CN114990169B - 一种制备EGCG-3”-Me的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种制备EGCG‑3”‑Me的方法，属于物质制备技术领域，包括将茶树EGCG‑O‑甲基转移酶酶液与底物溶液混合，得到反应液；所述底物溶液中含有多甲氧基黄酮、表没食子儿茶素没食子酸酯；多甲氧基黄酮包括陈皮甙、橘皮素和川陈皮素；将得到的反应液在35℃条件下反应1h，得到EGCG‑3”‑Me。采用本发明的方法产率高，适合大规模生产。

Description

一种制备EGCG-3”-Me的方法
技术领域
本发明属于物质制备技术领域，尤其涉及一种制备EGCG-3”-Me的方法。
背景技术
茶叶是全球公认的健康饮料。近年来有研究表明，茶叶中的甲基化儿茶素类成分，尤其是表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)的甲基化衍生物，尤其是(-)-表没食子儿茶素3-O(3-O-甲基)没食子酸酯(EGCG-3”-Me)具有显著的抗过敏功效，特别是对预防和抑制花粉导致的过敏症状尤为显著。因此，EGCG-3”-Me的抗过敏功能是近年来茶叶生物活性功能的研究热点。
富含EGCG-3”-Me的产品受到了消费者的广泛欢迎，目前已初具市场规模。在食品和生物医药领域对EGCG-3”-Me的需求量也日渐增加，所以，EGCG-3”-Me合成的研究具有十分重要的意义。
已有的研究结果表明，除少数茶树资源中含有相对较高的EGCG-3”-Me，其他茶树品种中EGCG-3”-Me含量极低。EGCG-3”-Me已有的合成方法主要包括化学合成法和生物酶法。化学合成法中反应条件苛刻，副产物多且分离提纯难度较大，同时大量有机溶剂和基团保护剂的使用，使得该方法合成的EGCG-3”-Me很难应用于食品领域。体外酶法合成具有酶促合成反应共有的特点，反应条件温和相对较为安全、专一性强且产物单纯，在反应液中EGCG-3”-Me分离简便。但是目前已有的体外酶法合成研究结果表明，实验室条件下，体外表达的茶树EGCG-O-甲基转移酶合成EGCG-3”-Me实验中EGCG转化率较低，底物损失大，产率低，成本高，并不适合用于EGCG-3”-Me的大量生产。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种制备EGCG-3”-Me的方法，采用本发明的方法产率高，适合大规模生产。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种制备EGCG-3”-Me的方法，包括以下步骤：
1)将茶树EGCG-O-甲基转移酶酶液与底物溶液混合，得到反应液；
所述底物溶液中含有多甲氧基黄酮、表没食子儿茶素没食子酸酯、氯化镁和二硫苏糖醇；所述底物溶液中表没食子儿茶素没食子酸酯的浓度为0.3mmol/L，氯化镁的浓度为2mmol/L，二硫苏糖醇的浓度为2mmol/L；
所述多甲氧基黄酮包括陈皮甙、橘皮素和川陈皮素中的一种或几种；
所述茶树EGCG-O-甲基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；
所述茶树EGCG-O-甲基转移酶酶液的浓度为1mg/mL；
所述茶树EGCG-O-甲基转移酶酶液与底物溶液的体积比为1:15；
2)将所述步骤1)得到的反应液在35℃条件下反应1h，得到EGCG-3”-Me。
优选的，当所述多甲氧基黄酮为陈皮甙时，所述底物溶液中陈皮甙的浓度为0.4mmol/L。
优选的，当所述多甲氧基黄酮为橘皮素时，所述底物溶液中橘皮素的浓度为0.4mmol/L。
优选的，当所述多甲氧基黄酮为川陈皮素时，所述底物溶液中川陈皮素的浓度为0.4mmol/L。
优选的，所述多甲氧基黄酮来源于茶枝柑、温州蜜柑、椪柑、沃柑或茂谷柑；
当所述多甲氧基黄酮来源于茶枝柑时，所述底物溶液中川陈皮素的浓度为0.12mg/mL，橘皮素的浓度为0.16mg/mL，陈皮甙的浓度为1.40mg/mL；
当所述多甲氧基黄酮来源于温州蜜柑时，所述底物溶液中川陈皮素的浓度为0.24mg/mL，橘皮素的浓度为0.02mg/mL，陈皮甙的浓度为1.47mg/mL；
当所述多甲氧基黄酮来源于椪柑时，所述底物溶液中川陈皮素的浓度为0.28mg/mL，橘皮素的浓度为0.45mg/mL，陈皮甙的浓度为1.51mg/mL；
