para as culturas de células com microveiculos ou esferas, de um modo preferido 25-50% da cultura é removida e substituída com microveiculos ou esferas frescos e meio fresco 1-2 vezes por semana. Para objectivos de aumento de escala, pode ser adicionado à cultura 25-50% adicional de meio, ou meio com microveiculos.
Dependendo da taxa à qual as células em cultura se tornam infectadas, a passagem para células frescas ocorre de um modo geral entre cerca de cada 2 até cerca de 5 semanas. Assumindo que as células em cultura se tornam, pelo menos, 70% infectadas no espaço de 2-3 semanas, de um modo preferido a passagem ocorre entre cerca de cada 3 a 4 semanas. A presente invenção também proporciona vacinas e métodos para produzir vacinas contra L. intracellularis. De acordo com 15 uma forma de realização particularmente preferida, após manter as células infectadas em suspensão durante um tempo extenso (por exemplo, 6-8 meses), pelo menos uma porção das bactérias L. intracellularis cultivadas são recolhidas e monitorizadas para potencial atenuação. Essa monitorização é, de um modo preferido, realizada por animal hospedeiro ou exposição de modelos animais para seleccionar uma estirpe atenuada. Essas estirpes atenuadas são utilizadas em vacinas de acordo com os métodos aqui ensinados. As vacinas de L. intracellularis atenuadas de acordo com a presente invenção demonstraram eficácia contra infecção com L. intracellularis numa variedade de animais e espera-se que também sejam eficazes em humanos. A presente invenção permite a expansão rápida da cultura, um aumento nos rendimentos de 100-1000 vezes e custo reduzido. Como resultado, o fornecimento abundante de bactérias L. intracellularis produzidas de acordo com o método de cultura da invenção é rapidamente atenuado para objectivos de produção de vacinas. A atenuação é difícil em culturas de monocamada devido ao baixo rendimento de bactérias produzidas, utilizando técnicas convencionais de crescimento em monocamada. Por outro lado, o método de crescimento de L. intracellularis da presente invenção aumenta grandemente a facilidade, a rapidez, e o número de bactérias disponíveis para este objectivo. Quantas mais células e divisões celulares ocorram, maior será o nível de mutações que ocorrem, que são vantajosas no desenvolvimento de vacina. Os crescimentos em suspensão de acordo com a invenção aumentam a expressão de imunogénios importantes controlados por genes regulados pelo ambiente e seus produtos de expressão.
As estirpes atenuadas resultantes podem ser cultivadas em monocamadas de cultura de tecido, como descrito no Exemplo 1 16 abaixo, mas são, de um modo preferido, cultivadas em culturas de suspensão de acordo com o método da invenção. Outro meio de atenuação pode incluir atenuação química através da utilização de, por exemplo, N-metilnitrosoguanadina e outros conhecidos na técnica. Quer através de passagens múltiplas ou meios químicos, é produzida uma L. intracellularis atenuada e seleccionada para preparação de vacina.
De acordo com uma forma de realização de vacina da invenção, o antigénio é recolhido por centrifugação ou microfiltração, como descrito acima. 0 antigénio é então padronizado a um nível definido com base na resposta imunitária óptima do animal hospedeiro, determinada por uma titulação de dose na espécie do animal hospedeiro. A bactéria pode ser inactivada por exposição prolongada, e. g., uma semana, a níveis de O2 ambiente, ou utilizando formalina a 0,3% ou outro agente de inactivação para preparar uma vacina morta. O antigénio é então incorporado num adjuvante adequado, tal como hidróxido de alumínio ou óleo mineral para aumentar a resposta imunitária. O antigénio é então utilizado para vacinar o hospedeiro através de injecção intramuscular ou subcutânea, no caso de porcos a cerca de 3-4 semanas de idade, com uma dose de reforço, se necessário.
Alternativamente, de acordo com uma forma de realização da vacina particularmente preferida utilizando os métodos de cultura previamente descritos, as bactérias são passadas em série para induzir e seleccionar para uma cultura viva atenuada, avirulenta. A cultura é testada no animal hospedeiro (após, de um modo preferido, pelo menos, 6 a 8 meses ou mais de crescimento na cultura em suspensão) para sinais de atenuação. A cultura é recolhida como descrito anteriormente e diluída. Por exemplo, são vacinados oralmente porcos com 1 X 105 até 1 X 106 17 bactérias. Cerca de vinte e oito dias após vacinação, os porcos são inoculados oralmente com cerca de 1 X 107 organismos de uma cultura virulenta de L. intracellularis menos passada (cerca de 30 a 45 dias de idade) . Os animais infectados são submetidos a necropsia 21 dias após a exposição e os intestinos delgados foram observados para lesões grosseiras assim como lesões microscópicas. Também devem ser realizadas PCR e anticorpo fluorescente. Cerca de oitenta porcento dos animais de controlo apresentarão lesões grosseiras ou microscópicas e revelaram-se positivas no teste para a presença de L. intracellularis nas células da mucosa dos intestinos utilizando quer métodos de teste de PCR ou FA. Os animais vacinados possuirão superfícies de mucosa normais, como determinado por observações histológicas e serão negativos por teste por PCR.
Geralmente, uma estirpe de L. intracellularis imunogénica atenuada é produzida após cultura contínua durante entre, pelo menos, cerca de 150 e 250 dias, durante cujo tempo a cultura é passada pelo menos cerca de 7 até cerca de 12 vezes. Outras culturas atenuadas podem ser produzidas, variando estes números, desde que a monitorização e os métodos de selecção aqui ensinados sejam empregues. É então preparada uma vacina compreendendo uma quantidade imunologicamente eficaz das L. intracellularis atenuadas num veículo farmaceuticamente aceitável. O imunogénio combinado e veículo podem estar numa solução aquosa, emulsão ou suspensão. Uma quantidade imunologicamente eficaz é determinável por meios conhecidos na técnica sem experimentação excessiva, dados os ensinamentos aqui contidos. Em geral, a quantidade de imunogénio estará entre 50 e 500 microgramas, e de um modo preferido entre 107 e 109 TCID50, quando são utilizadas bactérias purificadas. 18
As vacinas de acordo com a invenção são geralmente administradas a animais susceptiveis, de um modo preferido suínos, em uma ou mais doses. A vacina viva ou morta pode ser administrada 1 ou 2 vezes a intervalos de 2 semanas. Para as vacinas atenuadas, vivas, é preferida uma dose. As vias de administração preferidas de estirpes vivas atenuadas são oral ou intranasal, mas também pode ser utilizada injecção intramuscular ou subcutânea. As vias de injecção intramuscular e subcutânea são as mais preferidas para a vacina morta. 0 diagnóstico eficaz de PPE também foi impedido pelo tempo necessário para a cultura da bactéria causadora. Como um resultado da presente invenção, o desenvolvimento de ferramentas de diagnóstico promovendo ensaios rápidos e precisos para a presença de L. intracellularis em amostras biológicas recolhidas de suinos e outros animais susceptiveis a PPE é agora possível.
As bactérias L. intracellularis cultivadas de acordo com o método da presente invenção, ou componentes derivados dessas bactérias, podem ser utilizadas como um antigénio numa ELISA ou outro imunoensaio, tal como um teste com anticorpo imunofluorescente ("IFA"), para detectar anticorpos contra L. intracellularis no soro e noutros fluidos corporais de animais suspeitos de estarem infectados com a bactéria. 0 imunoensaio presentemente preferido é um IFA, como descrito no exemplo abaixo. Alternativamente, a bactéria cultivada de acordo com a invenção pode ser utilizada num ensaio de transferência de Western. 0 protocolo de ELISA preferido de acordo com esta forma de realização da invenção é como se segue: 19 1. Adicionar 0,1 mL/poço de antigénio diluído em tampão de revestimento. Incubar durante 18 horas a 4 °C. 2. Lavar 3 vezes com PBS. 3. Adicionar 0,25 mL de tampão de bloqueamento a cada poço da placa. Incubar 1 a 2 horas a 37 °c. 4. Lavar 3 vezes com tampão de lavagem. 5. Diluir o soro em tampão de bloqueamento e adicionar 0,1 mL aos primeiros poços da placa. Fazer diluições em série de 1:2 ao longo da placa. Incubar durante 1 hora a 37 °C. 6. Lavar 3-5 vezes com tampão de lavagem. 7. Diluir o conjugado em tampão de bloqueamento e adicionar 0,1 mL aos poços da placa e incubar durante 1 h a 37 °C. 8. Lavar 3-5 vezes com tampão de lavagem. 9. Adicionar substrato. 12. Medir a absorvência de luz com um espectrofotómetro. 13. Os poços nos quais o antigénio não foi adicionado são utilizados como brancos. 14. Deve também ser utilizado soro de porco como controlo positivo e negativo com cada teste. O protocolo de transferência de Western preferido é como se segue: 20 1. Correr o antigénio em SDS-PAGE a 12% e transferir para membrana de nitrocelulose. 2. Colocar a membrana em tampão de bloqueamento durante 2 h.
