CN114990169A - 一种制备EGCG-3”-Me的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种制备EGCG‑3”‑Me的方法,属于物质制备技术领域,包括将茶树EGCG‑O‑甲基转移酶酶液与底物溶液混合,得到反应液;所述底物溶液中含有多甲氧基黄酮、表没食子儿茶素没食子酸酯;多甲氧基黄酮包括陈皮甙、橘皮素和川陈皮素;将得到的反应液在35℃条件下反应1h,得到EGCG‑3”‑Me。采用本发明的方法产率高,适合大规模生产。
Description
技术领域
本发明属于物质制备技术领域,尤其涉及一种制备EGCG-3”-Me的方法。
背景技术
茶叶是全球公认的健康饮料。近年来有研究表明,茶叶中的甲基化儿茶素类成分,尤其是表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)的甲基化衍生物,尤其是(-)-表没食子儿茶素3-O(3-O-甲基)没食子酸酯(EGCG-3”-Me)具有显著的抗过敏功效,特别是对预防和抑制花粉导致的过敏症状尤为显著。因此,EGCG-3”-Me的抗过敏功能是近年来茶叶生物活性功能的研究热点。
富含EGCG-3”-Me的产品受到了消费者的广泛欢迎,目前已初具市场规模。在食品和生物医药领域对EGCG-3”-Me的需求量也日渐增加,所以,EGCG-3”-Me合成的研究具有十分重要的意义。
已有的研究结果表明,除少数茶树资源中含有相对较高的EGCG-3”-Me,其他茶树品种中EGCG-3”-Me含量极低。EGCG-3”-Me已有的合成方法主要包括化学合成法和生物酶法。化学合成法中反应条件苛刻,副产物多且分离提纯难度较大,同时大量有机溶剂和基团保护剂的使用,使得该方法合成的EGCG-3”-Me很难应用于食品领域。体外酶法合成具有酶促合成反应共有的特点,反应条件温和相对较为安全、专一性强且产物单纯,在反应液中EGCG-3”-Me分离简便。但是目前已有的体外酶法合成研究结果表明,实验室条件下,体外表达的茶树EGCG-O-甲基转移酶合成EGCG-3”-Me实验中EGCG转化率较低,底物损失大,产率低,成本高,并不适合用于EGCG-3”-Me的大量生产。
发明内容
有鉴于此,本发明的目的在于提供一种制备EGCG-3”-Me的方法,采用本发明的方法产率高,适合大规模生产。
为了实现上述发明目的,本发明提供了以下技术方案:
本发明提供了一种制备EGCG-3”-Me的方法,包括以下步骤:
1)将茶树EGCG-O-甲基转移酶酶液与底物溶液混合,得到反应液;
所述底物溶液中含有多甲氧基黄酮、表没食子儿茶素没食子酸酯、氯化镁和二硫苏糖醇;所述底物溶液中表没食子儿茶素没食子酸酯的浓度为0.3mmol/L,氯化镁的浓度为2mmol/L,二硫苏糖醇的浓度为2mmol/L;
所述多甲氧基黄酮包括陈皮甙、橘皮素和川陈皮素中的一种或几种;
所述茶树EGCG-O-甲基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示;
所述茶树EGCG-O-甲基转移酶酶液的浓度为1mg/mL;
所述茶树EGCG-O-甲基转移酶酶液与底物溶液的体积比为1:15;
2)将所述步骤1)得到的反应液在35℃条件下反应1h,得到EGCG-3”-Me。
优选的,当所述多甲氧基黄酮为陈皮甙时,所述底物溶液中陈皮甙的浓度为0.4mmol/L。
优选的,当所述多甲氧基黄酮为橘皮素时,所述底物溶液中橘皮素的浓度为0.4mmol/L。
优选的,当所述多甲氧基黄酮为川陈皮素时,所述底物溶液中川陈皮素的浓度为0.4mmol/L。
优选的,所述多甲氧基黄酮来源于茶枝柑、温州蜜柑、椪柑、沃柑或茂谷柑;
当所述多甲氧基黄酮来源于茶枝柑时,所述底物溶液中川陈皮素的浓度为0.12mg/mL,橘皮素的浓度为0.16mg/mL,陈皮甙的浓度为1.40mg/mL;
当所述多甲氧基黄酮来源于温州蜜柑时,所述底物溶液中川陈皮素的浓度为0.24mg/mL,橘皮素的浓度为0.02mg/mL,陈皮甙的浓度为1.47mg/mL;
当所述多甲氧基黄酮来源于椪柑时,所述底物溶液中川陈皮素的浓度为0.28mg/mL,橘皮素的浓度为0.45mg/mL,陈皮甙的浓度为1.51mg/mL;
当所述多甲氧基黄酮来源于沃柑时,所述底物溶液中川陈皮素的浓度为0.05mg/mL,橘皮素的浓度为0.04mg/mL,陈皮甙的浓度为1.47mg/mL;