当所述多甲氧基黄酮来源于沃柑时，所述底物溶液中川陈皮素的浓度为0.05mg/mL，橘皮素的浓度为0.04mg/mL，陈皮甙的浓度为1.47mg/mL；
当所述多甲氧基黄酮来源于茂谷柑时，所述底物溶液中川陈皮素的浓度为0.06mg/mL，橘皮素的浓度为0.16mg/mL，陈皮甙的浓度为1.56mg/mL。
优选的，当所述多甲氧基黄酮来源于柠檬时，所述底物溶液中川陈皮素的浓度为0.02mg/mL，橘皮素的浓度为0.03mg/mL，陈皮甙的浓度为1.14mg/mL。
优选的，当所述多甲氧基黄酮来源于甜橙时，所述底物溶液中川陈皮素的浓度为0.06mg/mL，橘皮素的浓度为0.02mg/mL，陈皮甙的浓度为1.50mg/mL。
优选的，当所述多甲氧基黄酮来源于无核蜜桔时，所述底物溶液中川陈皮素的浓度为0.01mg/mL，橘皮素的浓度为0.03mg/mL，陈皮甙的浓度为1.54mg/mL。
优选的，当所述多甲氧基黄酮来源于沙田柚时，所述底物溶液中川陈皮素的浓度为0.03mg/mL，橘皮素的浓度为0.02mg/mL，陈皮甙的浓度为0.07mg/mL。
优选的，当所述多甲氧基黄酮来源于砂糖橘时，所述底物溶液中川陈皮素的浓度为0.04mg/mL，橘皮素的浓度为0.14mg/mL，陈皮甙的浓度为1.12mg/mL。
本发明制备EGCG-3”-Me的机理为：
在一定条件下，茶树EGCG-O-甲基转移酶以EGCG和多甲氧基黄酮为底物，催化合成EGCG-3”-Me。
附图说明
图1为陈皮甙反应结果HPLC图；
图2为橘皮素反应结果HPLC图；
图3为川陈皮素反应结果HPLC图；
图4为柑橘果实多甲氧基黄酮反应结果HPLC图。
具体实施方式
本发明提供了一种制备EGCG-3”-Me的方法，包括以下步骤：
1)将茶树EGCG-O-甲基转移酶酶液与底物溶液混合，得到反应液；
所述底物溶液中含有多甲氧基黄酮、表没食子儿茶素没食子酸酯、氯化镁和二硫苏糖醇；所述底物溶液中表没食子儿茶素没食子酸酯的浓度为0.3mmol/L，氯化镁的浓度为2mmol/L，二硫苏糖醇的浓度为2mmol/L；
所述多甲氧基黄酮包括陈皮甙、橘皮素和川陈皮素中的一种或几种；
所述茶树EGCG-O-甲基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；
所述茶树EGCG-O-甲基转移酶酶液的浓度为1mg/mL；
所述茶树EGCG-O-甲基转移酶酶液与底物溶液的体积比为1:15；
2)将所述步骤1)得到的反应液在35℃条件下反应1h，得到EGCG-3”-Me。
在本发明中，所述EGCG-O-甲基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，具体如下：
MATNGEGEQNLRHQEVGHKSLLQSDALYQYILETSVYPREPEAMKELREVTAKHPWNIMTTSADEGQFLNMLLKLINAKNTMEIGVYTGYSLLATALALPDDGKILAMDINRDNFEIGLPIIEKAGVAHKIDFREGPALPALDKMIEDGKHHGSFDFIFVDADKDNYINYHKRLIDLVKVGGLIGYDNTLWNGSVVAPPDAPMRKYVRYYRDFVLELNKALAADPRIEICMLPVGDGITLCRRVC。
本发明对所述EGCG-O-甲基转移酶的制备方法没有特殊限定，本领域技术人员按照常规制备方法即可，在本发明具体实施方式中，采用咖啡酰辅酶AO-甲基转移酶基因(GenBank Accession No.DD361102)，通过大肠杆菌表达体系制备茶树EGCG-O-甲基转移酶。
本发明将得到的反应液在35℃条件下反应1h，得到EGCG-3”-Me。在本发明中，所述反应后还优选加入0.2mL 1.0mol/L盐酸终止反应，加入25mL乙酸乙酯萃取离心，取上部乙酸乙酯层置旋转蒸发仪中旋蒸至全干，得到EGCG-3”-Me。
在本发明中，当所述多甲氧基黄酮优选为陈皮甙时，所述底物溶液中陈皮甙的浓度优选为0.4mmol/L。在本发明中，当所述多甲氧基黄酮优选为橘皮素时，所述底物溶液中橘皮素的浓度优选为0.4mmol/L。在本发明中，当所述多甲氧基黄酮优选为川陈皮素时，所述底物溶液中川陈皮素的浓度优选为0.4mmol/L。