3. Remover o tampão de bloqueamento e lavar com PBS durante 1 minuto. 4. Diluir o soro em tampão de bloqueamento e adicionar à membrana. Incubar durante 2 horas à temperatura ambiente. 5. Lavar 3 vezes com tampão de lavagem (5 minutos para cada lavagem). 6. Diluir o conjugado em tampão de bloqueamento e adicionar à membrana. Incubar durante 1 h à temperatura ambiente. 7. Lavar 3 vezes com tampão de lavagem. 8. Adicionar substrato durante 10 minutos ou até que ocorra um bandeamento mais forte. 9. Lavar com PBS. 10. Secar ao ar e armazenar no escuro. 21 A presente invenção é ainda descrita nos exemplos seguintes que são proporcionados apenas para efeitos ilustrativos e não devem ser encarados como limitantes. EXEMPLO 1
Isolamento de L. intracellularis dos intestinos de porcos Americanos com enteropatia proliferativa porcina
Materiais e Métodos:
Selecção de amostras de inoculo: A amostra N24912 foi obtida a partir de uma vara, numa quinta em Iowa na qual se observou que quinze de 300 porcos para abate com cinco meses de idade possuíam fezes com sangue persistentes apesar do tratamento com penicilina. Após a necropsia dos porcos, o intestino (íleo) tinha uma mucosa espessa. Exames histopatológicos com coloração com prata demonstraram a presença de bactérias curvas intracelulares e hiperplasia enterocítica do gânglio confirmando o diagnóstico de PPE. A amostra N72994 foi obtida a partir de uma segunda ninhada de 1,5 anos de idade de porcas SPF numa quinta no Minnesota. O tamanho da vara era entre 70-80 porcas e não era conhecido tratamento com antibiótico. Após a necropsia, a mucosa do íleo era mais espessa com alguma hemorragia. A coloração de Giminez da mucosa demonstrou muitas bactérias curvas. A amostra N101494 foi obtida de um porco com 12 semanas de idade de uma quinta em Indiana com 600 porcas desde o nascimento até o abate. O porco foi tratado com Tylan injectável após o início da diarreia com sangue, mas o animal morreu pouco tempo após o tratamento. 22
Preparação do inoculo bacteriano derivado do porco:
As amostras de intestino foram mantidas a -70 °C. Os intestinos foram abertos e lavados com soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS). Amostras de uma grama de mucosa foram raspadas para glutamato de sódio potássio (SPG) e homogeneizadas durante 30 segundos com 4,0 mL de Tripsina a 1% (JRH Biosciences, Lenexa, KS) em SPG. As suspensões foram incubadas durante 35 minutos a 37 °C. Foi adicionado dez mL de SPG/soro de vitela fetal a 10% (FCS) (JRH Biosciences, Lenexa, KS) e as amostras foram maceradas num macerador de tecidos durante 1 minuto. Foi adicionado dez mL de SPG/10% (FCS) e filtrado uma vez através de papel de filtro (Whatman 113V; Whatman Labsales, Hillsboro, OR) e sequencialmente através de filtros de membrana de 5,0, 1,0, e 0,65 micron. Os filtrados foram divididos em fracções e congelados a -70 °C em fracções de 1,0 mL. A mucosa foi utilizada para fazer um esfregaço em lâmina para coloração de Giminez. Esfregaços separados de filtrados foram corados por IFA utilizando um anticorpo monoclonal especifico para L. intracellularis. S. McOrist et al., Vet. Rec. 121:421-422 (1987) (aqui incorporado por referência na sua totalidade).
Cultura de Células:
Foram cultivadas células IEC-18 (Células epiteliais de intestino de rato, ATCC CRL 1589) em DMEM (JRH Biosciences, Lenexa, KS) com L-glutamina e FCS a 10% e passadas por tripsina semanalmente por rotina. Foram cultivadas monocamadas de células a 37 °C em ar com C02 a 5%. 23
Infecção de cultura de células:
Foram semeadas células IEC-18 a 1,25 x 105 células em frascos de 25 cm2 e a taxas comparáveis em pequenas câmaras (Nunc, Inc., Naperville, IL), incubadas 24 horas, depois o meio foi removido. Os isolados de bactérias derivadas de porco, congelados foram rapidamente descongelados e diluidos em DMEM/FCS a 7% com Vancomicina (100 pg/mL) e Anfotericina B (2,0 pg/mL) a taxas de 1,0 mL de homogenato para 15 mL de meio e adicionado às monocamadas. As monocamadas e suspensões bacterianas foram centrifugadas durante 30 minutos a 2000 g e transferidas para frascos anaeróbicos. Os frascos foram evacuados e o gás foi substituído com hidrogénio e dióxido de carbono para produzir uma mistura de O2 a 8,0%, CO2 a 10%, e h2 a 82%. As culturas foram incubadas durante 3 horas a 37 °C depois realimentadas com DMEM/FCS a 7% com L-glutamina, Vancomicina (100 pg/mL), Neomicina (50 pg/L), e Anfotericina B (2,0 pg/mL). As culturas foram substituídas nos frascos anaeróbicos e incubadas durante 6 dias com substituições de meio a cada 2 dias.
Passagem de L. intracellularis:
Bactérias L. intracellularis foram passadas por lise celular utilizando cloreto de potássio como descrito anteriormente em G. Lawson et al., J. Clin. Microbiol., 31:1136-1142 (1993) (aqui incorporado por referência na sua totalidade) depois adicionadas a monocamadas de IEC-18 frescas. O meio foi vertido e eliminado das monocamadas e foi adicionado KC1 a 0,1% e as células foram incubadas durante 10 minutos a 37 °C: O KC1 foi removido e foi adicionado SPG/10% e as monocamadas descoladas mecanicamente com 24 um raspador de células. As células foram lisadas passando 3 vezes através de uma seringa com uma agulha de calibre 21. Os núcleos das células foram removidos por centrifugação a 100 x g durante 5 minutos e a suspensão bacteriana no fluido sobrenadante foi adicionada a monocamadas frescas de 1 d de células IEC-18.
Monitorização da infecção de culturas de células: A infecção foi monitorizada fixando as células em pequenas câmaras com acetona/metanol frios durante 5 minutos. A coloração foi realizada por métodos de imunofluorescência e imunoperoxidase. Ambos os métodos empregam um anticorpo monoclonal de murganho (como descrito em S. McOrist et al., Vet. Rec. 121:421-422 (1987)) como o anticorpo primário e quer com conjugado de imunoglobulina G anti-murganho - fluorocromo (isotiocianato de fluoresceína; Organon Teknika Corporation, Durham, NC) ou conjugado de peroxidase (imunoglobulina G anti-murganho de cabra; Kirkegaard e Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD) . A quantificação de bactérias foi realizada contando o número de bactérias coradas especificamente nas células em cada lâmina.
Reacção da Polimerase em Cadeia:
Os inóculos da amostra e as bactérias passadas foram incorporadas como adn molde em PCR utilizando o método de preparação da amostra, iniciadores, e parâmetros dos ciclos como descrito por Jones et al., J. Clin. Microbiol., 31:2611-2615 (1993) e McOrist et al., Vet. Microbiol. 1-8 (1994) (cada um dos 25 quais são aqui incorporados por referência na sua totalidade). Os parâmetros do ciclo foram 93 °C durante 5 minutos, 55 °C durante 45 segundos, e 72 °C durante 45 segundos para o primeiro ciclo. Foram realizados trinta e três ciclos às temperaturas anteriormente mencionadas durante 45 segundos por temperatura, assim como um ciclo a 93 °C durante 45 segundos, 55 °C durante 45 segundos, e 72 °C durante 2 minutos. Os inóculos positivos só foram utilizados para inocular células IEC-18. A PCR também foi realizada para monitorizar o material de passagem para confirmar infecções. 0 ADN produzido por PCR foi submetido aos serviços da Iowa State University Nucleic Acid Facility para sequenciação. Os resultados da sequenciação foram comparados com as sequências produzidas por Gary F. Jones, como relatado na sua tese de Ph.D., Universidade do Minnesota, Minneapolis, MN (Junho de 1993) .
Resultados:
Selecção de amostras de inoculo:
Os porcos números N24912 e N72994 tinham PPE grave com conteúdo intestinal com sangue e mucosa espessa. 0 N101494 tinha PPE grave e hemorragia grave resultando num coágulo sanguíneo grande no lúmen intestinal. A coloração de Giminez dos esfregaços da mucosa demonstraram números elevados de bactérias curvas ou em forma de S. As colorações de IFA revelaram grandes números de bactérias com fluorescência brilhante em inóculos de bactérias derivadas de porco. 26
Monitorização da infecção de culturas de células:
As monocamadas inoculadas foram monitorizadas por microscopia óptica ao longo do ciclo de crescimento e foi observada pouca alteração morfológica das células. As monocamadas não infectadas, cultivadas sob tensão de oxigénio reduzido (02 a 8%), tinham morfologia semelhante.
As culturas infectadas coradas com imunofluorescência e imunoperoxidase demonstraram números elevados de bactérias coradas especificamente curvas ou em forma de S, aparentemente nas células. As monocamadas não tinham infecção confluente. As células infectadas estavam frequentemente intimamente associadas com focos infectados de 1-10 células. As células fortemente infectadas (i. e., células com 30 ou mais bactérias) também foram observadas em associação com células com menos de 30 bactérias. Os números de bactérias tiveram o seu pico a cerca de 6 dias. A infecção foi dependente de condições de crescimento especificas. As bactérias foram passadas com sucesso pelo processo de lise aqui descrito. A centrifugação de células inoculadas de novo não foi necessária mas aumentou os números de células infectadas. A centrifugação também diminuiu a contaminação permitindo que as células expostas a infecção com meio sem antibiótico fossem realimentadas a 3 horas com meio contendo antibiótico. Foi necessário reduzir a FCS de 10% para 7% no meio, para retardar o crescimento das células IEC-18 permitindo que as bactérias proliferem até números mais elevados antes das monocamadas se tornarem confluentes. 27
Reacção da Polimerase em Cadeia: A PCR de ADN cromossómico criou um fragmento de 319 pb (incluindo iniciadores) de todos os isolados. Um fragmento de tamanho apropriado foi comparado visualmente com uma amostra positiva conhecida criada por McOrist et al. (1994) utilizando PCR. A análise de sequências dos produtos de PCR de N24912, N72994, e N101494 confirmou uma homologia próxima (97-99%) com a sequência p78 determinada por Jones (1993). EXEMPLO 2
Crescimento de L. intracellularis em culturas em suspensão de células HEp-2
Preparação de homoqenatos intestinais para inoculo:
Foi preparado homogenato intestinal raspando a mucosa e retirando-a desde 6,0 até 8,0 cm do íleo das amostras intestinais do Exemplo 1. Foi adicionada tripsina (1%) à mucosa raspada e as amostras foram homogeneizadas brevemente, depois incubadas durante 35 minutos a 37 °C. Foi então adicionado dez mL de SPG/FBS a 10% e as amostras foram maceradas num macerador de tecido. Foram adicionados outros 10 mL de SPG/FBS a 10%. Os homogenatos foram passados através de um filtro Whatman V113 e depois sequencialmente através de filtros de 5,0, 1,0, e 0,65 pm. As amostras foram dispensadas para fracções de 1 mL e congeladas a -70 °C. 28
Infecção de cultura de células: Método A:
As células do tecido foram semeadas a 1 X 107 células em 50 mL de DMEM/fbs a 10% num frasco de agitação de 100 mL. As culturas foram incubadas 24 h, depois foram adicionados Vancomicina e fungizona. Um frasco de homogenato intestinal congelado foi rapidamente descongelado e diluído em 3,0 mL de DMEM/FBS a 5% com vancomicina (100 pg/mL) e Anfotericina B (2,0 pg/mL) . A amostra foi passada através de um filtro de 0,6 5 pm e adicionada ao frasco. A cultura foi colocada numa câmara de gás, evacuada, e regaseada com hidrogénio e dióxido de carbono para produzir uma mistura de 02 a 8,0%, C02 a 8,8% e H2 a 83,2%. As culturas foram incubadas durante 3 horas a 37 °C e depois foram adicionados Neomicina e Gentamicina. A cultura foi realimentada às 24 horas com DMEM/FBS a 5% com L-glutamina, Vancomicina (100 pg/mL), Neomicina (50 pg/L), Gentamicina (50 pg/L) e Anfotericina B (2,0 pg/mL) Método B:
Dois frascos de 25 cm2 convencionais foram semeados com 1,25 x 105 células HEp-2 em DMEM/FBS a 10% e permitiu o crescimento de 18-24 horas. As células estavam a 30% de confluência no momento da inoculação. O inoculo foi diluído em DMEM/FBS a 5%. Quando o inoculo é de um homogenato intestinal, o meio também continha Vancomicina (100 pg/mL) e Anfotericina B (2,0 pg/mL). As culturas foram colocadas numa câmara de gás, evacuadas, e regaseadas com hidrogénio e dióxido de carbono para produzir uma mistura de 02 a 8,0%, C02 a 8,8%, e H2 a 83,2%. As 29 culturas foram incubadas durante 3 horas a 37 °C depois foram adicionados Neomicina e Gentamicina. A cultura foi realimentada a 24 horas com DMEM/FBS a 5% com L-glutamina, Vancomicina (100 pg/mL), Neomicina (50 pg/L), Gentamicina (50 pg/L), e Anfotericina B. (2,0 pg/mL). Não foram necessários antibióticos quando o inoculo foi uma cultura pura. As culturas foram incubadas durante 6 dias ou até à confluência. As células foram raspadas dos frascos e adicionadas a um frasco de agitação de 100 mL contendo 50 mL de DMEM/FBS a 5%. A cultura foi diluída 1:2 a intervalos semanais quer por recolha de metade da cultura e adicionar meio fresco ou passando para um frasco de agitação maior e adicionando mais meio.