当所述多甲氧基黄酮来源于茂谷柑时,所述底物溶液中川陈皮素的浓度为0.06mg/mL,橘皮素的浓度为0.16mg/mL,陈皮甙的浓度为1.56mg/mL。
优选的,当所述多甲氧基黄酮来源于柠檬时,所述底物溶液中川陈皮素的浓度为0.02mg/mL,橘皮素的浓度为0.03mg/mL,陈皮甙的浓度为1.14mg/mL。
优选的,当所述多甲氧基黄酮来源于甜橙时,所述底物溶液中川陈皮素的浓度为0.06mg/mL,橘皮素的浓度为0.02mg/mL,陈皮甙的浓度为1.50mg/mL。
优选的,当所述多甲氧基黄酮来源于无核蜜桔时,所述底物溶液中川陈皮素的浓度为0.01mg/mL,橘皮素的浓度为0.03mg/mL,陈皮甙的浓度为1.54mg/mL。
优选的,当所述多甲氧基黄酮来源于沙田柚时,所述底物溶液中川陈皮素的浓度为0.03mg/mL,橘皮素的浓度为0.02mg/mL,陈皮甙的浓度为0.07mg/mL。
优选的,当所述多甲氧基黄酮来源于砂糖橘时,所述底物溶液中川陈皮素的浓度为0.04mg/mL,橘皮素的浓度为0.14mg/mL,陈皮甙的浓度为1.12mg/mL。
本发明制备EGCG-3”-Me的机理为:
在一定条件下,茶树EGCG-O-甲基转移酶以EGCG和多甲氧基黄酮为底物,催化合成EGCG-3”-Me。
附图说明
图1为陈皮甙反应结果HPLC图;
图2为橘皮素反应结果HPLC图;
图3为川陈皮素反应结果HPLC图;
图4为柑橘果实多甲氧基黄酮反应结果HPLC图。
具体实施方式
本发明提供了一种制备EGCG-3”-Me的方法,包括以下步骤:
1)将茶树EGCG-O-甲基转移酶酶液与底物溶液混合,得到反应液;
所述底物溶液中含有多甲氧基黄酮、表没食子儿茶素没食子酸酯、氯化镁和二硫苏糖醇;所述底物溶液中表没食子儿茶素没食子酸酯的浓度为0.3mmol/L,氯化镁的浓度为2mmol/L,二硫苏糖醇的浓度为2mmol/L;
所述多甲氧基黄酮包括陈皮甙、橘皮素和川陈皮素中的一种或几种;
所述茶树EGCG-O-甲基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示;
所述茶树EGCG-O-甲基转移酶酶液的浓度为1mg/mL;
所述茶树EGCG-O-甲基转移酶酶液与底物溶液的体积比为1:15;
2)将所述步骤1)得到的反应液在35℃条件下反应1h,得到EGCG-3”-Me。
在本发明中,所述EGCG-O-甲基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示,具体如下:
MATNGEGEQNLRHQEVGHKSLLQSDALYQYILETSVYPREPEAMKELREVTAKHPWNIMTTSADEGQFLNMLLKLINAKNTMEIGVYTGYSLLATALALPDDGKILAMDINRDNFEIGLPIIEKAGVAHKIDFREGPALPALDKMIEDGKHHGSFDFIFVDADKDNYINYHKRLIDLVKVGGLIGYDNTLWNGSVVAPPDAPMRKYVRYYRDFVLELNKALAADPRIEICMLPVGDGITLCRRVC。
本发明对所述EGCG-O-甲基转移酶的制备方法没有特殊限定,本领域技术人员按照常规制备方法即可,在本发明具体实施方式中,采用咖啡酰辅酶AO-甲基转移酶基因(GenBank Accession No.DD361102),通过大肠杆菌表达体系制备茶树EGCG-O-甲基转移酶。
本发明将得到的反应液在35℃条件下反应1h,得到EGCG-3”-Me。在本发明中,所述反应后还优选加入0.2mL 1.0mol/L盐酸终止反应,加入25mL乙酸乙酯萃取离心,取上部乙酸乙酯层置旋转蒸发仪中旋蒸至全干,得到EGCG-3”-Me。
在本发明中,当所述多甲氧基黄酮优选为陈皮甙时,所述底物溶液中陈皮甙的浓度优选为0.4mmol/L。在本发明中,当所述多甲氧基黄酮优选为橘皮素时,所述底物溶液中橘皮素的浓度优选为0.4mmol/L。在本发明中,当所述多甲氧基黄酮优选为川陈皮素时,所述底物溶液中川陈皮素的浓度优选为0.4mmol/L。