在本发明中，所述多甲氧基黄酮优选来源于茶枝柑、温州蜜柑、椪柑、沃柑或茂谷柑；当所述多甲氧基黄酮来源于茶枝柑时，所述底物溶液中川陈皮素的浓度优选为0.12mg/mL，橘皮素的浓度优选为0.16mg/mL，陈皮甙的浓度优选为1.40mg/mL；当所述多甲氧基黄酮优选来源于温州蜜柑时，所述底物溶液中川陈皮素的浓度优选为0.24mg/mL，橘皮素的浓度优选为0.02mg/mL，陈皮甙的浓度优选为1.47mg/mL；当所述多甲氧基黄酮来源于椪柑时，所述底物溶液中川陈皮素的浓度优选为0.28mg/mL，橘皮素的浓度优选为0.45mg/mL，陈皮甙的浓度优选为1.51mg/mL；当所述多甲氧基黄酮来源于沃柑时，所述底物溶液中川陈皮素的浓度优选为0.05mg/mL，橘皮素的浓度优选为0.04mg/mL，陈皮甙的浓度优选为1.47mg/mL；当所述多甲氧基黄酮来源于茂谷柑时，所述底物溶液中川陈皮素的浓度优选为0.06mg/mL，橘皮素的浓度优选为0.16mg/mL，陈皮甙的浓度优选为1.56mg/mL。
在本发明中，当所述多甲氧基黄酮优选来源于柠檬时，所述底物溶液中川陈皮素的浓度优选为0.02mg/mL，橘皮素的浓度优选为0.03mg/mL，陈皮甙的浓度优选为1.14mg/mL。
在本发明中，当所述多甲氧基黄酮来源于甜橙时，所述底物溶液中川陈皮素的浓度优选为0.06mg/mL，橘皮素的浓度优选为0.02mg/mL，陈皮甙的浓度优选为1.14mg/mL。
在本发明中，当所述多甲氧基黄酮来源于无核蜜桔时，所述底物溶液中川陈皮素的浓度优选为0.001mg/mL，橘皮素的浓度优选为0.03mg/mL，陈皮甙的浓度优选为1.54mg/mL。
在本发明中，当所述多甲氧基黄酮来源于沙田柚时，所述底物溶液中川陈皮素的浓度优选为0.03mg/mL，橘皮素的浓度优选为0.02mg/mL，陈皮甙的浓度优选为0.07mg/mL。
在本发明中，当所述多甲氧基黄酮来源于砂糖橘时，所述底物溶液中川陈皮素的浓度优选为0.04mg/mL，橘皮素的浓度优选为0.14mg/mL，陈皮甙的浓度优选为1.12mg/mL。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
茶树EGCG-O-甲基转移酶以EGCG和川陈皮素为底物催化合成甲基儿茶素EGCG-3”-Me：
选用咖啡酰辅酶A O-甲基转移酶基因(GenBank Accession No.DD361102)，通过大肠杆菌表达体系制备茶树EGCG-O-甲基转移酶粗酶液，制备的茶树EGCG-O-甲基转移酶蛋白序列为：
MATNGEGEQNLRHQEVGHKSLLQSDALYQYILETSVYPREPEAMKELREVTAKHPWNIMTTSADEGQFLNMLLKLINAKNTMEIGVYTGYSLLATALALPDDGKILAMDINRDNFEIGLPIIEKAGVAHKIDFREGPALPALDKMIEDGKHHGSFDFIFVDADKDNYINYHKRLIDLVKVGGLIGYDNTLWNGSVVAPPDAPMRKYVRYYRDFVLELNKALAADPRIEICMLPVGDGITLCRRVC
大肠杆菌体系表达：将含基因片段的质粒转入大肠杆菌感受态细胞中后接种至LB固体培养基(含氨苄)培养过夜；挑一个转化后重组质粒的单菌落接种于LB液体培养基中(含氨苄)，于37℃过夜培养；取1-2mL过夜培养物，转接于100mL含氨苄的LB液体培养基中，于37℃，180rpm震荡培养1.5-2h至对数生长期；在培养物中加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.2-1.6mmol/L进行诱导表达，继续分别于37℃，180rpm震荡培养1.5-12h；离心，弃上清，并收集细胞；加入10V/W的蛋白破碎缓冲液(1x PBS)，与大肠杆菌细胞混匀后进行超声波破碎，每处理1s，间隔3s，频率为23％，破碎处理时以不发生气泡，不过热为准，以菌液变清晰为终止标准。
取1mL茶树EGCG-O-甲基转移酶粗酶液(浓度1mg/ml)加入15mL川陈皮素反应液中(即：2mmol/L MgCl2、2mmol/L二硫苏糖醇、0.4mmol/L川陈皮素、0.3mmol/L EGCG、100mmol/L Tri-HCl pH＝7.5)，35℃条件下，反应1小时，加入0.2mL 1.0mol/L盐酸终止反应，加入25mL乙酸乙酯萃取离心，取上部乙酸乙酯层置旋转蒸发仪中旋蒸至全干，加入1.0mL纯甲醇复溶，HPLC检测EGCG-3”-Me生成量为275.68μg/mL，EGCG转化率为89.21％。