Passagem da cultura: A cultura foi passada para células HEp-2 frescas semeando células HEp-2 novas a 1 X 107 em DMEM/FBS a 5%. A cultura nova foi deixada a incubar durante a noite a 8,0% de 02, C02 a 8,8%, e H2 a 83,2%. A cultura nova foi então inoculada com cultura infectada e incubada a concentrações reduzidas de 02 como previamente referido. As quantidades de inoculo foram dependentes do grau de infecção da cultura original.
Recolha e armazenamento de culturas:
As culturas foram recolhidas colhendo a quantidade desejada de cultura enquanto se centrífuga a 3000 x g durante 20 minutos. O sedimento foi ressuspenso em solução de Sacarose-Fosfato-
Glutamato (SPG) e passado 4 vezes através de uma agulha de 30 calibre 25. As culturas foram separadas em fracções e armazenadas a -70 °C. Para purificação posterior, a amostra foi centrifugada a 145 x g durante 5 minutos para remover os núcleos e resíduos celulares. O sobrenadante foi, então, centrifugado a 3000 x g durante 20 minutos. O sedimento foi, então, ressuspenso em diluente.
Avaliação de L. intracellularis viáveis em cultura de tecidos: A quantificação de L. intracellularis viável foi realizada determinando os 50 porcento da Dose de Infecção de Cultura de Tecidos (TCID50). Isto foi realizado removendo 2,0 mL de cultura a ser testada e lisando as células, passando 4 vezes através de uma agulha de calibre 25. A amostra foi diluída em série 1:10 em DMEM/FBS a 5% contendo Vancomicina (100 pg/mL) e Anfotericina B (2,0 pg/mL). As diluições foram adicionadas a uma placa de microtitulação de 96 poços com 0,1 mL/poço. As placas de microtitulação foram semeadas com células HEp-2 a 1250 células/poço e cultivadas durante 18-24 horas antes da infecção. Foram utilizados entre 3 poços/diluição e 6 poços/diluição. A placa foi incubada durante 6 dias a concentrações de gás de 02 a 8,0%, C02 a 8,8%, e H2 a 83,2%. As células foram fixadas com acetona fria a 50% e metanol a 50% durante 2 minutos. Aos poços, foi adicionado 0,03 mL/poço de anticorpo monoclonal anti-IS intracellularis (McOrist, 1994) diluído 1:2000 em PBS. A placa foi incubada durante 30 minutos a 37 °C e, depois, lavada 3 vezes com PBS. Foi adicionado FITC anti-murganho diluído 1:30 na quantidade de 0,03 mL/poço e incubado 30 minutos a 37 °C. A placa foi, então, lavada 3 vezes 31 com ddH20 e deixada secar. As amostras foram observadas num microscópio de fluorescência e a TClD50/mL foi determinada.
Resultados:
Os resultados da TCID50 indicaram que as culturas continham até 1 X 106 bactéria/mL. Isto foi realizado em 45 dias. 0 volume da cultura foi aumentado em escala até 3,0 litros na mesma quantidade de tempo. EXEMPLO 3
Crescimento de L. intracellularis em culturas em suspensão de células McCoys
Preparação de homogenatos intestinais para inoculo: durante 18-24 horas. As células tinham até 30% de confluência no momento da inoculação. O inoculo foi diluído em DMEM/FBS a 5%. Quando o inoculo é de um homogenato intestinal, então o meio também continha Vancomicina (100 pg/mL) e Anfotericina B (2,0 pg/mL). As culturas foram colocadas numa câmara de gás, evacuadas, e regaseadas com hidrogénio e dióxido de carbono para produzir uma mistura de O2 a 8,0%, CO2 a 10%, e H2 a 82%. As culturas foram incubadas durante 3 horas a 37 °C, depois foram adicionadas Neomicina e Gentamicina. A cultura foi realimentada às 24 horas com DMEM/FBS a 5% com L-glutamina, Vancomicina (100 pg/mL), Neomicina (50 pg/L), Gentamicina (50 pg/L), e Anfotericina B (2,0 pg/mL). Não foram necessários antibióticos quando o inoculo foi uma cultura pura. As culturas foram incubadas durante 6 dias até à confluência. As células foram raspadas dos frascos e adicionadas a um frasco de agitação de 100 mL contendo 50 mL DMEM/FBS a 2% e 0,05 g de Microveículos Cultisphere-G. Os frascos foram agitados a 40-50 rpms. A cultura foi diluída 1:2 a cada 2-3 dias, recolhendo metade da cultura e adicionando meio fresco e esferas Cultisphere-G ou passando a cultura para um frasco de agitação maior e adicionando mais meio e esferas Cultisphere-G. A concentração final de esferas na cultura foi de cerca de 0,001 g de esferas/mL.
Passagem da cultura: A cultura foi passada para células McCoys frescas semeando 1 X 107 células McCoys novas em DMEM/FBS a 2% e 0,05 g de esferas Cultisphere-G. A nova cultura foi deixada a incubar durante a noite a 02 a 8,0%, C02 a 8,8% e H2 a 83,2%. A nova cultura foi 33 então inoculada com 25 mL de cultura infectada e incubada a concentrações de O2 reduzidas como anteriormente referido.
Recolha e armazenamento de culturas:
As culturas foram recolhidas colhendo a quantidade desejada de cultura e centrifugando a 3000 x g durante 20 minutos. O sedimento foi ressuspenso em SPG e passado 4 vezes através de uma agulha de calibre 22. As culturas foram separadas em fracções e armazenadas a -70 °C. Para posterior purificação, a amostra foi centrifugada a 145 x g durante 5 minutos para remover as esferas, núcleos e resíduos celulares. O sobrenadante foi, então, centrifugado a 3000 x g durante 20 minutos. O sedimento foi, então, ressuspenso em diluente.
Estimativa de L. intracellularis viáveis em cultura de tecidos: A quantificação de L. intracellularis viáveis foi determinada como descrito no Exemplo 2 utilizando uma agulha de calibre 22 para lisar as células e utilizando células McCoys a 1250 células/poço para semear as placas de microtitulação.
Resultados:
Os resultados de TCID50 indicaram que as culturas continham até 1 X 106 bactérias/mL. Isto foi conseguido em menos de 1 mês. O volume da cultura foi aumentado para 3,0 litros na mesma quantidade de tempo. 34 EXEMPLO 4
Determinar a dose infecciosa de culturas puras de L. intracellularis em animais hospedeiros.
Sumário:
Um estudo com trinta e um porcos foi completado, infectando porcos convencionais com 6 semanas de idade com culturas puras de L. intracellularis da amostra N72994. Os porcos foram divididos aleatoriamente em 4 grupos e os grupos foram encurralados separadamente. 0 Grupo 1 continha 7 porcos e foi considerado o grupo de controlo negativo doseado com cultura de tecidos não infectada ou nada. 0 grupo 2 continha 8 porcos doseados com 107 bactérias/porco. 0 Grupo 3 tinha 8 porcos e foi doseado com 106 bactéria/porco. E, o Grupo 4 continha 8 porcos recebendo 105 bactérias/porco.
Foram recolhidos esfregaços fecais recolhidos nos dias 0, 7, 14, e 21, e 24 para teste por PCR. No dia 24, os porcos foram submetidos a necropsia e o ileo, jejuno, e o cólon foram recolhidos para testes por PCR, histopatologia, e colorações FA, tudo como descrito acima.
O teste por PCR da mucosa do ileo revelou a presença de L. intracellularis em 100% da dose mais elevada, 75% da dose média, e 50% da dose baixa. Os resultados da histopatologia indicaram um aumento das células mononuclear na lamina própria e submucosa de 88% da dose mais elevada, 75% da dose média, e 88% da dose baixa. Foi observada hiperplasia do gânglio em 50% da dose elevada, 63% da dose média, e 50% da dose baixa. A coloração de FA revelou L. intracellularis em secções de tecido 35 do íleo, jejuno, e cólon em 88% da dose elevada, 63% da dose média, e 63% da dose baixa. Os animais de controlo foram negativos para a presença de L. intracellularís através de PCR, FA, e colorações com prata.
Em conclusão, a cultura pura foi utilizada com sucesso para infectar e provocar lesões de PPE. Os postulados de Koch foram cumpridos através da identificação e isolamento de L. intracellularís dos animais infectados.
Em animais expostos, 100% dos animais com doses elevadas tinham confirmado a recuperação e identificação através de colorações de prata, FA, e PCR.
