CN109464500A

CN109464500A - 复合酶提取桑叶黄酮的方法

Info

Publication number: CN109464500A
Application number: CN201811403211.4A
Authority: CN
Inventors: 王海燕; 李睿; 王小燕; 曾秀; 王介平; 谷山林; 周婵; 吕金凤; 熊定奎
Original assignee: Chongqing Academy of Animal Sciences
Current assignee: Chongqing Academy of Animal Sciences
Priority date: 2018-11-23
Filing date: 2018-11-23
Publication date: 2019-03-15
Anticipated expiration: 2038-11-23
Also published as: CN109464500B

Abstract

本发明属于黄酮技术领域，具体涉及一种复合酶提取桑叶黄酮的方法。所述复合酶提取桑叶黄酮的方法以α‑淀粉酶、糖化酶和木瓜蛋白酶组成的复合酶对桑叶进行处理，α‑淀粉酶、糖化酶和木瓜蛋白酶的配比关系为0.8‑1.2:0.9‑1.3:1.7‑2.2。该方法能够提高桑叶黄酮的提取率，提高抗氧化水平。

Description

复合酶提取桑叶黄酮的方法

技术领域

本发明属于黄酮技术领域，具体涉及一种复合酶提取桑叶黄酮的方法。

背景技术

桑叶(Mulberry Leaf)，又名铁扇子、家桑、荆桑、黄桑叶等，是桑科植物桑的叶子，在我国大部分地区多有生产，尤其以长江中下游及四川盆地桑区为多，是一种重要的药食两用植物原料(中药大辞典(下册)，江苏新医学院，上海：上海人民出版社，公开日1997液12月31日)。桑叶始载于《神农本草经》，其味苦、甘，性寒，归肺、肝经，具有疏风清热、平肝明目的功效。研究表明，桑叶中含有多种生物活性成分：人体必需氨基酸、蛋白质、碳水化合物、脂肪、糖、维生素、无机盐、黄酮、生物碱、植物甾醇等，具有降血压、降血脂、降血糖、降胆固醇、抗炎、抗衰老、抗肿瘤、增加耐力等功效(“桑叶化学成分的研究”，王晓静等，食品与药品，2007年第9期，第9-1l页，公开日2007年12月31日；“桑树资源的综合利用”，胡虹等，农技服务，2010年第27卷第7期，第892-893页，公开日2010年12月31日)，在食品、药品、化妆品、饮料、护肤剂、着色剂、畜牧等领域，具有极大的市场前景(“桑树资源的综合利用”，李月文，四川林业科技，2005年第26卷第3期，第92-94页，公开日2005年06月30日；“桑树资源的综合利用”，胡虹等，农技服务，2010年第27卷第7期，第892-893页，公开日2010年12月31日)。随着现代分离纯化技术的发展，桑叶活性成分的研究越来越得到重视。采用新技术改造并挖掘桑叶资源的潜力已成为今后桑叶研究的趋势。其中，黄酮类化合物是桑叶的重要功能性成分之一，包括槲皮素、异槲皮素、芸香苷等(“桑叶中黄酮类化学成分及药理作用研究进展”，李明聪等，辽宁中医杂志，2012年第39卷第2期，第377-380页，公开日2012年12月31日)，具有抗氧化、抗肿瘤、抗癌、抗炎、镇痛、护肝、抗菌、抗病毒、防止动脉硬化等多种生物活性及药理作用(“黄酮类化合物的生物转化研究进展”，赖剑峰等，广东农业科学，2013年第4期，第95-97页，公开日2013年12月31日)。

目前，许多学者针对桑叶黄酮的开发利用进行了大量的研究。其中，如何高效地提取桑叶黄酮则是开展众多研究工作的前提和基础，提取方法和提取工艺对桑叶黄酮的提取率有着显著影响(“正交试验法与响应面法在桑叶黄酮提取工艺优化中的应用和比较”，牟会荣等，江苏科技大学学报(自然科学版)，2016年第30卷第1期，第88-93页，公开日2016年02月28日)。贺伟强介绍了微波萃取法、超声波法、超声-微波协同提取法及浸提法(“桑叶黄酮的提取工艺及药理功效研究进展”，贺伟强，北方园艺，2012年第21期，第181-183页，公开日2012年12月31日)。熊知行等利用纤维素酶通过单因素实验和正交实验确定了酶提取工艺的最佳参数(酶法提取桑叶中黄酮类化合物的研究”，熊知行等，食品工业科技，2009年第3期，第223-224页，公开日2009年12月31日)。王芳等采用了不同的方法(有机溶剂、稀盐和酶法)研究了提取桑叶中的黄酮类化合物的最佳方法，得出这几类方法均优于有机溶剂的一步提取，其中纤维素酶乙醇提取法效果最佳(“桑叶黄酮的提取纯化及对油脂抗氧化活性的研究”，王芳等，中国食品科学技术学会东西方食品业高层论坛，2007年，第106-111页，公开日2007年12月31日)。

