CN103897993B - 一种酿酒酵母基因工程菌株以及此菌株的构建方法和生产圣草酚或五羟黄酮的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种酿酒酵母基因工程菌株以及此菌株的构建方法和生产圣草酚或五羟黄酮的方法，所公开的菌株携带有CZyF3’5’H基因。本发明公开的菌株可以用于高效表达CZyF3’5’H类黄酮-3’，5’-羟基化酶用来生产圣草酚或五羟黄酮。
Description
技术领域
本发明涉及利用一种携带有能够表达类黄酮-3’，5’-羟基化酶的重组基因的酿酒酵母基因工程菌株以及利用此菌株高效生产环多羟基类黄酮的方法，属于生物工程技术领域。
背景技术
5，7，3’，4’，5’-五羟黄酮，又名槲黄素或洋蔥素，是已知的几百种生物类黄酮中抗氧化效果最强的，其抗氧化力是维生素E的50倍，是维生素C的20倍，并且其分子结构小，水溶性好，容易被人体吸收。并且能够保护血管内壁免受到破坏，及对于心脏及血管健康有很大的帮助。
圣草酚(Eriodictyo1)，又名北美圣草酚、毛纲草酚，为黄酮类物质。与五羟黄酮类似也具有较强的抗氧化性，同时具有较强的抗辐射、降血脂、降血糖功效，常用作饮料食品和酒类的抗氧化剂。并且是植物生长调节剂、功能性食品、化妆品和未来药物原料。
针对苯丙烷代谢途径上游产物，市场上已有成熟的代谢菌株可高效生产柚皮素(Naringenin)产物，现Sigma官网市场报价为484元人民币每1g(纯度为98％)。而圣草酚现在的Sigma官网市场报价为907元人民币每1mg(纯度为99％)，价格较高，而五羟黄酮现在在市场上几乎没有销售。
目前，提取五羟黄酮、圣草酚的方法主要是从柠檬或花生壳(姚丽，花生壳中5，7一二羟基色原酮及圣草酚的HPLC测定，食品科学；杜方岭，同时检测花生壳中5，7-二羟基色原酮、圣草酚和木犀草素的方法等)中进行天然提取，这些方法成本较高、易造成有机试剂和重金属污染，并且无法获得高纯度的茶多酚，难以获得较高纯度和理想的产率。
发明内容
针对现有技术的缺陷，本发明公开了一种酿酒酵母基因工程菌株，该菌株携带有类黄酮-3’，5’-羟基化酶的表达基因，能够用于高效表达CZyF3’5’H，从而可以用来生产圣草酚和五羟黄酮。
为实现上述目的，本发明是通过下述技术方案实现的：
一种酿酒酵母基因工程菌株，该菌株的生物学特征为携带有CZyF3’5’H基因，该基因序列如序列表1所示。
上述菌株是通过下述方法构建的：
(1)根据目的基因的DNA序列设计引物，以含有目的基因的质粒为模板进行PCR方法扩增，得到目的基因，DNA序列如序列表1所示；
(2)将目的基因与pENTRTM/TEV/D-TOPO质粒连接得到连接反应物；
(3)将连接反应物转化宿主菌E.coliDH5α感受态细胞，涂布LB平板(kan+)，挑选阳性克隆，将测序正确的菌株进行培养，提取质粒；
(4)将提取的质粒进行LR交换，将目的基因连接到pYES-dest52质粒上得到连接反应物；
(5)将连接反应物转化宿主菌E.coliDH5α感受态细胞，涂布LB平板(Amp+)，挑选阳性克隆并在LB培养基中培养，提取质粒，得到带有目的基因的LR交换后的质粒。
(6)将步骤(5)获得的质粒转入到宿主菌细胞，涂布Ura缺陷型SD平板，挑选阳性菌落，即获得带有目的基因的基因工程菌。
在上述构建方法中，CZyF3’5’H基因是由以上游引物VvF3’5’H-pENTR-F和下游引物CZF3’5’H-R为扩增引物，以VvF3’5’H基因的质粒为模板进行PCR扩增得到重组CZF3’5’H基因DNA，然后与yF3’5’H基因的DNA为共同模板，以上游引物VvF3’5’H-pENTR-F和下游引物yF3’5’H-R为扩增引物进行重叠PCR扩增得到CZyF3’5’H基因DNA。
在上述构建方法中，步骤(1)中PCR产物的纯化回收可以采用PCR产物回收试剂盒或其它分子克隆中常用的纯化方法。
在上述构建方法中，步骤(2)质粒还可以为带有CZyF3’5’H基因的pENTRTM/TEV/D-TOPO质粒或pENTRTM/TEV/D-TOPO质粒的衍生物。