Materiais e Métodos:
Crescimento de Inoculo:
Um frasco de 75 cm2 convencional foi semeado com 3,75 x 105 células HEp-2 em DMEM/FBS a 10% e deixadas a crescer durante 18-24 horas a 37 °C a 5% de C02. (As células estavam a 30% de confluência no momento da inoculação). Um frasquinho de N72994 foi diluído em 15 mL de DMEM/FBS a 5%. A cultura foi colocada numa câmara de gás, evacuada, e regaseada com hidrogénio e dióxido de carbono para produzir uma mistura de 02 a 8,0%, C02 a 8,8% e H2 a 83,2%. A cultura foi realimentada às 24 h com DMEM/FBS a 5%.
As culturas foram incubadas durante 6 dias, depois as células foram raspadas dos frascos e adicionadas a um frasco de agitação de 100 mL contendo 50 mL de DMEM/FBS a 5%. O volume do 36 frasco volume foi aumentado duplicando o volume do meio com intervalos de uma semana. A cultura foi cultivada durante 3 semanas no frasco de agitação.
Recolha das Culturas: A cultura foi recolhida por centrifugação a 3000 x g durante 20 minutos. O sedimento foi ressuspenso em solução de Sacarose-Fosfato-Glutamato (SPG) com fbs a 10% e passado 4 vezes através de uma agulha de calibre 25. O inoculo foi diluído para o volume final em SPG/FBS a 10% e foram realizadas diluições 1:10. O inoculo para os controlos consistiu em células HEp-2 não infectadas, diluidas para a mesma concentração de células viáveis que a cultura infectada. As células foram recolhidas do mesmo modo que a cultura infectada. Os porcos de controlo receberam uma dose semelhante de células que o grupo da dose elevada.
Quantificação de L. intracellularis:
A quantificação de L. intracellularis viáveis foi realizada por determinação dos 50 porcento da Dose Infecciosa de Cultura de Tecidos (TCID50). Isto foi realizado removendo 2 mL da cultura a ser testada e lisando as células passando 4 vezes através de uma agulha de calibre 22. A amostra foi diluída em série 1:10 em DMEM/FBS a 5% contendo Vancomicina (100 pg/mL) e Anfotericina B (2,0 pg/mL). As diluições foram adicionadas a uma placa de microtitulação de 96 poços com 0,1 mL/poço. As placas de microtitulação foram semeadas com células HEp-2 a 37 2500 células/poço e crescidas 18-24 horas antes da infecção. Foram utilizados doze poços/diluição. A placa foi incubada durante 6 dias a concentrações de gás de 02 a 8,0%, C02 a 8,8% e N2 a 83,2%. As células foram fixadas com acetona fria a 50% e metanol a 50% durante 2 minutos. Aos poços, foi adicionado 0,03 mL/poço de anticorpo monoclonal anti-h. intracellularis (McOrist, 1987) diluido 1:2000 em PBS. A placa foi incubada durante 30 minutos a 37 °C e depois lavada 3 vezes com PBS. Foi adicionado FITC anti-murganho diluido 1:30 a 0,03 mL/poço e incubado 30 minutos a 37 °C. A placa foi lavada 3 vezes com ddH20 e deixada secar. As amostras foram observadas num microscópio de fluorescência e a TCID50/mL foi determinada.
Animais:
Foram fornecidos trinta e um porcos de sexos mistos de seis semanas de idade de fêmeas PIC x Lieske e machos large white pelo Dr. Kent Schwartz. Os porcos foram distribuídos aleatoriamente a 4 cercados por peso no dia 0.
Instalações:
Foram utilizados quatro currais numa instalação de reprodução pequena, cada um separado por pelo menos 3 pés, para guardar os porcos. Os cercados tinham soalho de arame e divisores de cercados sólidos. O aquecimento era proporcionado por um forno com aquecimento zonal suplementar através de lâmpadas de aquecimento. A temperatura foi mantida entre 78 e 85 °F durante a duração do estudo. 38
Alimentação e Água:
Foi fornecida uma dieta com 19% de proteína, milho-soja moídos, sem antibióticos, ad libitum através de alimentadores de aço inoxidável. Foi fornecida água ad libitum através de bebedouros de tetina.
Infecção de porcos:
No dia 0, os porcos foram pesados e as amostras de sangue foram recolhidas através de um tubo capilar colocado no sino retroorbital. O soro foi recolhido e armazenado congelado a -20 °C. Foram também recolhidos esfregaços fecais para PCR. Os porcos foram doseados com 10 mL de inoculo fornecidos intragastricamente através do tubo do estômago.
Tratamento N° de porcos
Controlo - células não infectadas 5 Controlo - sem tratamento 2 Dose elevada 8 Dose médio 8 Dose baixa 8
Os porcos foram pesados e sangrados nos dias 0, 10, 17 e 24.
Reacção da Polimerase em Cadeia: A infecção dos porcos foi monitorizada por PCR utilizando iniciadores e parâmetros de ciclo como descrito por Jones 39 (1993) . As amostras fecais recolhidas nos dias 0, 7, 14, 21, e 24, assim como a mucosa dos intestinos foram verificadas por PCR.
Histopatoloqia:
Secções do ileo, jejuno, e cólon foram fixados com formalina, processados por rotina, corados com Ilematoxilina e Eosina, assim como por impregnação com prata e avaliadas. Também foram coradas secções utilizando anticorpo monoclonal especifico para L. intracellularis.
Resultados:
Sinais Clínicos:
Sinais clínicos consistindo em fezes soltas foram primeiro observados no grupo de dose elevada aos 3 dias. Os sinais tiveram o seu pico aos 14 dias e começaram a dissipar-se de aí em diante.
Ganho de Peso:
Foram calculados os ganhos de peso médio diários mostrando que os grupos de dose elevada e média possuíam ganhos de peso reduzidos em comparação com o grupo de controlo. Existia um efeito de titulação de dose nos ganhos de peso quando se comparam os grupos. 40 PCR: Não foi observado derramamento fecal até aos 14 dias. Aos 21 dias, 37,5% dos porcos de dose elevada eram positivos na PCR nas fezes. Após necropsia, as mucosas dos ileos foram verificadas por PCR com 100% de positivos na dose elevada, 75% na dose média, 50% na dose baixa e 0% nos controlos.
Lesões Grosseiras:
Observaram-se lesões grosseiras em 2 porcos do grupo da dose elevada (n° 50 e n° 202) . Os porcos tinham aproximadamente 3 pés de espessura no ileo com necrose em n° 202.
Histopatologia: FA: A coloração com FA das secções do ileo, jejuno, e cólon revelaram a presença de L. intracellularis em 87,5% da dose elevada, 62,5% de ambas as doses média e elevada e 0% nos controlos.
Lesões Microscópicas:
Foram observadas lesões em 100% da dose elevada, 75% da dose média, 87,5% da dose baixa e 14% nos controlos. Isto foi determinado pela observação de células mononucleares aumentadas na lamina própria e submucosa, frequentemente associada com 41
Também foi observada hiperplasia de Peyer's Patchers. hiperplasia do gânglio.
Coloração com prata:
Também foi realizada a coloração com prata das secções para a presença de bactérias intracelulares, curvas. Isto demonstrou a presença de bactérias em 87,5% da dose elevada, 62,5% na dose média, 87,5% na dose baixa e 0% nos controlos.
Discussão:
Os porcos foram infectados com sucesso com culturas puras de L. intracellularis. A doses de 107 bactérias, 100% dos porcos demonstraram infecção por PCR e lesões microscópicas. A gravidade das lesões e as quantidades de bactérias nas secções do tecido foram relativamente baixas. Este estudo é um modelo de exposição satisfatório para L. intracellularis devido à presença de L. intracellularis e lesões microscópicas nos porcos. As lesões podem ser melhoradas com uma segunda dose 7 dias após a primeira dose. 42
Exemplo 5
Experiência da Eficiência da Vacina em Hamster
Objectivo:
Avaliar um modelo de laboratório animal para determinar a segurança e eficiência de uma vacina viva avirulenta de L. intracellularis em hamsters.
Sumário:
Um estudo com 40 hamsters foi realizado por vacinação de hamsters de 3 semanas de idade com culturas puras de uma estirpe de passagem elevada de L. intracellularis e exposição 22 dias após vacinação com culturas puras de material virulento de passagem baixa. Os hamsters foram divididos em 3 grupos. O Grupo A foi vacinado com 1 dose de estirpe L. intracellularis N72994 no dia 0. O Grupo B foi designado o grupo de controlo e não foi doseado com uma cultura de vacina. Ambos os grupos foram expostos com 2 doses de uma cultura pura de L. intracellularis estirpe N343 nos dias 22 e 25 após-vacinação. Ao Grupo C foi administrada a estirpe de exposição, N101494, para comparar a virulência relativa com a estirpe N343. os Grupos A e B continham 15 hamsters cada um e o Grupo C continha 10 hamsters. Os resultados dos 50% da Dose Infecciosa de Cultura de Tecidos (TCID50) indicaram que os hamsters foram vacinados com 105 TCID50/dose. A exposição de N343 continha 105,5 TClD50/dose. A dose de exposição para o Grupo C foi de 102, 75 TCID50/dose. Os esfregaços fecais foram recolhidos nos dias 0, 7, 14, 21, 29, 36, e 43 para testes pela reacção da polimerase em cadeia (PCR). 43
No dia 21, 5 animais foram submetidos a necropsia dos Grupos A e B cada um para teste com PCR das mucosas, bem como com colorações com FA, Hematoxalina e Eosina, e colorações com prata de secções do íleo para determinar a persistência de colonização da bactéria nos hamsters vacinados. Os restantes animais foram submetidos a necropsia 21 dias após-exposição com testes semelhantes.
Os resultados da PCR indicaram a presença de L. intracellularis nas mucosas intestinais de 100% dos hamsters do Grupo A 21 dias após-vacinação. Os hamsters do Grupo B eram todos negativos a 21 dias após-vacinação. Vinte e um dias após-exposição, 50% dos hamsters eram positivos em PCR no Grupo A 100% eram positivos no Grupo B. Histopatologia das secções indicaram lesões moderadas a graves em 50% dos animais no Grupo A e lesões suaves em 50% no Grupo B 21 dias após-exposição. Nenhum animal demonstrou lesões 21 dias após-vacinação. Os animais do Grupo C não tinham lesões aos 21 dias após-exposição. As colorações com FA e prata não foram capazes de demonstrar a presença de L. intracellularis em qualquer uma das secções.