综上，提取黄酮的方法有很多。传统的热回流提取法成本低，安全性高，适合工业生产，但是，其总黄酮提取率低，温度过高导致部分黄酮类化合物分解，由于提取溶剂中含有水，在加热状态下，一些溶于水的杂质如糖类、蛋白质等一并进入提取液中，加大了进一步分离的困难；冷浸提取法有效避免了加热过程，一定程度上保护热敏性黄酮类成分，但是提取时间较长，所用溶剂量大，且所用石油醚、乙酸乙酯等有机溶剂易燃易爆，试剂有毒和具强烈刺激性，危害人体，污染环境，同时试验步骤比较繁琐，提取周期较长，试剂成本较高(“正交试验法与响应面法在桑叶黄酮提取工艺优化中的应用和比较”，牟会荣等，江苏科技大学学报(自然科学版)，2016年第30卷第1期，第88-93页，公开日2016年02月28日；“黄酮类化合物的提取、分离、纯化研究进展”，唐德智，海峡药学，2009年第21卷第12期，第101-104页，公开日2009年12月31日)；索氏提取法不仅工艺复杂，成本高(提取时每个样品均需配额比索氏提取器)，且耗时长，通常需要3-6h，而且长时间提取会因受热而导致热敏性黄酮类成分结构破坏(“超声波提取法与索氏提取法提取陈皮黄酮类有效成分的分析比较”，罗琥捷等，2016年第39卷第2期，第371-374页，公开日2016年02月28日；“”)。热水提取仅限于提取苷类，且提取杂质多，黄酮收率低(“黄酮类化合物的提取、分离、纯化研究进展”，唐德智，海峡药学，2009年第21卷第12期，第101-104页，公开日2009年12月31日)。酶解法具有条件温和、高效、区域选择性高、工艺简单、环境友好等优点，可有效克服以上缺点，对于一些黄酮类物质被细胞壁包围不易提取的原料比较实用，其原理是利用相应的酶充分破坏以纤维素为主的细胞壁结构及其细胞间相连的果胶，使植物中的果胶完全分解成小分子物质，减少提取的传质阻力，使植物中的黄酮类物质能充分释放出来(“黄酮类化合物的提取、分离、纯化研究进展”，唐德智，海峡药学，2009年第21卷第12期，第101-104页，公开日2009年12月31日；“桑叶黄酮的提取纯化及对油脂抗氧化活性的研究”，王芳等，中国粮油学报，2006年第21卷第4期，第106-111页，公开日2006年12月31日)。

目前，针对桑叶黄酮提取主要是利用单一的酶进行工艺摸索，以纤维素酶为主(“酶法提取桑叶中黄酮类化合物的研究”，熊知行等，食品工业科技，2009年第30卷第3期，第223-225页，公开日2009年12月31日)。

迄今，未发现将α-淀粉酶、糖化酶、木瓜蛋白酶进行配比的复合酶提取桑叶黄酮的方法。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种复合酶提取桑叶黄酮的方法。

发明人在研究过程中发现，α-淀粉酶、糖化酶和木瓜蛋白酶的最适条件不同，其中，α-淀粉酶的最适PH为5.0，在无外加Ca²⁺时的最适反应温度为75℃，当加入Ca²⁺浓度为10mmol/L，可使最适温度提高至85℃(“α-淀粉酶的活性及其热稳定性的研究”，中国酿造，2008年第20期，第20-23页，公开日2008年12月31日)；糖化酶的最适pH为4.0-6.5，最适温度为70-85℃(“糖化酶的研究概况”，张秀媛等，食品研究与开发，2006年第27卷第9期，第163-166页，公开日2006年12月31日；“糖化酶生产菌次要水解酶的研究”，周敏，江南大学，2009年，第1-25页，公开日2009年12月31日)；木瓜蛋白酶的最适温度为45℃，最适pH为4.5(“木瓜蛋白酶的应用研究进展”，熊华，四川食品与发酵，2005年第4期，第9-11页，公开日2005年12月31日)。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