实施例2
茶树EGCG-O-甲基转移酶以EGCG和橘皮素为底物催化合成甲基儿茶素EGCG-3”-Me：
取1mL茶树EGCG-O-甲基转移酶粗酶液(浓度1mg/ml)(制备方法同实施例1)加入15mL橘皮素反应液中(即：2mmol/L MgCl2、2mmol/L二硫苏糖醇、0.4mmol/L橘皮素、0.3mmol/L EGCG、100mmol/L Tri-HCl pH＝7.5)，35℃条件下，反应1小时，加入0.2mL1.0mol/L盐酸终止反应，加入25mL乙酸乙酯萃取离心，取上部乙酸乙酯层置旋转蒸发仪中旋蒸至全干，加入1.0mL纯甲醇复溶，HPLC检测EGCG-3”-Me生成量为278.34μg/mL，EGCG转化率为71.20％。
实施例3
茶树EGCG-O-甲基转移酶以EGCG和陈皮甙为底物催化合成甲基儿茶素EGCG-3”-Me：
取1mL茶树EGCG-O-甲基转移酶粗酶液(浓度1mg/ml)(制备方法同实施例1)加入15mL陈皮甙反应液中(即：2mmol/L MgCl2、2mmol/L二硫苏糖醇、0.4mmol/L陈皮甙、0.3mmol/L EGCG、100mmol/L Tri-HCl pH＝7.5)，35℃条件下，反应1小时，加入0.2mL1.0mol/L盐酸终止反应，加入25mL乙酸乙酯萃取离心，取上部乙酸乙酯层置旋转蒸发仪中旋蒸至全干，加入1.0mL纯甲醇复溶，HPLC检测EGCG-3”-Me生成量为305.14μg/mL EGCG转化率为97.15％。
实施例4
茶树EGCG-O-甲基转移酶以EGCG和茶枝柑多甲氧基黄酮为底物催化合成甲基儿茶素EGCG-3”-Me：
取10.0g茶枝柑，80℃条件下加入30mL 60％甲醇水溶液浸提4min，过滤后同样方法再重复一次。采用同样方法共提取30.0g茶枝柑，合并所有提取液后置于旋转蒸发仪中旋蒸至完全干燥，加入纯水溶解后置于-20℃条件下冷冻24小时，随后转入冻干机中冷冻干燥，得到茶枝柑多甲氧基黄酮冻干粉。按照料液比1:150进行溶解保存在-20℃，即茶枝柑多甲氧基黄酮水溶液(川陈皮素的浓度为0.12mg/mL，橘皮素的浓度为0.16mg/mL，陈皮甙的浓度为1.40mg/mL)，备用。
取1mL茶树EGCG-O-甲基转移酶粗酶液(制备方法同实施例1)加入15mL茶枝柑多甲氧基黄酮反应液中(即：含有2mmol/L MgCl2、2mmol/L二硫苏糖醇、0.3mmol/L EGCG的茶枝柑多甲氧基黄酮水溶液15mL)，35℃条件下，反应1小时，加入0.2mL 1.0mol/L盐酸终止反应，加入25mL乙酸乙酯萃取离心，取上部乙酸乙酯层置旋转蒸发仪中旋蒸至全干，加入1.0mL纯甲醇复溶，HPLC检测EGCG-3”-Me生成量为10.50μg/mL。
实施例5
茶树EGCG-O-甲基转移酶以EGCG和柠檬多甲氧基黄酮为底物催化合成甲基儿茶素EGCG-3”-Me：
取10.0g柠檬，80℃条件下加入30mL 60％甲醇水溶液浸提4min，过滤后同样方法再重复一次。采用同样方法共提取30.0g柠檬，合并所有提取液后置于旋转蒸发仪中旋蒸至完全干燥，加入纯水溶解后置于-20℃条件下冷冻24小时，随后转入冻干机中冷冻干燥，得到柠檬多甲氧基黄酮冻干粉。按照料液比1:150进行溶解保存在-20℃，即柠檬多甲氧基黄酮水溶液(川陈皮素的浓度为0.02mg/mL，橘皮素的浓度为0.03mg/mL，陈皮甙的浓度为1.14mg/mL)，备用。
取1mL茶树EGCG-O-甲基转移酶粗酶液(制备方法同实施例1)加入15mL柠檬多甲氧基黄酮反应液中(即：2mmol/L MgCl2、2mmol/L二硫苏糖醇、0.3mmol/L EGCG溶解于15mL柠檬多甲氧基黄酮水溶液)，35℃条件下，反应1小时，加入0.2mL 1.0mol/L盐酸终止反应，加入25mL乙酸乙酯萃取离心，取上部乙酸乙酯层置旋转蒸发仪中旋蒸至全干，加入1.0mL纯甲醇复溶，HPLC检测EGCG-3”-Me生成量为8.50μg/mL。
实施例6
茶树EGCG-O-甲基转移酶以EGCG和甜橙多甲氧基黄酮为底物催化合成甲基儿茶素EGCG-3”-Me：