Em conclusão, uma redução de 50% da infecção foi observada em hamsters vacinados com uma estirpe de passagem elevada de L. intracellularis como demonstrado por PCR. Os intestinos foram colonizados por números baixos de organismos intracelulares, como demonstrado pela falta de organismos observados em secções coradas com FA e prata. Os hamsters no Grupo C não foram capazes de apresentar infecção ao longo do estudo devido à dosagem baixa de bactérias. 44
Materiais e Métodos:
Descrição de Hamster:
Foram utilizados quarenta hamsters fêmeas com 3 semanas de idade de Harlan Sprague Dawley.
Crescimento de Inoculo:
Cultura da Vacina:
Foi utilizada uma cultura continua de L. intracellularis crescida em células HEp-2 durante 29 semanas. A cultura foi cultivada de um modo semelhante como referido na cultura de exposição, excepto a cultura ser passada para as novas células HEp-2 a cada 2-3 semanas.
Culturas de exposição:
Foi semeado um frasco de cultura de tecidos de 75 cm2 convencional com 3,75 x 105 células McCoys em Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) com Soro de bovino fetal (FBS) a 10% e deixado a crescer 18-24 horas a 37 °C com C02 a 5%. O meio foi removido das células e um frasco de N343 MSC X diluido em 14 mL de DMEM/FBS a 2% foi adicionado ao frasco. A cultura foi colocada numa câmara de gás, evacuada, e regaseada com hidrogénio e dióxido de carbono para produzir uma mistura de 02 a 8,0%, C02 a 8,8% e H2 a 83,2%. A cultura foi cultivada durante 6 dias, depois as células foram raspadas para um frasco de agitação de 100 mL com 90 mL de DMEM/FBS a 2% e 0,01 g de 45 esferas cultisphere-G. A cultura foi cultivada às concentrações de gás referidas acima. 0 volume do frasco foi aumentado duplicando o volume do meio a intervalos semanais. A cultura foi cultivada durante 25 dias no frasco de agitação para um volume final de 250 mL. A estirpe N101494 foi cultivada do mesmo modo que a estirpe N343 .
Recolha das Culturas:
Cultura da Vacina: A cultura foi recolhida por centrifugação a 3000 x g durante 20 minutos. O sedimento foi ressuspenso em solução de Sacarose-Fosfato-Glutamato (SPG) com FBS a 10% e passada 4 vezes através de uma agulha de calibre 25. O inoculo foi diluído para um volume final (15 mL) em SPG/FBS a 10%.
Culturas de exposição:
As culturas foram recolhidas por centrifugação a 3000 x g durante 20 minutos. Os sedimentos foram ressuspensos em solução de Sacarose-Fosfato-Glutamato (SPG) com FBS a 10% e passados 4 vezes através de uma agulha de calibre 25. Os inóculos foram diluídos para o volume final em SPG/FBS a 10% (20 mL para a estirpe N343 e 10 mL para a estirpe N101494). 46
Dosagem de hamsters:
Vacina:
No dia 0 todos os hamsters no Grupo A foram vacinados oralmente com 1 mL da vacina preparada.
Exposição:
Vinte e dois dias após-vacinação, 10 hamsters no Grupo A e 10 hamsters no Grupo B foram doseados oralmente com 0,5 mL da estirpe de cultura de exposição N343. O Grupo C foi exposto com 0,5 mL de estirpe de cultura de exposição N101494.
Quantificação de IS Intracellularis: A quantificação de IS intracellularis viáveis foi realizada por determinação dos 50 porcento da Dose Infecciosa da Cultura de Tecidos (TCID50) . Isto foi realizado removendo 2 mL da cultura a ser testada e lisando as células passando através de uma agulha de calibre 22 4 vezes. A amostra foi diluída em série 1:10 em DMEM/FBS a 5% contendo Vancomicina (100 pg/mL) e Anfotericina B (2,0 pg/mL). As diluições foram dispensadas a 0,1 mL/poço para uma placa de microtitulação de 96 poços que foi semeada com células McCoys a 1250 células/poço e incubadas 18-24 horas a 37 °C a 5% de C02 antes da infecção. Foram utilizados doze poços/diluição. A placa foi incubada durante 6 dias a concentrações de gás 02 a 8,0%, C02 a 8,8% e N2 a 83,2%.
No dia 6, as células foram fixadas com acetona fria a 50% e metanol a 50% durante 2 minutos. Aos poços, foi adicionado 47 0,03 mL/poço de anticorpo monoclonal anti-IS intracellularis diluído 1:2000 em PBS. A placa foi incubada durante 30 minutos a 37 °C e depois lavada 3 vezes com PBS. Foi adicionado FITC anti-murganho diluído 1:30 a 0,03 mL/poço e incubado 30 minutos a 37 °C. A placa foi lavada 3 vezes com ddH20 e deixada a secar. As amostras foram observadas num microscópio de fluorescência e a TCID5o/mL foi determinada.
Monitorização da Infecção de Hamsters: A infecção dos hamsters foi monitorizada por PCR utilizando iniciadores e parâmetros de ciclo como descrito por Gary Jones. As amostras fecais foram recolhidas a 0, 7, 14, 21, 29, 36, e 43 dias após-vacinação. Após a terminação dos hamsters a mucosa dos intestinos também foram verificadas por PCR.
Histopatoloqia:
As secções de íleo e cólon foram fixadas com formalina, processadas de rotina, coradas com Hematoxilina e Eosina e impregnação com prata, e avaliada. As secções também foram coradas com um anticorpo monoclonal específico para L. intracellularis.
Ganhos de Peso Diários Médios:
Os pesos dos hamsters foram recolhidos 21, 28, 35, e 42 dias após vacinação para determinar os ganhos de peso diários médios. 48
Resultados: Referência à Tabela abaixo. TCID50:
Os resultados de TCID50 indicaram que o grupo da vacina (Grupo A) recebeu 10 4,86 TClD50/hamster. Os hamsters nos Grupos A e B foram expostos à estirpe N343 e receberam 105,5 TCID50. Os hamsters do Grupo C expostos à estirpe N101494 receberam 102, 75 TCID50/hamster. PCR:
Os testes de PCR demonstraram a presença de L. intracellularis em 100% dos hamsters vacinados que foram submetidos a necropsia 21 dias após vacinação. Os testes 43 dias após vacinação demonstraram que 100% dos hamsters de controlo e 50% dos hamsters vacinados foram infectados com L. intracellularis. Nenhum dos hamsters expostos a N101494 eram positivos. Não foi detectado derramamento fecal ao longo do estudo em nenhum dos hamsters.
Histopatologia:
As estirpes Η & E não revelaram lesões histológicas em todas as secções de hamsters submetidos a necropsia 21 dias após vacinação. Nas secções recolhidas 43 dias após vacinação 50% do grupo Vacina tinha enterite linfocitica moderada a grave e 50% do grupo de controlo tinha enterite linfocitica moderada. Não se observaram lesões no grupo de exposição N101494. 49
As colorações com FA não conseguiram demonstrar L. intracellularis em qualquer um dos hamsters 43 dias após vacinação.
Discussão:
Foi observada uma redução de 50% da infecção em hamsters vacinados com uma estirpe de passagem elevada de L. intracellularis como demonstrado por PCR. ID Fecal PCR DO Fecal PCR d7 Fecal PCR dl4 Fecal PCR d21 Fecal PCR d29 Fecal PCR d36 Fecal PCR d43 Mucosa PCR Dia 21 Mucosa PCR Dia 43 Lesões mi Coloração HE croscóp Prata icas FA A-l - - - - - - - ND + Enterite suave - A-2 - - - - - - - ND - - - - A-3 - - - - - - - ND + suave - - A-4 - - - - - - - ND - - - - A-5 - - - - - - - ND + - - - A-6 - - - - - - - ND - - - - A-7 - - - - - - - ND + Enterite severa A-8 - “ “ “ - ND + Enterite moderada ~ A-9 - - - - - - - ND - - - - A-l 0 - - ND - Enterite suave ~ A-l 1 - - - - ND ND ND + ND - - - A-12 - - - - ND ND ND + ND - - - A-13 - - - - ND ND ND + ND - - - A-l 4 - - - - ND ND ND + ND - - - A-15 - - - - ND ND ND + ND - - - B-l - - - - - - ND + Enterite mínima " B-2 - “ “ “ - - ND + Enterite mínima B-3 - - - - - - - ND + - - - B-4 “ “ “ - - ND + Enterite mínima B-5 - - - ND + Enterite mínima B-6 - - - - - - - ND + Enterite mínima B-7 - - - - - - - ND + - - - B-8 - - - - - - - ND + - - - B-9 - - - - - - - ND + - - - B-10 - - - - - - - ND + - - - B-ll - - - - ND ND ND - ND - - - B-12 - - - - ND ND ND - ND - - - B-13 - - - - ND ND ND - ND - - - B-14 - - - - ND ND ND - ND - - - B-15 - - - - ND ND ND - ND - - - C-l - - - - - - - ND - - - - C-2 - - - - - - - ND - - - - 50
Fecal Fecal Fecal Fecal Fecal Fecal Fecal Mucosa Mucosa
Fecal Fecal Fecal Fecal Fecal Fecal Fecal Mucosa Mucosa PCR PCR PCR PCR PCR ID DO d7 dl4 d21 d29 C-3 - - - - - n 1 is» - - - - - C-5 - - - - - C-6 - - - - - C-7 - - - - - O oo - - - - - C-9 - - - - - C-10 - - - - - PCR PCR PCR PCR
Lesões microscópicas d36 d43 Dia 21 Dia 43 Coloração Prata _HE_ ND - ND - ND - ND - - - ND - ND - ND - ND -
FA
Exemplo 6
Experiência da Eficiência da Vacina em Suínos
Objectivo: 0 objectivo deste estudo foi avaliar a segurança, colonização persistente e eficácia de um isolado vivo avirulento e um isolado morto de L. intracellularis em porcos de 2-3 semanas de idade. Foi realizado um estudo em animal hospedeiro no qual porcos com 3 semanas de idade foram vacinados depois expostos a uma exposição avirulenta com L. intracellularis estirpe N343 para comparar diferenças na protecção entre as vacinas. Métodos:
Em 11 de Dezembro de 1995, foi adquirido um total de 45 porcos, de 3 semanas de idade a Η & K Farms. Eles foram transportados para a Veterinary Resources, Inc., uma instalação de investigação localizada próximo de Cambridge, Iowa, onde foram etiquetados para identificar individualmente cada porco. Os porcos foram mantidos nesta instalação durante dois dias 51 antes da iniciação do estudo para permitir a aclimatação à instalação e foram alimentados com ração sem antibiótico ao longo do estudo. A 13 de Dezembro, todos os porcos foram pesados, sangrados para recolher soro, classificados clinicamente, e foram recolhidos esfregaços rectais. Os porcos foram então divididos aleatoriamente em grupos de cinco e colocados em banheiras. Vinte porcos foram colocados numa divisão separada e foram designados grupos de controlo e restritos. Foram colocados quinze porcos numa segunda divisão para a vacina ISi-1. Uma terceira divisão tinha 10 porcos para ISi-2. A vacina viva foi preparada nas instalações de NOBL Laboratories Research and Development e identificada como série experimental ISi-1. A ISi-1 (estirpe N343) foi isolada a partir de um porco e cultivada em continuo em cultura pura durante 29 semanas. A vacina foi cultivada em células McCoys em frascos de agitação a oxigénio reduzido até ser observado aproximadamente 100% de infecção. A amostra da estirpe N343 de passagem elevada utilizada para ISi-1 foi passada por mais 11 semanas ("N343NP40wk") e depositada de acordo com o Tratado de Budapeste em 22 de Maio de 1996 na ATCC, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland E.U.A. 20852 e atribuído o Número de Acesso 55783. As culturas foram recolhidas por centrifugação a 3000 x g durante 20 minutos. Os sedimentos foram ressuspensos em solução de Sacarose-Fosf ato-Glutamato (SPG) com FBS a 10% e passados 4 vezes através de uma agulha de calibre 25. Os lisados foram centrifugados a 500 x g durante 5 minutos para sedimentar os resíduos e as esferas de microveículo. O sobrenadante foi guardado e armazenado a -70 °C até, aproximadamente, uma hora 52 antes da vacinação, em que foi armazenado em gelo até ser administrado. A vacina morta (ISi-2) foi cultivada, passada durante 12 semanas e recolhida de um modo semelhante como acima e foi purificada através de um gradiente de percol. As bactérias purificadas foram então armazenadas a -70 °C até, aproximadamente, 1 semana antes da vacinação na qual foi armazenada a 4 °C a níveis de oxigénio atmosférico normais que se torna tóxico para L. intracellularis. Foi adicionado A10H à bactéria para uma mistura final de A10H a 10%. Foi determinada a concentração de proteína utilizando o método do Biureto.