在本发明中,所述多甲氧基黄酮优选来源于茶枝柑、温州蜜柑、椪柑、沃柑或茂谷柑;当所述多甲氧基黄酮来源于茶枝柑时,所述底物溶液中川陈皮素的浓度优选为0.12mg/mL,橘皮素的浓度优选为0.16mg/mL,陈皮甙的浓度优选为1.40mg/mL;当所述多甲氧基黄酮优选来源于温州蜜柑时,所述底物溶液中川陈皮素的浓度优选为0.24mg/mL,橘皮素的浓度优选为0.02mg/mL,陈皮甙的浓度优选为1.47mg/mL;当所述多甲氧基黄酮来源于椪柑时,所述底物溶液中川陈皮素的浓度优选为0.28mg/mL,橘皮素的浓度优选为0.45mg/mL,陈皮甙的浓度优选为1.51mg/mL;当所述多甲氧基黄酮来源于沃柑时,所述底物溶液中川陈皮素的浓度优选为0.05mg/mL,橘皮素的浓度优选为0.04mg/mL,陈皮甙的浓度优选为1.47mg/mL;当所述多甲氧基黄酮来源于茂谷柑时,所述底物溶液中川陈皮素的浓度优选为0.06mg/mL,橘皮素的浓度优选为0.16mg/mL,陈皮甙的浓度优选为1.56mg/mL。
在本发明中,当所述多甲氧基黄酮优选来源于柠檬时,所述底物溶液中川陈皮素的浓度优选为0.02mg/mL,橘皮素的浓度优选为0.03mg/mL,陈皮甙的浓度优选为1.14mg/mL。
在本发明中,当所述多甲氧基黄酮来源于甜橙时,所述底物溶液中川陈皮素的浓度优选为0.06mg/mL,橘皮素的浓度优选为0.02mg/mL,陈皮甙的浓度优选为1.14mg/mL。
在本发明中,当所述多甲氧基黄酮来源于无核蜜桔时,所述底物溶液中川陈皮素的浓度优选为0.001mg/mL,橘皮素的浓度优选为0.03mg/mL,陈皮甙的浓度优选为1.54mg/mL。
在本发明中,当所述多甲氧基黄酮来源于沙田柚时,所述底物溶液中川陈皮素的浓度优选为0.03mg/mL,橘皮素的浓度优选为0.02mg/mL,陈皮甙的浓度优选为0.07mg/mL。
在本发明中,当所述多甲氧基黄酮来源于砂糖橘时,所述底物溶液中川陈皮素的浓度优选为0.04mg/mL,橘皮素的浓度优选为0.14mg/mL,陈皮甙的浓度优选为1.12mg/mL。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明,但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
茶树EGCG-O-甲基转移酶以EGCG和川陈皮素为底物催化合成甲基儿茶素EGCG-3”-Me:
选用咖啡酰辅酶A O-甲基转移酶基因(GenBank Accession No.DD361102),通过大肠杆菌表达体系制备茶树EGCG-O-甲基转移酶粗酶液,制备的茶树EGCG-O-甲基转移酶蛋白序列为:
MATNGEGEQNLRHQEVGHKSLLQSDALYQYILETSVYPREPEAMKELREVTAKHPWNIMTTSADEGQFLNMLLKLINAKNTMEIGVYTGYSLLATALALPDDGKILAMDINRDNFEIGLPIIEKAGVAHKIDFREGPALPALDKMIEDGKHHGSFDFIFVDADKDNYINYHKRLIDLVKVGGLIGYDNTLWNGSVVAPPDAPMRKYVRYYRDFVLELNKALAADPRIEICMLPVGDGITLCRRVC
大肠杆菌体系表达:将含基因片段的质粒转入大肠杆菌感受态细胞中后接种至LB固体培养基(含氨苄)培养过夜;挑一个转化后重组质粒的单菌落接种于LB液体培养基中(含氨苄),于37℃过夜培养;取1-2mL过夜培养物,转接于100mL含氨苄的LB液体培养基中,于37℃,180rpm震荡培养1.5-2h至对数生长期;在培养物中加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.2-1.6mmol/L进行诱导表达,继续分别于37℃,180rpm震荡培养1.5-12h;离心,弃上清,并收集细胞;加入10V/W的蛋白破碎缓冲液(1x PBS),与大肠杆菌细胞混匀后进行超声波破碎,每处理1s,间隔3s,频率为23%,破碎处理时以不发生气泡,不过热为准,以菌液变清晰为终止标准。
取1mL茶树EGCG-O-甲基转移酶粗酶液(浓度1mg/ml)加入15mL川陈皮素反应液中(即:2mmol/L MgCl2、2mmol/L二硫苏糖醇、0.4mmol/L川陈皮素、0.3mmol/L EGCG、100mmol/L Tri-HCl pH=7.5),35℃条件下,反应1小时,加入0.2mL 1.0mol/L盐酸终止反应,加入25mL乙酸乙酯萃取离心,取上部乙酸乙酯层置旋转蒸发仪中旋蒸至全干,加入1.0mL纯甲醇复溶,HPLC检测EGCG-3”-Me生成量为275.68μg/mL,EGCG转化率为89.21%。
实施例2
茶树EGCG-O-甲基转移酶以EGCG和橘皮素为底物催化合成甲基儿茶素EGCG-3”-Me:
取1mL茶树EGCG-O-甲基转移酶粗酶液(浓度1mg/ml)(制备方法同实施例1)加入15mL橘皮素反应液中(即:2mmol/L MgCl2、2mmol/L二硫苏糖醇、0.4mmol/L橘皮素、0.3mmol/L EGCG、100mmol/L Tri-HCl pH=7.5),35℃条件下,反应1小时,加入0.2mL1.0mol/L盐酸终止反应,加入25mL乙酸乙酯萃取离心,取上部乙酸乙酯层置旋转蒸发仪中旋蒸至全干,加入1.0mL纯甲醇复溶,HPLC检测EGCG-3”-Me生成量为278.34μg/mL,EGCG转化率为71.20%。
实施例3
茶树EGCG-O-甲基转移酶以EGCG和陈皮甙为底物催化合成甲基儿茶素EGCG-3”-Me:
取1mL茶树EGCG-O-甲基转移酶粗酶液(浓度1mg/ml)(制备方法同实施例1)加入15mL陈皮甙反应液中(即:2mmol/L MgCl2、2mmol/L二硫苏糖醇、0.4mmol/L陈皮甙、0.3mmol/L EGCG、100mmol/L Tri-HCl pH=7.5),35℃条件下,反应1小时,加入0.2mL1.0mol/L盐酸终止反应,加入25mL乙酸乙酯萃取离心,取上部乙酸乙酯层置旋转蒸发仪中旋蒸至全干,加入1.0mL纯甲醇复溶,HPLC检测EGCG-3”-Me生成量为305.14μg/mL EGCG转化率为97.15%。
实施例4
茶树EGCG-O-甲基转移酶以EGCG和茶枝柑多甲氧基黄酮为底物催化合成甲基儿茶素EGCG-3”-Me:
取10.0g茶枝柑,80℃条件下加入30mL 60%甲醇水溶液浸提4min,过滤后同样方法再重复一次。采用同样方法共提取30.0g茶枝柑,合并所有提取液后置于旋转蒸发仪中旋蒸至完全干燥,加入纯水溶解后置于-20℃条件下冷冻24小时,随后转入冻干机中冷冻干燥,得到茶枝柑多甲氧基黄酮冻干粉。按照料液比1:150进行溶解保存在-20℃,即茶枝柑多甲氧基黄酮水溶液(川陈皮素的浓度为0.12mg/mL,橘皮素的浓度为0.16mg/mL,陈皮甙的浓度为1.40mg/mL),备用。
取1mL茶树EGCG-O-甲基转移酶粗酶液(制备方法同实施例1)加入15mL茶枝柑多甲氧基黄酮反应液中(即:含有2mmol/L MgCl2、2mmol/L二硫苏糖醇、0.3mmol/L EGCG的茶枝柑多甲氧基黄酮水溶液15mL),35℃条件下,反应1小时,加入0.2mL 1.0mol/L盐酸终止反应,加入25mL乙酸乙酯萃取离心,取上部乙酸乙酯层置旋转蒸发仪中旋蒸至全干,加入1.0mL纯甲醇复溶,HPLC检测EGCG-3”-Me生成量为10.50μg/mL。
实施例5
茶树EGCG-O-甲基转移酶以EGCG和柠檬多甲氧基黄酮为底物催化合成甲基儿茶素EGCG-3”-Me:
取10.0g柠檬,80℃条件下加入30mL 60%甲醇水溶液浸提4min,过滤后同样方法再重复一次。采用同样方法共提取30.0g柠檬,合并所有提取液后置于旋转蒸发仪中旋蒸至完全干燥,加入纯水溶解后置于-20℃条件下冷冻24小时,随后转入冻干机中冷冻干燥,得到柠檬多甲氧基黄酮冻干粉。按照料液比1:150进行溶解保存在-20℃,即柠檬多甲氧基黄酮水溶液(川陈皮素的浓度为0.02mg/mL,橘皮素的浓度为0.03mg/mL,陈皮甙的浓度为1.14mg/mL),备用。
取1mL茶树EGCG-O-甲基转移酶粗酶液(制备方法同实施例1)加入15mL柠檬多甲氧基黄酮反应液中(即:2mmol/L MgCl2、2mmol/L二硫苏糖醇、0.3mmol/L EGCG溶解于15mL柠檬多甲氧基黄酮水溶液),35℃条件下,反应1小时,加入0.2mL 1.0mol/L盐酸终止反应,加入25mL乙酸乙酯萃取离心,取上部乙酸乙酯层置旋转蒸发仪中旋蒸至全干,加入1.0mL纯甲醇复溶,HPLC检测EGCG-3”-Me生成量为8.50μg/mL。
实施例6
茶树EGCG-O-甲基转移酶以EGCG和甜橙多甲氧基黄酮为底物催化合成甲基儿茶素EGCG-3”-Me:
取10.0g甜橙,80℃条件下加入30mL 60%甲醇水溶液浸提4min,过滤后同样方法再重复一次。采用同样方法共提取30.0g甜橙,合并所有提取液后置于旋转蒸发仪中旋蒸至完全干燥,加入纯水溶解后置于-20℃条件下冷冻24小时,随后转入冻干机中冷冻干燥,得到甜橙多甲氧基黄酮冻干粉。按照料液比1:150进行溶解保存在-20℃,即甜橙多甲氧基黄酮水溶液(川陈皮素的浓度为0.06mg/mL,橘皮素的浓度为0.02mg/mL,陈皮甙的浓度为1.50mg/mL),备用。