取10.0g甜橙，80℃条件下加入30mL 60％甲醇水溶液浸提4min，过滤后同样方法再重复一次。采用同样方法共提取30.0g甜橙，合并所有提取液后置于旋转蒸发仪中旋蒸至完全干燥，加入纯水溶解后置于-20℃条件下冷冻24小时，随后转入冻干机中冷冻干燥，得到甜橙多甲氧基黄酮冻干粉。按照料液比1:150进行溶解保存在-20℃，即甜橙多甲氧基黄酮水溶液(川陈皮素的浓度为0.06mg/mL，橘皮素的浓度为0.02mg/mL，陈皮甙的浓度为1.50mg/mL)，备用。
取1mL茶树EGCG-O-甲基转移酶粗酶液(制备方法同实施例1)加入15mL甜橙多甲氧基黄酮反应液中(即：2mmol/L MgCl2、2mmol/L二硫苏糖醇、0.3mmol/L EGCG溶解于15mL甜橙多甲氧基黄酮水溶液)，35℃条件下，反应1小时，加入0.2mL 1.0mol/L盐酸终止反应，加入25mL乙酸乙酯萃取离心，取上部乙酸乙酯层置旋转蒸发仪中旋蒸至全干，加入1.0mL纯甲醇复溶，HPLC检测EGCG-3”-Me生成量为11.25μg/mL。
实施例7
茶树EGCG-O-甲基转移酶以EGCG和温州蜜柑多甲氧基黄酮为底物催化合成甲基儿茶素EGCG-3”-Me：
取10.0g温州蜜柑，80℃条件下加入30mL 60％甲醇水溶液浸提4min，过滤后同样方法再重复一次。采用同样方法共提取30.0g温州蜜柑，合并所有提取液后置于旋转蒸发仪中旋蒸至完全干燥，加入纯水溶解后置于-20℃条件下冷冻24小时，随后转入冻干机中冷冻干燥，得到温州蜜柑多甲氧基黄酮冻干粉。按照料液比1:150进行溶解保存在-20℃，即温州蜜柑多甲氧基黄酮水溶液(川陈皮素的浓度为0.24mg/mL，橘皮素的浓度为0.02mg/mL，陈皮甙的浓度为1.47mg/mL)，备用。
取1mL茶树EGCG-O-甲基转移酶粗酶液(制备方法同实施例1)加入15mL温州蜜柑多甲氧基黄酮反应液中(即：2mmol/L MgCl2、2mmol/L二硫苏糖醇、0.3mmol/L EGCG溶解于15mL温州蜜柑多甲氧基黄酮水溶液)，35℃条件下，反应1小时，加入0.2mL 1.0mol/L盐酸终止反应，加入25mL乙酸乙酯萃取离心，取上部乙酸乙酯层置旋转蒸发仪中旋蒸至全干，加入1.0mL纯甲醇复溶，HPLC检测EGCG-3”-Me生成量为11.09μg/mL。
实施例8
茶树EGCG-O-甲基转移酶以EGCG和椪柑多甲氧基黄酮为底物催化合成甲基儿茶素EGCG-3”-Me：
取10.0g椪柑，80℃条件下加入30mL 60％甲醇水溶液浸提4min，过滤后同样方法再重复一次。采用同样方法共提取30.0g椪柑，合并所有提取液后置于旋转蒸发仪中旋蒸至完全干燥，加入纯水溶解后置于-20℃条件下冷冻24小时，随后转入冻干机中冷冻干燥，得到椪柑多甲氧基黄酮冻干粉。按照料液比1:150进行溶解保存在-20℃，即椪柑多甲氧基黄酮水溶液(川陈皮素的浓度为0.28mg/mL，橘皮素的浓度为0.45mg/mL，陈皮甙的浓度为1.51mg/mL)，备用。
取1mL茶树EGCG-O-甲基转移酶粗酶液(制备方法同实施例1)加入15mL椪柑多甲氧基黄酮反应液中(即：2mmol/L MgCl2、2mmol/L二硫苏糖醇、0.3mmol/L EGCG溶解于15mL椪柑多甲氧基黄酮水溶液)，35℃条件下，反应1小时，加入0.2mL 1.0mol/L盐酸终止反应，加入25mL乙酸乙酯萃取离心，取上部乙酸乙酯层置旋转蒸发仪中旋蒸至全干，加入1.0mL纯甲醇复溶，HPLC检测EGCG-3”-Me生成量为10.32μg/mL。
实施例9
茶树EGCG-O-甲基转移酶以EGCG和无核蜜桔多甲氧基黄酮为底物催化合成甲基儿茶素EGCG-3”-Me：
取10.0g无核蜜桔，80℃条件下加入30mL 60％甲醇水溶液浸提4min，过滤后同样方法再重复一次。采用同样方法共提取30.0g无核蜜桔，合并所有提取液后置于旋转蒸发仪中旋蒸至完全干燥，加入纯水溶解后置于-20℃条件下冷冻24小时，随后转入冻干机中冷冻干燥，得到无核蜜桔多甲氧基黄酮冻干粉。按照料液比1:150进行溶解保存在-20℃，即无核蜜桔多甲氧基黄酮水溶液(川陈皮素的浓度为0.001mg/mL，橘皮素的浓度为0.03mg/mL，陈皮甙的浓度为1.54mg/mL)，备用。