Quantificação de IS intracellularis Viva: A quantificação de L. intracellularis viáveis foi realizada através da determinação da 50 porcento da Dose Infecciosa de Cultura de Tecidos (TCID50) . Foram semeadas placas de microtitulação de 96 poços com células McCoys a 1250 células/poço e cultivadas 18-24 horas antes da infecção. As amostras foram diluídas em série 1:10 em DMEM/FBS a 5% contendo Vancomicina (100 pg/mL) e Anfotericina B (2,0 pg/mL). As diluições foram adicionadas à placa de microtitulação de 96 poços com 0,1 mL/poço. Foram utilizados doze poços/diluição. A placa foi incubada durante 6 dias a 37 °C e concentrações de gás de 02 a 8,0%, C02 a 8,8% e N2 a 83,2%. As células foram fixadas com acetona fria a 50% e metanol a 50% durante 2 minutos. Foi adicionado aos poços, 0,03 mL/poço de anticorpo monoclonal anti-A. intracellularis (desenvolvido por Dr. Steven McOrist) diluído 1:2000 em PBS. A placa foi incubada durante 30 minutos a 37 °C e depois lavada 3 vezes com PBS. Foi 53 adicionado conjugado de imunoglobulina G anti-murganho-fluorocromo (FITC) diluído 1:30 a 0,03 mL/poço e incubado 30 minutos a 37 °C. A placa foi lavada 3 vezes com ddH20 e deixada a secar. As amostras foram observadas num microscópio de fluorescência e a TCID50/mL foi determinada utilizando o método de cálculo de Reed-Meunsch.
Os resultados de TCID50 indicaram que a ISi-1 tinha 1,8 x 101 2 3 4 5 bactérias/mL. Um quarto inoculo foi um placebo e foi derivado de células em cultura de tecidos processado do mesmo modo que as vacinas. A vacina morta foi testada para o conteúdo em proteína total utilizando o método do Biureto e continha 0,311 mg/mL.
Os porcos foram vacinados em 12/13/95. A vacina viva foi toda administrada a uma dose de 2 mL IN com 1 mL/narina. A vacina ISi-2 (morta) foi administrada IM com 1,5 mL/porco e novamente 14 dias mais tarde. Todos os animais de controlo foram administrados com células não infectadas do mesmo modo que as vacinas vivas.
Observação e Amostras: 1
Foram recolhidos esfregaços fecais e soros a intervalos de 2 7 dias ao longo do estudo. Os esfregaços fecais foram processados para testes de PCR utilizando o conjunto de iniciadores, 3 5'-TATGGCTGTCAAACACTCCG-3' e 5'-TGAAGGTATTGGTATTCTCC-3' para as 4 amplificações de ADN. Os parâmetros de ciclo foram 93 °C durante 5 minutos, 55 °C durante 45 segundos, e 72 °C durante 45 segundos para o primeiro ciclo. Foram realizados trinta e 54 cinco ciclos às temperaturas previamente mencionadas durante 45 segundos por temperatura. 0 ciclo final foi de 93 °C durante 45 segundos, 55 °C durante 45 segundos, e 72 °C durante 2 minutos, iniciadores definidos por Jones et al.
Exposição:
Todos os animais, excepto controlos restritos, foram administrados com uma cultura de exposição 26 e 27 dias após vacinação consistindo em culturas de passagem baixa de L. intracellularis estirpes N343 e N72994 que foram cultivadas entre 8 e 12 semanas continuamente. As culturas foram recolhidas por centrifugação a 3000 x g durante 20 minutos. Os sedimentos foram ressuspensos em solução de Sacarose-Fosfato-Glutamato (SPG) com soro de bovino fetal a 10% e passados 4 vezes através de uma agulha de calibre 25. Algumas culturas recolhidas foram armazenadas a -70 °C até ao tempo da exposição enquanto que outros foram cultivados até ao dia da exposição e recolhidos. Os inóculos de exposição foram combinados e as TCID50 das culturas foram determinadas. As amostras foram armazenadas em gelo até serem administradas. A cultura de exposição administrada em 1/8/96 consistiu em 4 x 104 bactérias/mL e a cultura de exposição administrada em 1/9/96 possuía 3 χ 104 bactérias/mL. Os porcos foram administrados com 15 mL de exposição em ambos os dias através de lavagem gástrica. Os animais receberam assim 6 χ 105 bactérias/porco e 4,7 χ 105 bactérias/porco em 1/8/96 e 1/9/96, respectivamente. 55
Resultados :
Segurança:
Resultados da PCR Fecal: A detecção de L. intracellularis utilizando PCR demonstrou que nenhum porco tinha derramamento das bactérias no inicio do estudo. Aos sete dias após vacinação todos os porcos eram negativos. Catorze dias após vacinação 3 porcos no grupo ISi-1 eram positivos. Dois animais eram positivos no grupo ISi-1 21 dias após vacinação e todos os outros porcos eram negativos. Ao dia 26 após vacinação nenhum animal sofria derramamento da bactéria como detectado por PCR. Vinte e seis dias após vacinação 5 porcos dos grupos ISi-1 e controlos e 4 porcos do grupo lSi-2 foram submetidos a necropsia. As amostras recolhidas foram íleo, cólon, nódulo linfático mesentérico, e amígdalas, assim como amostras de pulmão de porcos com lesões suspeitas para pneumonia.
Foram realizados testes de PCR nas amostras individuais de íleo e pulmão. Amígdalas, cólon, e nódulos linfáticos foram reunidos por tratamento do grupo e foi realizada PCR. Os resultados dos testes da PCR estão abaixo. 56
Grupo PCR do Cólon Amígdalas Nódulo Pulmão íleo 26 reunido reunidas Linfático reunido dias após mesentérico vacinação reunido ISi-1 1 de 5 + - - 1 de 1 ISi-2 0 de 4 - - - 0 de 1 Controlos 0 de 5 - - sem teste Controlos sem teste sem sem teste sem teste sem restritos teste teste
As secções histológicas dos íleos foram coradas utilizando um anticorpo monoclonal específico para L. intracellularis como o anticorpo primário e conjugado imunoglobulina G anti-murganho-fluorocromo como o anticorpo secundário. Foram observadas L. intracellularis em 3 dos cinco porcos de ISi-1. Todos os outros porcos foram negativos por coloração com anticorpo fluorescente.
Os porcos restantes foram submetidos a necropsia 21 dias após exposição e as mesmas amostras foram recolhidas para avaliação. Os resultados da PCR estão listados abaixo. 57
Grupo PCR do íleo Cólon Amígdalas Nódulo Pulmão 21 dias reunido reunidas Linfático reunido após mesentérico vacinação reunido ISi-1 0 de 10 + - - - ISi-2 0 de 6 - - - - Controlos 4 de 10 - - - Controlos 0 de 5 _ _ _ _ restritos
As colorações de FA dos íleos foram realizadas como referido acima, com 7 de 10 animais positivos no grupo de controlo. Todos os outros animais eram negativos para a presença de L. intracellularis. O soro foi testado para a produção de anticorpo IgG pelos porcos após exposição a L. intracellularis. O teste foi estabelecido semeando placas de Terasaki tratadas de cultura de tecidos com células McCoys a 125 células/poço e cultivadas 18-24 horas antes da infecção. A cultura pura de L. intracellularis diluída para 1000-3000 bactérias/mL em DMEM com soro de bovino fetal a 5% foi então adicionada aos poços com 0,01 mL/poço. A placa foi incubada durante 6 dias a concentrações de gás 02 a 8,0%, C02 a 8,8% e n2 a 83,2%. As células foram fixadas com acetona fria a 50% e metanol a 50% durante 2 minutos. Os soros dos porcos foram diluídos 1:75 em PBS estéril. O soro diluído foi adicionado aos poços a 0,01 mL/poço. As placas foram então incubadas durante 30-60 minutos a 37 °C. As placas foram lavadas 5 vezes com PBS estéril. Foi adicionado aos poços, 0,01 mL/poço de conjugado de imunoglobulina G IgG anti-suíno-fluorocromo. A placa foi incubada durante 30 minutos a 37 °C. As placas foram 58 lavadas 5 vezes com ddH20 e deixado a secar. As amostras foram lavadas 5 vezes com ddH20 e deixadas a secar. As amostras foram observadas num microscópio de fluorescência e os poços nos quais as bactérias foram observadas foram marcados positivos, e os poços em que não se observaram bactéria foram marcados como negativos.