在上述构建方法中，步骤(3)中质粒的纯化提取可以采用分子生物实验手册中记载的任意高纯度质粒提取试剂盒的提取方法。
在上述构建方法中，步骤(5)宿主为氨苄青霉素菌，步骤(6)宿主为酿酒酵母菌株WAT11。
在上述构建方法中，步骤(5)质粒还可以为带有CZyF3’5’H基因的pYES-dest52质粒或pYES-dest52质粒的衍生物。
由于本发明构建的菌株可以用于高效表达类黄酮-3’，5’-羟化酶，因此本发明还公开了利用构建的含有CZyF3’5’H基因的工程菌株生产圣草酚或五羟黄酮的方法，包括如下步骤：
(1)将所述菌株接入活化Ura缺陷型SD培养基中培养20～36小时，得到活化的含有CZyF3’5’H基因的酿酒酵母基因工程菌株的菌液；
(2)收集(1)活化的菌体，接入到Ura缺陷型SD诱导培养集中培养，得到诱导的含有CZyF3’5’H基因的酿酒酵母基因工程菌株菌液；
(3)将底物柚皮素加入到(2)中诱导后的菌液中培养，得到含有产物圣草酚及五羟黄酮的菌液。
其中，培养基和柚皮素都可以在市场上购买。
与传统方法相比，本发明的优点和有益效果为：
(1)本发明所得CZyF3’5’H基因工程菌株酶活表达水平高；
(2)本发明方法生产的圣草酚及五羟黄酮质量高，适于工业化的生产。
附图说明
图1为所得菌株WAT11-CZyF3’5’H菌落阳性克隆验证电泳图；
图2为以柚皮素为底物的酶活HPLC检测，其中N柚皮素；E圣草酚；P五羟黄酮；
图3为以柚皮素为底物的酶活动力学检测；
图4为以柚皮素为底物时的产物圣草酚的LC-MS检测；
图5为以柚皮素为底物时的产物五羟黄酮的LC-MS检测。
具体实施步骤
本发明通过在酿酒酵母体内引入外源基因-类黄酮-3’，5’-羟化酶使其能够表达活性。
酿酒酵母作为异源微生物的一种，遗传操作背景清楚，生长速度较快，培养条件温和，是进行发酵生产的首选菌株之一，在下述实施例中，选用的酿酒酵母菌株为WAT11，可从市场上买到，选取其表达质粒pYES-dest52。
实施例1
以上游引物VvF3’5’H-pENTR-F
(序列：CACCATGGCCATAGATACAAGCCTCTTGC)和下游引物CZF3’5’H-R
(序列：AGCTAGAGCAACATGTGGCATGTTACCTAGAAGAGGAAGAGCGCCG)为扩增引物，并以VvF3’5’H基因的质粒为模板进行PCR扩增可得到重组CZF3’5’H的基因的DNA，与yF3’5’H基因的DNA为共同模板，以上游引物VvF3’5’H-pENTR-F(序列：CACCATGGCCATAGATACAAGCCTCTTGC)和下游引物yF3’5’H-R(AGCAGCATAAGCATTTGGAGGCAATC)为扩增引物进行重叠PCR扩增可得到CZyF3’5’H基因，并将其克隆于pENTRTM/TEV/D-TOPO载体上得到连接反应物。
将上述连接反应物转入E.coliDH5α宿主细胞中，利用卡那霉素筛选获得成功的转化子，并提取其质粒，为入门载体。
将入门载体与pYES-dest52进行LR交换，并转入E.coliDH5α宿主细胞中，利用氨苄青霉素筛选获得成功地转化子，并提取其质粒。
将上述质粒转入WAT11，利用Ura缺陷型SD培养基获得成功的转化菌株，命名为WAT11-CZyF3’5’H。
上述实验过程优选的实验参数如下：
目的基因与pENTRTM/TEV/D-TOPO质粒连接时，25℃反应1h得到连接反应物；
提取的质粒进行LR交换时，目的基因连接到pYES-dest52质粒上，25℃反应过夜，得到连接反应物；
连接反应物转化宿主菌E.coliDH5α感受态细胞，涂布LB平板(Amp+)挑选阳性克隆时在LB培养基中37℃过夜培养然后提取质粒。
实施例2
将菌株接种于20ml的Ura缺陷型SD培养基中，28℃，200rpm过夜培养，至OD600＝0.5。
Ura缺陷型SD培养基：称取SD0.7g，YNB3.4g，Glucose10g，Trp0.05g，Ade0.05g，His0.05g，Leu0.05g，加水补至500mL，高压蒸汽115℃灭菌15min即可，固体培养基则需加入1.5％-1.8％的琼脂粉。