取1mL茶树EGCG-O-甲基转移酶粗酶液(制备方法同实施例1)加入15mL无核蜜桔多甲氧基黄酮反应液中(即：2mmol/L MgCl2、2mmol/L二硫苏糖醇、0.3mmol/L EGCG溶解于15mL无核蜜桔多甲氧基黄酮水溶液)，35℃条件下，反应1小时，加入0.2mL 1.0mol/L盐酸终止反应，加入25mL乙酸乙酯萃取离心，取上部乙酸乙酯层置旋转蒸发仪中旋蒸至全干，加入1.0mL纯甲醇复溶，HPLC检测EGCG-3”-Me生成量为10.21μg/mL。
实施例10
茶树EGCG-O-甲基转移酶以EGCG和沙田柚多甲氧基黄酮为底物催化合成甲基儿茶素EGCG-3”-Me：
取10.0g沙田柚，80℃条件下加入30mL 60％甲醇水溶液浸提4min，过滤后同样方法再重复一次。采用同样方法共提取30.0g沙田柚，合并所有提取液后置于旋转蒸发仪中旋蒸至完全干燥，加入纯水溶解后置于-20℃条件下冷冻24小时，随后转入冻干机中冷冻干燥，得到沙田柚多甲氧基黄酮干粉。按照料液比1:150进行溶解保存在-20℃，即沙田柚多甲氧基黄酮水溶液(川陈皮素的浓度为0.03mg/mL，橘皮素的浓度为0.02mg/mL，陈皮甙的浓度为0.07mg/mL)，备用。
取1mL茶树EGCG-O-甲基转移酶粗酶液(制备方法同实施例1)加入15mL沙田柚多甲氧基黄酮反应液中(即：2mmol/L MgCl2、2mmol/L二硫苏糖醇、0.3mmol/L EGCG溶解于15mL沙田柚多甲氧基黄酮水溶液)，35℃条件下，反应1小时，加入0.2mL 1.0mol/L盐酸终止反应，加入25mL乙酸乙酯萃取离心，取上部乙酸乙酯层置旋转蒸发仪中旋蒸至全干，加入1.0mL纯甲醇复溶，HPLC检测EGCG-3”-Me生成量为2.08μg/mL。
实施例11
茶树EGCG-O-甲基转移酶以EGCG和砂糖橘多甲氧基黄酮为底物催化合成甲基儿茶素EGCG-3”-Me：
取10.0g砂糖橘，80℃条件下加入30mL 60％甲醇水溶液浸提4min，过滤后同样方法再重复一次。采用同样方法共提取30.0g砂糖橘，合并所有提取液后置于旋转蒸发仪中旋蒸至完全干燥，加入纯水溶解后置于-20℃条件下冷冻24小时，随后转入冻干机中冷冻干燥，得到砂糖橘多甲氧基黄酮冻干粉。按照料液比1:150进行溶解保存在-20℃，即砂糖橘多甲氧基黄酮水溶液(川陈皮素的浓度为0.04mg/mL，橘皮素的浓度为0.14mg/mL，陈皮甙的浓度为1.12mg/mL)，备用。
取1mL茶树EGCG-O-甲基转移酶粗酶液(制备方法同实施例1)加入15mL砂糖橘多甲氧基黄酮反应液中(即：2mmol/L MgCl2、2mmol/L二硫苏糖醇、0.3mmol/L EGCG溶解于15mL砂糖橘多甲氧基黄酮水溶液)，35℃条件下，反应1小时，加入0.2mL 1.0mol/L盐酸终止反应，加入25mL乙酸乙酯萃取离心，取上部乙酸乙酯层置旋转蒸发仪中旋蒸至全干，加入1.0mL纯甲醇复溶，HPLC检测EGCG-3”-Me生成量为8.06μg/mL。
实施例12
茶树EGCG-O-甲基转移酶以EGCG和沃柑多甲氧基黄酮为底物催化合成甲基儿茶素EGCG-3”-Me：
取10.0g沃柑，80℃条件下加入30mL 60％甲醇水溶液浸提4min，过滤后同样方法再重复一次。采用同样方法共提取30.0g沃柑，合并所有提取液后置于旋转蒸发仪中旋蒸至完全干燥，加入纯水溶解后置于-20℃条件下冷冻24小时，随后转入冻干机中冷冻干燥，得到沃柑多甲氧基黄酮冻干粉。按照料液比1:150进行溶解保存在-20℃，即沃柑多甲氧基黄酮水溶液(川陈皮素的浓度为0.05mg/mL，橘皮素的浓度为0.04mg/mL，陈皮甙的浓度为1.47mg/mL)，备用。
取1mL茶树EGCG-O-甲基转移酶粗酶液(制备方法同实施例1)加入15mL沃柑多甲氧基黄酮反应液中(即：2mmol/L MgCl2、2mmol/L二硫苏糖醇、0.3mmol/L EGCG溶解于15mL沃柑多甲氧基黄酮水溶液)，35℃条件下，反应1小时，加入0.2mL 1.0mol/L盐酸终止反应，加入25mL乙酸乙酯萃取离心，取上部乙酸乙酯层置旋转蒸发仪中旋蒸至全干，加入1.0mL纯甲醇复溶，HPLC检测EGCG-3”-Me生成量为11.23μg/mL。
实施例13
茶树EGCG-O-甲基转移酶以EGCG和茂谷柑多甲氧基黄酮为底物催化合成甲基儿茶素EGCG-3”-Me：