取1mL茶树EGCG-O-甲基转移酶粗酶液(制备方法同实施例1)加入15mL甜橙多甲氧基黄酮反应液中(即:2mmol/L MgCl2、2mmol/L二硫苏糖醇、0.3mmol/L EGCG溶解于15mL甜橙多甲氧基黄酮水溶液),35℃条件下,反应1小时,加入0.2mL 1.0mol/L盐酸终止反应,加入25mL乙酸乙酯萃取离心,取上部乙酸乙酯层置旋转蒸发仪中旋蒸至全干,加入1.0mL纯甲醇复溶,HPLC检测EGCG-3”-Me生成量为11.25μg/mL。
实施例7
茶树EGCG-O-甲基转移酶以EGCG和温州蜜柑多甲氧基黄酮为底物催化合成甲基儿茶素EGCG-3”-Me:
取10.0g温州蜜柑,80℃条件下加入30mL 60%甲醇水溶液浸提4min,过滤后同样方法再重复一次。采用同样方法共提取30.0g温州蜜柑,合并所有提取液后置于旋转蒸发仪中旋蒸至完全干燥,加入纯水溶解后置于-20℃条件下冷冻24小时,随后转入冻干机中冷冻干燥,得到温州蜜柑多甲氧基黄酮冻干粉。按照料液比1:150进行溶解保存在-20℃,即温州蜜柑多甲氧基黄酮水溶液(川陈皮素的浓度为0.24mg/mL,橘皮素的浓度为0.02mg/mL,陈皮甙的浓度为1.47mg/mL),备用。
取1mL茶树EGCG-O-甲基转移酶粗酶液(制备方法同实施例1)加入15mL温州蜜柑多甲氧基黄酮反应液中(即:2mmol/L MgCl2、2mmol/L二硫苏糖醇、0.3mmol/L EGCG溶解于15mL温州蜜柑多甲氧基黄酮水溶液),35℃条件下,反应1小时,加入0.2mL 1.0mol/L盐酸终止反应,加入25mL乙酸乙酯萃取离心,取上部乙酸乙酯层置旋转蒸发仪中旋蒸至全干,加入1.0mL纯甲醇复溶,HPLC检测EGCG-3”-Me生成量为11.09μg/mL。
实施例8
茶树EGCG-O-甲基转移酶以EGCG和椪柑多甲氧基黄酮为底物催化合成甲基儿茶素EGCG-3”-Me:
取10.0g椪柑,80℃条件下加入30mL 60%甲醇水溶液浸提4min,过滤后同样方法再重复一次。采用同样方法共提取30.0g椪柑,合并所有提取液后置于旋转蒸发仪中旋蒸至完全干燥,加入纯水溶解后置于-20℃条件下冷冻24小时,随后转入冻干机中冷冻干燥,得到椪柑多甲氧基黄酮冻干粉。按照料液比1:150进行溶解保存在-20℃,即椪柑多甲氧基黄酮水溶液(川陈皮素的浓度为0.28mg/mL,橘皮素的浓度为0.45mg/mL,陈皮甙的浓度为1.51mg/mL),备用。
取1mL茶树EGCG-O-甲基转移酶粗酶液(制备方法同实施例1)加入15mL椪柑多甲氧基黄酮反应液中(即:2mmol/L MgCl2、2mmol/L二硫苏糖醇、0.3mmol/L EGCG溶解于15mL椪柑多甲氧基黄酮水溶液),35℃条件下,反应1小时,加入0.2mL 1.0mol/L盐酸终止反应,加入25mL乙酸乙酯萃取离心,取上部乙酸乙酯层置旋转蒸发仪中旋蒸至全干,加入1.0mL纯甲醇复溶,HPLC检测EGCG-3”-Me生成量为10.32μg/mL。
实施例9
茶树EGCG-O-甲基转移酶以EGCG和无核蜜桔多甲氧基黄酮为底物催化合成甲基儿茶素EGCG-3”-Me:
取10.0g无核蜜桔,80℃条件下加入30mL 60%甲醇水溶液浸提4min,过滤后同样方法再重复一次。采用同样方法共提取30.0g无核蜜桔,合并所有提取液后置于旋转蒸发仪中旋蒸至完全干燥,加入纯水溶解后置于-20℃条件下冷冻24小时,随后转入冻干机中冷冻干燥,得到无核蜜桔多甲氧基黄酮冻干粉。按照料液比1:150进行溶解保存在-20℃,即无核蜜桔多甲氧基黄酮水溶液(川陈皮素的浓度为0.001mg/mL,橘皮素的浓度为0.03mg/mL,陈皮甙的浓度为1.54mg/mL),备用。
取1mL茶树EGCG-O-甲基转移酶粗酶液(制备方法同实施例1)加入15mL无核蜜桔多甲氧基黄酮反应液中(即:2mmol/L MgCl2、2mmol/L二硫苏糖醇、0.3mmol/L EGCG溶解于15mL无核蜜桔多甲氧基黄酮水溶液),35℃条件下,反应1小时,加入0.2mL 1.0mol/L盐酸终止反应,加入25mL乙酸乙酯萃取离心,取上部乙酸乙酯层置旋转蒸发仪中旋蒸至全干,加入1.0mL纯甲醇复溶,HPLC检测EGCG-3”-Me生成量为10.21μg/mL。
实施例10
茶树EGCG-O-甲基转移酶以EGCG和沙田柚多甲氧基黄酮为底物催化合成甲基儿茶素EGCG-3”-Me:
取10.0g沙田柚,80℃条件下加入30mL 60%甲醇水溶液浸提4min,过滤后同样方法再重复一次。采用同样方法共提取30.0g沙田柚,合并所有提取液后置于旋转蒸发仪中旋蒸至完全干燥,加入纯水溶解后置于-20℃条件下冷冻24小时,随后转入冻干机中冷冻干燥,得到沙田柚多甲氧基黄酮干粉。按照料液比1:150进行溶解保存在-20℃,即沙田柚多甲氧基黄酮水溶液(川陈皮素的浓度为0.03mg/mL,橘皮素的浓度为0.02mg/mL,陈皮甙的浓度为0.07mg/mL),备用。
取1mL茶树EGCG-O-甲基转移酶粗酶液(制备方法同实施例1)加入15mL沙田柚多甲氧基黄酮反应液中(即:2mmol/L MgCl2、2mmol/L二硫苏糖醇、0.3mmol/L EGCG溶解于15mL沙田柚多甲氧基黄酮水溶液),35℃条件下,反应1小时,加入0.2mL 1.0mol/L盐酸终止反应,加入25mL乙酸乙酯萃取离心,取上部乙酸乙酯层置旋转蒸发仪中旋蒸至全干,加入1.0mL纯甲醇复溶,HPLC检测EGCG-3”-Me生成量为2.08μg/mL。
实施例11
茶树EGCG-O-甲基转移酶以EGCG和砂糖橘多甲氧基黄酮为底物催化合成甲基儿茶素EGCG-3”-Me:
取10.0g砂糖橘,80℃条件下加入30mL 60%甲醇水溶液浸提4min,过滤后同样方法再重复一次。采用同样方法共提取30.0g砂糖橘,合并所有提取液后置于旋转蒸发仪中旋蒸至完全干燥,加入纯水溶解后置于-20℃条件下冷冻24小时,随后转入冻干机中冷冻干燥,得到砂糖橘多甲氧基黄酮冻干粉。按照料液比1:150进行溶解保存在-20℃,即砂糖橘多甲氧基黄酮水溶液(川陈皮素的浓度为0.04mg/mL,橘皮素的浓度为0.14mg/mL,陈皮甙的浓度为1.12mg/mL),备用。
取1mL茶树EGCG-O-甲基转移酶粗酶液(制备方法同实施例1)加入15mL砂糖橘多甲氧基黄酮反应液中(即:2mmol/L MgCl2、2mmol/L二硫苏糖醇、0.3mmol/L EGCG溶解于15mL砂糖橘多甲氧基黄酮水溶液),35℃条件下,反应1小时,加入0.2mL 1.0mol/L盐酸终止反应,加入25mL乙酸乙酯萃取离心,取上部乙酸乙酯层置旋转蒸发仪中旋蒸至全干,加入1.0mL纯甲醇复溶,HPLC检测EGCG-3”-Me生成量为8.06μg/mL。
实施例12
茶树EGCG-O-甲基转移酶以EGCG和沃柑多甲氧基黄酮为底物催化合成甲基儿茶素EGCG-3”-Me:
取10.0g沃柑,80℃条件下加入30mL 60%甲醇水溶液浸提4min,过滤后同样方法再重复一次。采用同样方法共提取30.0g沃柑,合并所有提取液后置于旋转蒸发仪中旋蒸至完全干燥,加入纯水溶解后置于-20℃条件下冷冻24小时,随后转入冻干机中冷冻干燥,得到沃柑多甲氧基黄酮冻干粉。按照料液比1:150进行溶解保存在-20℃,即沃柑多甲氧基黄酮水溶液(川陈皮素的浓度为0.05mg/mL,橘皮素的浓度为0.04mg/mL,陈皮甙的浓度为1.47mg/mL),备用。
取1mL茶树EGCG-O-甲基转移酶粗酶液(制备方法同实施例1)加入15mL沃柑多甲氧基黄酮反应液中(即:2mmol/L MgCl2、2mmol/L二硫苏糖醇、0.3mmol/L EGCG溶解于15mL沃柑多甲氧基黄酮水溶液),35℃条件下,反应1小时,加入0.2mL 1.0mol/L盐酸终止反应,加入25mL乙酸乙酯萃取离心,取上部乙酸乙酯层置旋转蒸发仪中旋蒸至全干,加入1.0mL纯甲醇复溶,HPLC检测EGCG-3”-Me生成量为11.23μg/mL。
实施例13
茶树EGCG-O-甲基转移酶以EGCG和茂谷柑多甲氧基黄酮为底物催化合成甲基儿茶素EGCG-3”-Me:
取10.0g茂谷柑,80℃条件下加入30mL 60%甲醇水溶液浸提4min,过滤后同样方法再重复一次。采用同样方法共提取30.0g茂谷柑,合并所有提取液后置于旋转蒸发仪中旋蒸至完全干燥,加入纯水溶解后置于-20℃条件下冷冻24小时,随后转入冻干机中冷冻干燥,得到茂谷柑多甲氧基黄酮冻干粉。按照料液比1:150进行溶解保存在-20℃,即茂谷柑多甲氧基黄酮水溶液(川陈皮素的浓度为0.06mg/mL,橘皮素的浓度为0.16mg/mL,陈皮甙的浓度为1.56mg/mL),备用。
取1mL茶树EGCG-O-甲基转移酶粗酶液(制备方法同实施例1)加入15mL茂谷柑多甲氧基黄酮反应液中(即:2mmol/L MgCl2、2mmol/L二硫苏糖醇、0.3mmol/L EGCG溶解于15mL茂谷柑多甲氧基黄酮水溶液),35℃条件下,反应1小时,加入0.2mL 1.0mol/L盐酸终止反应,加入25mL乙酸乙酯萃取离心,取上部乙酸乙酯层置旋转蒸发仪中旋蒸至全干,加入1.0mL纯甲醇复溶,HPLC检测EGCG-3”-Me生成量为12.46μg/mL。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种制备EGCG-3”-Me的方法,其特征在于,包括以下步骤:
1)将茶树EGCG-O-甲基转移酶酶液与底物溶液混合,得到反应液;
所述底物溶液中含有多甲氧基黄酮、表没食子儿茶素没食子酸酯、氯化镁和二硫苏糖醇;所述底物溶液中表没食子儿茶素没食子酸酯的浓度为0.3mmol/L,氯化镁的浓度为2mmol/L,二硫苏糖醇的浓度为2mmol/L;
所述多甲氧基黄酮包括陈皮甙、橘皮素和川陈皮素中的一种或几种;
所述茶树EGCG-O-甲基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示;
所述茶树EGCG-O-甲基转移酶酶液的浓度为1mg/mL;
所述茶树EGCG-O-甲基转移酶酶液与底物溶液的体积比为1:15;
2)将所述步骤1)得到的反应液在35℃条件下反应1h,得到EGCG-3”-Me。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,当所述多甲氧基黄酮为陈皮甙时,所述底物溶液中陈皮甙的浓度为0.4mmol/L。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,当所述多甲氧基黄酮为橘皮素时,所述底物溶液中橘皮素的浓度为0.4mmol/L。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,当所述多甲氧基黄酮为川陈皮素时,所述底物溶液中川陈皮素的浓度为0.4mmol/L。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述多甲氧基黄酮来源于茶枝柑、温州蜜柑、椪柑、沃柑或茂谷柑;
当所述多甲氧基黄酮来源于茶枝柑时,所述底物溶液中川陈皮素的浓度为0.12mg/mL,橘皮素的浓度为0.16mg/mL,陈皮甙的浓度为1.40mg/mL;
当所述多甲氧基黄酮来源于温州蜜柑时,所述底物溶液中川陈皮素的浓度为0.24mg/mL,橘皮素的浓度为0.02mg/mL,陈皮甙的浓度为1.47mg/mL;
当所述多甲氧基黄酮来源于椪柑时,所述底物溶液中川陈皮素的浓度为0.28mg/mL,橘皮素的浓度为0.45mg/mL,陈皮甙的浓度为1.51mg/mL;
当所述多甲氧基黄酮来源于沃柑时,所述底物溶液中川陈皮素的浓度为0.05mg/mL,橘皮素的浓度为0.04mg/mL,陈皮甙的浓度为1.47mg/mL;
当所述多甲氧基黄酮来源于茂谷柑时,所述底物溶液中川陈皮素的浓度为0.06mg/mL,橘皮素的浓度为0.16mg/mL,陈皮甙的浓度为1.56mg/mL。
6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,当所述多甲氧基黄酮来源于柠檬时,所述底物溶液中川陈皮素的浓度为0.02mg/mL,橘皮素的浓度为0.03mg/mL,陈皮甙的浓度为1.14mg/mL。
7.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,当所述多甲氧基黄酮来源于甜橙时,所述底物溶液中川陈皮素的浓度为0.06mg/mL,橘皮素的浓度为0.02mg/mL,陈皮甙的浓度为1.50mg/mL。
8.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,当所述多甲氧基黄酮来源于无核蜜桔时,所述底物溶液中川陈皮素的浓度为0.001mg/mL,橘皮素的浓度为0.03mg/mL,陈皮甙的浓度为1.54mg/mL。
9.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,当所述多甲氧基黄酮来源于沙田柚时,所述底物溶液中川陈皮素的浓度为0.03mg/mL,橘皮素的浓度为0.02mg/mL,陈皮甙的浓度为0.07mg/mL。
10.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,当所述多甲氧基黄酮来源于砂糖橘时,所述底物溶液中川陈皮素的浓度为0.04mg/mL,橘皮素的浓度为0.14mg/mL,陈皮甙的浓度为1.12mg/mL。