将得到的菌体用Ura缺陷型SD诱导培养基清洗，并于20ml的Ura缺陷型SD诱导培养基中，28℃，200rpm诱导5h，初始OD600＝0.5。其中，Ura缺陷型SD诱导培养基组成为：8g粉状培养基(泛基诺目录号：YGM0003A)加入950ml水，高压蒸汽115℃灭菌15min后加入50ml40％过滤除菌的无菌半乳糖即可。
将反应底物柚皮素(Naringenin)加入到上述诱导过的培养基中，继续培养10h。
上述过程较优的的参数范围为：
CZyF3’5’H基因工程菌接入活化培养基中，在28～30℃、摇床转速为150～220转/min的条件下培养20～36小时，得到活化的CZyF3’5’H基因工程菌的菌液；
活化的菌体，接入到诱导培养集中，在28～30℃、摇床转速为150～220转/min的条件下培养5小时，得到诱导CZyF3’5’H基因工程菌的菌液；
底物柚皮素加入到诱导后的菌液中，在28～30℃、摇床转速为150～220转/min的条件下培养10小时，得到含有产物圣草酚及五羟黄酮的菌液。
实施例3
将上述最终诱导培养后的菌液20mL，用超声破碎10min，12000g离心10min，取上清，用3倍体积的乙酸乙酯萃取，得到的的上清液经旋转蒸发仪干燥后用100ul的色谱甲醇定容，再将得到提取液经0.22um孔径有机相滤膜过滤，待HPLC检测。同时以诱导的空载菌株WAT11为对照组。
HPLC条件为5min内B相从10％到15％，5～15minB相从15％到40％，15～20minB相从40％到60％；20～22minB相从60％到10％流速1.0mL·min-1；其中A相为1％的乙酸，B相为乙腈(色谱级)。黄酮醇类检测波长280nm。柚皮素出峰时间为23.64min，圣草酚出峰时间为21.75min，五羟黄酮的出峰时间为20.21min，由此建立了不同黄酮醇的HPLC检测方法。
Claims (5)
1.一种酿酒酵母基因工程菌株，所述菌株携带有CZyF3’5’H基因，该基因序列如序列表1所示。
2.一种构建权利要求1所述酿酒酵母基因工程菌株的方法，其特征在于包括下述步骤：
(1)根据目的基因的DNA序列设计引物，以含有目的基因的质粒为模板进行PCR方法扩增，得到目的基因，其中目的基因序列如序列表1所示；
(2)将目的基因与pENTRTM/TEV/D-TOPO质粒连接，得到连接反应物；
(3)将连接反应物转化宿主菌E.coliDH5α感受态细胞，涂布LB平板，挑选阳性克隆，将测序正确的菌株进行培养，提取质粒；
(4)将提取的质粒进行LR交换，将目的基因连接到pYES-dest52质粒上，得到连接反应物；
(5)将连接反应物转化宿主菌E.coliDH5α感受态细胞，涂布LB平板，挑选阳性克隆，并在LB培养基中培养然后提取质粒，得到带有目的基因的LR交换后的质粒；
(6)将步骤(5)获得的质粒转入到宿主菌细胞，涂布Ura缺陷型SD平板，挑选阳性菌落，即获得带有目的基因的基因工程菌。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤(3)中宿主为卡那霉素菌；步骤(5)中宿主为氨苄青霉素菌；步骤(6)中宿主为酿酒酵母菌。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于步骤(5)中质粒为带有CZyF3’5’H基因的pYES-dest52质粒或pYES-dest52质粒的衍生物。
5.一种利用权利要求1的酿酒酵母基因工程菌株生产圣草酚及五羟黄酮的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)将酿酒酵母基因工程菌株接入到Ura缺陷型SD培养基，培养得到活化的基因工程菌液；
(2)收集步骤(1)活化的菌体，接入到Ura缺陷型SD诱导培养基中，培养得到诱导的基因工程菌株的菌液；
(3)将底物柚皮素加入到步骤(2)中诱导后的菌液中，培养得到含有产物圣草酚及五羟黄酮的菌液。
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