取10.0g茂谷柑，80℃条件下加入30mL 60％甲醇水溶液浸提4min，过滤后同样方法再重复一次。采用同样方法共提取30.0g茂谷柑，合并所有提取液后置于旋转蒸发仪中旋蒸至完全干燥，加入纯水溶解后置于-20℃条件下冷冻24小时，随后转入冻干机中冷冻干燥，得到茂谷柑多甲氧基黄酮冻干粉。按照料液比1:150进行溶解保存在-20℃，即茂谷柑多甲氧基黄酮水溶液(川陈皮素的浓度为0.06mg/mL，橘皮素的浓度为0.16mg/mL，陈皮甙的浓度为1.56mg/mL)，备用。
取1mL茶树EGCG-O-甲基转移酶粗酶液(制备方法同实施例1)加入15mL茂谷柑多甲氧基黄酮反应液中(即：2mmol/L MgCl2、2mmol/L二硫苏糖醇、0.3mmol/L EGCG溶解于15mL茂谷柑多甲氧基黄酮水溶液)，35℃条件下，反应1小时，加入0.2mL 1.0mol/L盐酸终止反应，加入25mL乙酸乙酯萃取离心，取上部乙酸乙酯层置旋转蒸发仪中旋蒸至全干，加入1.0mL纯甲醇复溶，HPLC检测EGCG-3”-Me生成量为12.46μg/mL。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国农业科学院茶叶研究所
<120> 一种制备EGCG-3''-Me的方法
<140> 2022106874028
<141> 2022-06-16
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Ala Thr Asn Gly Glu Gly Glu Gln Asn Leu Arg His Gln Glu Val
1 5 10 15
Gly His Lys Ser Leu Leu Gln Ser Asp Ala Leu Tyr Gln Tyr Ile Leu
20 25 30
Glu Thr Ser Val Tyr Pro Arg Glu Pro Glu Ala Met Lys Glu Leu Arg
35 40 45
Glu Val Thr Ala Lys His Pro Trp Asn Ile Met Thr Thr Ser Ala Asp
50 55 60
Glu Gly Gln Phe Leu Asn Met Leu Leu Lys Leu Ile Asn Ala Lys Asn
65 70 75 80
Thr Met Glu Ile Gly Val Tyr Thr Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Thr Ala
85 90 95
Leu Ala Leu Pro Asp Asp Gly Lys Ile Leu Ala Met Asp Ile Asn Arg
100 105 110
Asp Asn Phe Glu Ile Gly Leu Pro Ile Ile Glu Lys Ala Gly Val Ala
115 120 125
His Lys Ile Asp Phe Arg Glu Gly Pro Ala Leu Pro Ala Leu Asp Lys
130 135 140
Met Ile Glu Asp Gly Lys His His Gly Ser Phe Asp Phe Ile Phe Val
145 150 155 160
Asp Ala Asp Lys Asp Asn Tyr Ile Asn Tyr His Lys Arg Leu Ile Asp
165 170 175
Leu Val Lys Val Gly Gly Leu Ile Gly Tyr Asp Asn Thr Leu Trp Asn
180 185 190
Gly Ser Val Val Ala Pro Pro Asp Ala Pro Met Arg Lys Tyr Val Arg
195 200 205
Tyr Tyr Arg Asp Phe Val Leu Glu Leu Asn Lys Ala Leu Ala Ala Asp
210 215 220
Pro Arg Ile Glu Ile Cys Met Leu Pro Val Gly Asp Gly Ile Thr Leu
225 230 235 240
Cys Arg Arg Val Cys
245

Claims (10)