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Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101061222A (zh) * | 2004-11-17 | 2007-10-24 | 独立行政法人农业·食品产业技术综合研究机构 | 编码甲基化儿茶素生物合成酶的基因 |
JP2013155174A (ja) * | 2012-01-31 | 2013-08-15 | Amorepacific Corp | タンゲレチン及びegcgを含有する皮膚外用剤組成物 |
US20170156361A1 (en) * | 2014-06-27 | 2017-06-08 | Kyushu University, National University Corporation | Catechin function enhancement method |
CN109321543A (zh) * | 2018-11-02 | 2019-02-12 | 浙江大学 | 参与柑橘果皮黄酮合成的氧甲基转移酶及其编码基因与应用 |
-
2022
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Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101061222A (zh) * | 2004-11-17 | 2007-10-24 | 独立行政法人农业·食品产业技术综合研究机构 | 编码甲基化儿茶素生物合成酶的基因 |
JP2013155174A (ja) * | 2012-01-31 | 2013-08-15 | Amorepacific Corp | タンゲレチン及びegcgを含有する皮膚外用剤組成物 |
US20170156361A1 (en) * | 2014-06-27 | 2017-06-08 | Kyushu University, National University Corporation | Catechin function enhancement method |
CN109321543A (zh) * | 2018-11-02 | 2019-02-12 | 浙江大学 | 参与柑橘果皮黄酮合成的氧甲基转移酶及其编码基因与应用 |
Non-Patent Citations (6)
Title |
---|
LI, Y. 等: "catechol-O-methyltransferase [Camellia sinensis]", GENBANK, pages 51164 * |
YUE ZHANG 等: "Cloning of a caffeoyl-coenzyme A O-methyltransferase from Camellia sinensis and analysis of its catalytic activity", JOURNAL OF ZHEJIANG UNIVERSITY-SCIENCE B (BIOMEDICINE & BIOTECHNOLOGY), vol. 16, no. 2, pages 103 - 112 * |
吕海鹏 等: "EGCG-O-甲基转移酶(EOMT)催化EGCG形成的EGCG甲基化衍生物分析", 茶叶科学, no. 2, pages 100 - 106 * |
吕海鹏 等: "EGCG甲基化衍生物酶促合成的反应条件研究", 茶叶科学, no. 5, pages 441 - 447 * |
吕海鹏;张悦;费冬梅;林智;: "茶树EGCG-O-甲基转移酶的纯化及酶学性质", 食品科学, no. 09, pages 194 - 197 * |
王彤 等: "多甲氧基黄酮在不同宽皮柑橘品种组织中的积累变化规律", 浙江大学学报(农业与生命科学版), no. 6, pages 729 - 735 * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN115961086A (zh) * | 2023-01-17 | 2023-04-14 | 华中农业大学 | 一种茶树类黄酮3-o-甲基转移酶基因及应用 |
CN115961086B (zh) * | 2023-01-17 | 2023-07-14 | 华中农业大学 | 一种茶树类黄酮3-o-甲基转移酶基因及应用 |
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