Resultados:
Grupo Dia 0 6 dias Após 47 dias após vacinação vacinação 21 dias após a Exposição ISi-1 0 de 15 6 de 15 8 de 10 ISi-2 0 de 10 3 de 10 5 de 6 Controlos 1 de 15 0 de 15 9 de 10 Controlos restritos 0 de 5 0 de 5 0 de 5
Os animais que eram positivos no dia 0 foram novamente testados a intervalos semanais. Os resultados demonstraram que todos se tornaram serologicamente negativos em 14 dias após vacinação. Isto não é inesperado uma vez que a idade dos porcos no dia 0 era de três semanas e os resultados positivos nessa idade podem ser devidos aos anticorpos maternos.
Os soros foram testados juntamente com um soro de controlo positivo obtido por hiperimunização de um porco com L. intracellularis cultivado em cultura pura. 0 soro de controlo negativo utilizado foi recolhido a partir de um porco gnotobiótico na Universidade do Estado do Dakota do Sul. 59 A descrição acima e os exemplos são apenas ilustrativos das formas de realização preferidas que alcançam os objectivos, caracteristicas, e vantagens da presente invenção, e não se pretende que a presente invenção esteja limitada a eles.
Lisboa, 6 de Novembro de 2007 60

Claims (23)

  1. REIVINDICAÇÕES 1. Método para produzir uma vacina contra L. intracellularis compreendendo os passos de: (1) cultivar as bactérias L. intracellularis para obter células em cultura infectadas com L. intracellularis; (2) incubar as referidas células infectadas a uma concentração de oxigénio inferior a cerca de 18 porcento mantendo as referidas células infectadas em suspensão; (3) cultivar as bactérias L. intracellularis; e (4) misturar as bactérias L. intracellularis com um veículo farmaceuticamente aceitável.
  2. 2. Método da reivindicação 1 compreendendo o passo adicional de passagem de uma porção das referidas células infectadas para células frescas para aumentar a produção de bactérias L. intracellularis.
  3. 3. Método da reivindicação 1, em que as referidas bactérias L. intracellularis são obtidas a partir de um animal infectado com L. intracellularis.
  4. 4. Método da reivindicação 3, em que o referido animal é um porco.
  5. 5. Método da reivindicação 1, em que a referida incubação ocorre a uma concentração de oxigénio no intervalo de 0 porcento a cerca de 8 porcento. 1
  6. 6. Método da reivindicação 5, em que a referida incubação ocorre a uma concentração de oxigénio no intervalo de 0 porcento a cerca de 3 porcento.
  7. 7. Método da reivindicação 5, em que a referida incubação ocorre a uma concentração de dióxido de carbono no intervalo de cerca de 6 porcento a cerca de 9 porcento.
  8. 8. Método da reivindicação 7, em que a referida incubação ocorre a uma concentração de hidrogénio no intervalo de cerca de 73 porcento a cerca de 94 porcento.
  9. 9. Método da reivindicação 8, em que a referida incubação ocorre de cerca de 0 a cerca de 8,0 porcento de 02, cerca de 8,8 porcento de C02 e cerca de 83,2 porcento de H2.
  10. 10. Método da reivindicação 1, em que as referidas células em cultura são seleccionadas a partir do grupo consistindo em células HEp-2, McCoys, e IEC-18.
  11. 11. Método da reivindicação 10, em que as referidas células McCoys e IEC-18 estão em microveículos.
  12. 12. Método da reivindicação 10, em que as referidas células em cultura são células HEp-2 que são cultivadas na ausência de microveículos.
  13. 13. Método para produzir uma vacina contra L. intracellularis compreendendo os passos: (1) inocular as células em cultura com um inoculo compreendendo bactérias L. intracellularis de modo a 2 infectar as referidas células com as referidas bactérias; (2) incubar as referidas células infectadas a uma temperatura de cerca de 36 °C a cerca de 38 °C numa concentração de oxigénio de 0% a cerca de 8%, agitando as referidas células infectadas de modo a cultivar as bactérias L. intracellularis mantendo as referidas células infectadas em suspensão; (3) recolher L. intracellularis·, e (4) misturar as L. intracellularis num veiculo farmaceuticamente aceitável.
  14. 14. Método de acordo com as reivindicações 1 ou 13, em que o referido método compreende ainda o passo de inactivar as L. intracellularis cultivadas para obter uma vacina morta.
  15. 15. Método de acordo com a reivindicação 14, em que as L. intracellularis são inactivadas utilizando 0,3% de formalina ou por exposição prolongada aos níveis de 02 ambientais.
  16. 16. Método para produzir uma vacina contra L. intracellularis, em que a referida vacina compreende uma estirpe atenuada de L. intracellularis, compreendendo os passos de: (1) produzir uma estirpe atenuada de L. intracellularis compreendendo a obtenção de células em cultura infectadas com bactérias L. intracellularis, incubar as referidas células infectadas a uma concentração de oxigénio de 0 porcento a cerca de 18 porcento, agitando as referidas células infectadas de modo a cultivar as referidas bactérias mantendo as referidas células 3 infectadas em suspensão, passando, pelo menos, uma porção das referidas bactérias cultivadas, recolhendo, pelo menos, uma porção das referidas bactérias cultivadas, e seleccionando uma estirpe atenuada para proporcionar uma estirpe atenuada de bactérias L. intracellularis; e (2) misturar a referida L. intracellularis atenuada num veículo farmaceuticamente aceitável.
  17. 17. Método da reivindicação 16, em que a referida incubação ocorre a uma concentração de oxigénio no intervalo de 0 porcento a cerca de 3 porcento.
  18. 18. Método da reivindicação 16, em que a referida incubação ocorre a uma concentração de dióxido de carbono no intervalo de cerca de 6 porcento a cerca de 9 porcento.
  19. 19. Método da reivindicação 18, em que a referida incubação ocorre a uma concentração de hidrogénio no intervalo de cerca de 73 porcento a cerca de 94 porcento.
  20. 20. Método da reivindicação 19, em que a referida incubação ocorre de cerca de 0 a cerca de 8,0 porcento de 02, cerca de 8,8 porcento de C02 e cerca de 83,2 porcento de H2.
  21. 21. Método da reivindicação 18, em que as referidas células em cultura são seleccionadas a partir do grupo consistindo em células HEp-2, McCoys, e IEC-18. 4
  22. 22. Método da reivindicação 17, em que as referidas células em cultura são células HEp-2 que são cultivadas na ausência de microveículos.
  23. 23. Método da reivindicação 16, em que as referidas células em cultura são mantidas em suspensão durante 6-8 meses. Lisboa, 6 de Novembro de 2007 5
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Families Citing this family (61)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2236574A1 (en) * 1995-11-30 1997-06-05 Daratech Pty. Ltd. Therapeutic and diagnostic compositions
FR2772047B1 (fr) * 1997-12-05 2004-04-09 Ct Nat D Etudes Veterinaires E Sequence genomique et polypeptides de circovirus associe a la maladie de l'amaigrissement du porcelet (map), applications au diagnostic et a la prevention et/ou au traitement de l'infection
BR0011290A (pt) * 1999-05-13 2002-05-21 Agriculture Victoria Serv Pty Gene derivado de lawsonia e polipeptìdeos, peptìdeos e proteìnas de omph relacionados e seus usos
AU775323B2 (en) * 1999-05-13 2004-07-29 Agriculture Victoria Services Pty Ltd Lawsonia derived gene and related hemolysin polypeptides, peptides and proteins and their uses
US7029683B1 (en) 1999-05-13 2006-04-18 Pfizer Products, Inc. Lawsonia derived gene and related hemolysin polypeptides, peptides and proteins and their uses
JP2003516113A (ja) * 1999-05-13 2003-05-13 ファイザー プロダクツ インコーポレーティッド ローソニア由来の遺伝子及び関連ＦｌｇＥポリペプチド、ぺプチド及びタンパク質並びにそれらの使用
CA2372095A1 (en) * 1999-05-13 2000-11-23 Pfizer Products Inc. Lawsonia derived gene and related sodc polypeptides, peptides and proteins and their uses
US7052697B1 (en) * 1999-05-13 2006-05-30 Agriculture Victoria Services Pty Ltd Lawsonia derived gene and related OmpH polypeptides, peptides and proteins and their uses
US6605696B1 (en) * 1999-10-22 2003-08-12 Pfizer, Inc. Lawsonia intracellularis proteins, and related methods and materials
WO2002026250A2 (en) * 2000-09-29 2002-04-04 Arizona Board Of Regents On Behalf Of The University Of Arizona Vaccines for proliferative ileitis
JP2004512851A (ja) * 2000-11-10 2004-04-30 アグリカルチュア　ビクトリア　サービシーズプロプライエトリー　リミティッド ラウソニア種による感染を処置する新規な治療用組成物
AUPR138100A0 (en) 2000-11-10 2000-12-07 Agriculture Victoria Services Pty Ltd Novel therapeutic compositions for treating infection by lawsonia spp
DE60144201D1 (de) * 2000-12-20 2011-04-21 Intervet Int Bv Lawsonia intracellularis Impfstoff
US20030087421A1 (en) * 2001-07-11 2003-05-08 Gebhart Connie J Lawsonia intracellularis
JP2006501846A (ja) * 2002-10-04 2006-01-19 リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミネソタ ローソニア・イントラセルラリス由来の核酸およびポリペプチド配列ならびに使用方法
RU2420570C2 (ru) * 2003-07-25 2011-06-10 Бёрингер Ингельхайм Ветмедика, Инк. Lawsonia intracellularis ЕВРОПЕЙСКОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ И ВАКЦИНЫ, ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ АГЕНТЫ НА ЕЕ ОСНОВЕ И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