1.一种制备EGCG-3”-Me的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将茶树EGCG-O-甲基转移酶酶液与底物溶液混合，得到反应液；
所述底物溶液中含有多甲氧基黄酮、表没食子儿茶素没食子酸酯、氯化镁和二硫苏糖醇；所述底物溶液中表没食子儿茶素没食子酸酯的浓度为0.3mmol/L，氯化镁的浓度为2mmol/L，二硫苏糖醇的浓度为2mmol/L；
所述多甲氧基黄酮包括陈皮甙、橘皮素和川陈皮素中的一种或几种；
所述茶树EGCG-O-甲基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；
所述茶树EGCG-O-甲基转移酶酶液的浓度为1mg/mL；
所述茶树EGCG-O-甲基转移酶酶液与底物溶液的体积比为1:15；
2)将所述步骤1)得到的反应液在35℃条件下反应1h，得到EGCG-3”-Me。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，当所述多甲氧基黄酮为陈皮甙时，所述底物溶液中陈皮甙的浓度为0.4mmol/L。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，当所述多甲氧基黄酮为橘皮素时，所述底物溶液中橘皮素的浓度为0.4mmol/L。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，当所述多甲氧基黄酮为川陈皮素时，所述底物溶液中川陈皮素的浓度为0.4mmol/L。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述多甲氧基黄酮来源于茶枝柑、温州蜜柑、椪柑、沃柑或茂谷柑；
当所述多甲氧基黄酮来源于茶枝柑时，所述底物溶液中川陈皮素的浓度为0.12mg/mL，橘皮素的浓度为0.16mg/mL，陈皮甙的浓度为1.40mg/mL；
当所述多甲氧基黄酮来源于温州蜜柑时，所述底物溶液中川陈皮素的浓度为0.24mg/mL，橘皮素的浓度为0.02mg/mL，陈皮甙的浓度为1.47mg/mL；
当所述多甲氧基黄酮来源于椪柑时，所述底物溶液中川陈皮素的浓度为0.28mg/mL，橘皮素的浓度为0.45mg/mL，陈皮甙的浓度为1.51mg/mL；
当所述多甲氧基黄酮来源于沃柑时，所述底物溶液中川陈皮素的浓度为0.05mg/mL，橘皮素的浓度为0.04mg/mL，陈皮甙的浓度为1.47mg/mL；
当所述多甲氧基黄酮来源于茂谷柑时，所述底物溶液中川陈皮素的浓度为0.06mg/mL，橘皮素的浓度为0.16mg/mL，陈皮甙的浓度为1.56mg/mL。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，当所述多甲氧基黄酮来源于柠檬时，所述底物溶液中川陈皮素的浓度为0.02mg/mL，橘皮素的浓度为0.03mg/mL，陈皮甙的浓度为1.14mg/mL。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，当所述多甲氧基黄酮来源于甜橙时，所述底物溶液中川陈皮素的浓度为0.06mg/mL，橘皮素的浓度为0.02mg/mL，陈皮甙的浓度为1.50mg/mL。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，当所述多甲氧基黄酮来源于无核蜜桔时，所述底物溶液中川陈皮素的浓度为0.001mg/mL，橘皮素的浓度为0.03mg/mL，陈皮甙的浓度为1.54mg/mL。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，当所述多甲氧基黄酮来源于沙田柚时，所述底物溶液中川陈皮素的浓度为0.03mg/mL，橘皮素的浓度为0.02mg/mL，陈皮甙的浓度为0.07mg/mL。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，当所述多甲氧基黄酮来源于砂糖橘时，所述底物溶液中川陈皮素的浓度为0.04mg/mL，橘皮素的浓度为0.14mg/mL，陈皮甙的浓度为1.12mg/mL。
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