DE602004024423D1 (de) * 2003-09-12 2010-01-14 Intervet Int Bv Impfstoff mit lawsonia intracellularis-untereinheit
CA2548750A1 (en) * 2003-12-09 2005-06-23 Intervet International B.V. Lawsonia intracellularis 26 kd subunit vaccine
ATE470673T1 (de) * 2004-01-22 2010-06-15 Intervet Int Bv Impfstoffe mit lawsoniaintrazellularis- untereinheit
MY146476A (en) 2004-06-24 2012-08-15 Boehringer Ingelheim Vetmed Method of diagnosing lawsonia intracellularis
EP1609870A1 (en) * 2004-06-24 2005-12-28 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Method of diagnosing lawsonia intracellularis
US20060021536A1 (en) * 2004-07-30 2006-02-02 Limin Song Method for creating an absorbent article exhibiting a harmonic color scheme
KR100621882B1 (ko) * 2004-09-30 2006-09-19 건국대학교 산학협력단 돼지 증식성 회장염 감염돈에서 로소니아인트라셀룰라리스 균을 분리하는 방법
AU2005308583A1 (en) * 2004-11-24 2006-06-01 Pharmacia & Upjohn Company Llc Methods for cultivating Lawsonia intracellularis
US20070212373A1 (en) * 2004-12-08 2007-09-13 Akzo Nobel N.V. Lawsonia Intracellularis 26 Kd Subunit Vaccine
US7833707B2 (en) * 2004-12-30 2010-11-16 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Methods of overexpression and recovery of porcine circovirus type 2 ORF2
US7700285B1 (en) 2005-12-29 2010-04-20 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. PCV2 immunogenic compositions and methods of producing such compositions
UA95602C2 (ru) 2004-12-30 2011-08-25 Берингер Ингельхейм Ветмедика, Инк. Иммуногенная композиция цвс2 и способы приготовления такой композиции
US8834891B2 (en) 2005-03-14 2014-09-16 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Immunogenic compositions comprising Lawsonia intracellularis
US8398994B2 (en) 2005-07-15 2013-03-19 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Lawsonia vaccine and methods of use thereof
EP1968630B1 (en) 2005-12-29 2018-01-24 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Multivalent pcv2 immunogenic compositions
DK3127551T3 (da) 2005-12-29 2020-10-12 Boehringer Ingelheim Animal Health Usa Inc Pcv2-immunogen-sammensætning til at mindske kliniske symptomer i grise
US8470336B2 (en) * 2006-05-25 2013-06-25 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Vaccination of young animals against Lawsonia intracellularis infections
US20080241190A1 (en) * 2006-11-13 2008-10-02 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Vaccination of horses against lawsonia intracellularis
US20100129397A1 (en) * 2006-12-11 2010-05-27 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Effective method of treatment of porcine circovirus and lawsonia intracellularis infections
PT2481420T (pt) * 2006-12-15 2019-05-31 Boehringer Ingelheim Animal Health Usa Inc Vacina para porcos anti-pcv2 de dose única
EP1941903A1 (en) 2007-01-03 2008-07-09 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Prophylaxis and treatment of PRDC
EP1958644A1 (en) 2007-02-13 2008-08-20 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Prevention and treatment of sub-clinical pcvd
US7829274B2 (en) * 2007-09-04 2010-11-09 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Reduction of concomitant infections in pigs by the use of PCV2 antigen
US8398970B2 (en) * 2007-09-17 2013-03-19 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Method of preventing early Lawsonia intracellularis infections
JP2011500034A (ja) * 2007-10-12 2011-01-06 ファイザー・インク ロウソニア・イントラセルラリス（ｌａｗｓｏｎｉａｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）を培養する方法
JP2011508595A (ja) * 2007-12-31 2011-03-17 ベーリンガー インゲルハイム フェトメディカ インコーポレイテッド 外来性アミノ酸の挿入を含むｐｃｖ２ｏｒｆ２ウイルス様粒子
US20090317423A1 (en) * 2008-01-23 2009-12-24 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Pcv2 mycoplasma hyopneumoniae immunogenic compositions and methods of producing such compositions
WO2009103037A1 (en) * 2008-02-15 2009-08-20 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Methods and compositions for reducing the impact of enteric diseases
TWI449533B (zh) 2008-04-18 2014-08-21 Intervet Int Bv 防備胞內勞森菌（Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）、豬肺炎黴漿菌（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）及豬環狀病毒（Ｐｏｒｃｉｎｅ ｃｉｒｃｏ ｖｉｒｕｓ）用疫苗
TWI551295B (zh) 2008-04-18 2016-10-01 英特威特國際股份有限公司 防備胞內勞森菌（Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）用疫苗
ES2534556T3 (es) 2008-07-22 2015-04-24 Intervet International Bv Bacteria Lawsonia intracellularis de un nuevo serotipo, vacuna basada en esa bacteria, anticuerpos adecuados para diagnosticar el nuevo serotipo de Lawsonia intracellularis e hibridomas para producir dichos anticuerpos
US8142760B2 (en) * 2008-09-05 2012-03-27 Nathan Len Winkelman Vaccination for Lawsonia intracellularis
WO2011006880A1 (en) * 2009-07-14 2011-01-20 Intervet International B.V. Lawsonia intracellularis propagation
TWI627281B (zh) * 2009-09-02 2018-06-21 百靈佳殷格翰家畜藥品公司 降低ｐｃｖ－２組合物殺病毒活性之方法及具有改良免疫原性之ｐｃｖ－２組合物
US8530223B2 (en) * 2009-11-09 2013-09-10 Intervet International B.V. Method to grow Lawsonia intracellularis bacteria in persistently infected McCoy cells
CN104968365B (zh) 2012-12-28 2018-04-03 勃林格殷格翰动物保健有限公司 支原体疫苗的制备方法
JP6821429B2 (ja) 2013-09-25 2021-01-27 ゾエティス・サービシーズ・エルエルシー Ｐｃｖ２ｂ分岐ワクチン組成物及び使用方法
US9505808B2 (en) 2013-10-02 2016-11-29 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. PCV2 ORF2 protein variant and virus like particles composed thereof
CN107206062B (zh) 2015-02-04 2021-07-02 英特维特国际股份有限公司 用于针对猪中亚临床劳森氏菌感染的疫苗
RU2709197C2 (ru) 2015-02-04 2019-12-17 Интервет Интернэшнл Б.В. Вакцина для применения против субклинической инфекции lawsonia у свиней
KR20180062468A (ko) * 2016-11-18 2018-06-11 녹십자수의약품(주) 신규한 로소니아 인트라셀룰라리스 균주 및 이의 용도
CA3088651A1 (en) 2018-02-28 2019-09-06 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Method for reducing skatole and/or indole in animals
BR112023001324A2 (pt) 2020-07-24 2023-02-14 Boehringer Ingelheim Animal Health Usa Inc Combinação de vacina de suíno
AU2022375120A1 (en) 2021-11-01 2024-04-11 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Immunogenic gel compositions
WO2024068637A1 (en) 2022-09-27 2024-04-04 Intervet International B.V. A method of culturing lawsonia intracellularis bacteria

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4132597A (en) * 1976-06-09 1979-01-02 Ab Medipharm Method for cultivation of bacteria
US4237218A (en) * 1979-02-09 1980-12-02 Bio-Rad Laboratories, Inc. Micro-carrier cell culture
JPS5991879A (ja) * 1982-11-16 1984-05-26 Hideaki Yamada シユ−ドモナス属細菌の培養法
DK594084A (da) * 1984-12-12 1986-06-13 Novo Industri As Fremgangsmaade til stabilisering af extra-chromosomale elementer i bakterier under dyrkning
JPH0644865B2 (ja) * 1985-10-29 1994-06-15 三菱瓦斯化学株式会社 カンピロバクタ−属細菌の培養方法
US5338670A (en) * 1986-07-28 1994-08-16 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Production of bordetella pertussis toxin with a low concentration of iron
IT1227657B (it) * 1988-12-01 1991-04-23 Mini Ricerca Scient Tecnolog Antibiotici ab-021 e processo per la loro produzione
JPH0822221B2 (ja) * 1988-12-28 1996-03-06 日東化学工業株式会社 シュードモナス属細菌の培養法
JPH02308754A (ja) * 1989-05-24 1990-12-21 Yakult Honsha Co Ltd 乳発酵食品の製造法
US5296221A (en) * 1990-01-31 1994-03-22 Sani-Ei Sucrochemical Co., Ltd. Lactobacillus johnsonii ferm bp-2680 lactic acid bacteria preparations using the same and a process of manufacturing the preparations
WO1992007934A1 (en) * 1990-11-01 1992-05-14 Iowa State University Research Foundation, Inc. Bacterial attenuation method and vaccine
CA2123222C (en) * 1991-11-15 2001-02-27 Donald A. Dearwester Gram-negative bacterial vaccines
DE4208785A1 (de) * 1992-03-19 1993-09-23 Degussa Verfahren zum auffinden von insertionselementen (is-elemente) oder transposonen
US5610059A (en) * 1992-11-09 1997-03-11 University Of Arizona Etiological agent for porcine enteritis

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Publication number Publication date
DE843818T1 (de) 2002-11-28
US5885823A (en) 1999-03-23
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AU6262796A (en) 1996-12-24
EP1655607B1 (en) 2015-05-13
CZ389997A3 (cs) 1998-07-15
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NL300331I1 (nl) 2008-03-03
RU2265849C2 (ru) 2005-12-10
PL189250B1 (pl) 2005-07-29
BG102130A (en) 1998-09-30
EP2199795B1 (en) 2016-03-30
DE69638016D1 (de) 2009-10-15
BR9608338A (pt) 1999-01-05
WO1996039629A1 (en) 1996-12-12
DK1403643T3 (da) 2010-01-04
EP2199795A3 (en) 2010-11-03
CA2222643C (en) 2013-08-13
DE69637251T3 (de) 2016-06-02
KR20060129549A (ko) 2006-12-15
CZ295933B6 (cs) 2005-12-14
ES2294620T5 (es) 2016-03-23
ATE373015T1 (de) 2007-09-15
BR9608338B1 (pt) 2009-05-05
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FR07C0071I2 (fr) 2010-12-31
DK1645567T3 (da) 2007-11-26
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FR07C0071I1 (pt) 2008-01-02
PL189187B1 (pl) 2005-07-29
EP0843818A1 (en) 1998-05-27
RU2005114739A (ru) 2006-11-20
EP0843818A4 (en) 2002-02-06
JP4263212B2 (ja) 2009-05-13
PL189287B1 (pl) 2005-07-29
JP3920300B2 (ja) 2007-05-30
CA2222643A1 (en) 1996-12-12

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