复合酶提取桑叶黄酮的方法，以α-淀粉酶、糖化酶和木瓜蛋白酶组成的复合酶对桑叶进行酶解，α-淀粉酶、糖化酶和木瓜蛋白酶的配比关系为0.8-1.2:0.9-1.3:1.7-2.2。

发明人在研究过程中发现，α-淀粉酶、糖化酶和木瓜蛋白酶的配比关系若控制不好，会导致桑叶黄酮的提取率低，且某些黄酮类化合物对α-淀粉酶活性存在抑制作用，在抑制了酶活性的同时，消耗了自身的黄酮含量(“黄酮类化合物的药效机制及构效关系研究进展”，陈永钧等，中国实验方剂学杂志，2013年第19卷第11期，第337-342页，公开日2013年06月30日)。

进一步，所述复合酶的用量为桑叶质量的0.75％-1.2％。

进一步，所述复合酶提取桑叶黄酮的方法包括以下步骤：在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液存在下，以α-淀粉酶、糖化酶和木瓜蛋白酶组成的复合酶对桑叶进行酶解，离心，得到滤液A和滤渣A，滤渣A置于乙醇溶液进行超声波萃取，过滤，得到滤液B，滤液A和滤液B混合并蒸发浓缩，α-淀粉酶、糖化酶和木瓜蛋白酶的配比关系为0.8-1.2:0.9-1.3:1.7-2.2。

进一步，所述柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液的用量为使桑叶的终浓度为1g/35mL缓冲液-1g/15mL缓冲液。此处，桑叶是指干桑叶，含水量为8.26％，以风干基础计。若选择以新鲜桑叶为原料提取黄酮，则进行相应的比例换算。

进一步，所述缓冲溶液的pH为4-7。

进一步，酶解温度为60-70℃。

进一步，酶解时间为1.5-2.5h。

进一步，所述乙醇溶液为体积分数为65％-85％的乙醇溶液。

进一步，所述乙醇溶液的用量为使滤渣在终浓度为1g滤渣/10mL溶液。

进一步，所述超声波萃取的条件设置为，超声波功率200w，超声时间30min，温度80℃。

进一步，所述蒸发浓缩的条件设置为，真空度0.01MPa，温度为50℃，蒸发浓缩至干，然后定容至10mL。

进一步，所述复合酶提取桑叶黄酮的方法，包括以下步骤：在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液存在下，以α-淀粉酶、糖化酶和木瓜蛋白酶按照配比关系0.8-1.2:0.9-1.3:1.7-2.2组成的复合酶对桑叶在pH为4-7、温度为60-70℃条件下酶解1.5-2.5h，所述复合酶的用量为桑叶质量的0.75％-1.2％，离心，得到滤液A和滤渣A，滤渣中加入乙醇溶液进行超声波萃取，过滤，得到滤液B，将滤液A和滤液B混合并蒸发浓缩，α-淀粉酶、糖化酶和木瓜蛋白酶的，所述柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液的用量为使桑叶的终浓度为1g/35mL缓冲液-1g/15mL缓冲液。

发明人在研究过程中发现，包括以下步骤：在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液存在下，以α-淀粉酶、糖化酶和木瓜蛋白酶按照配比关系0.8-1.2:0.9-1.3:1.7-2.2组成的复合酶对桑叶在pH为4-7、温度为60-70℃条件下酶解1.5-2.5h，所述复合酶的用量为桑叶质量的0.75％-1.0％，离心，得到滤液A和滤渣A，滤渣中加入乙醇溶液进行超声波萃取，过滤，得到滤液B，将滤液A和滤液B混合并蒸发浓缩，α-淀粉酶、糖化酶和木瓜蛋白酶的，所述柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液的用量为使桑叶的终浓度为1g/35mL缓冲液-1g/15mL缓冲液；；的方法能够提高桑叶黄酮的提取率，提高抗氧化水平。

进一步，所述复合酶提取桑叶黄酮的方法，包括以下步骤：在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液存在下，以α-淀粉酶、糖化酶和木瓜蛋白酶按照配比关系1:1:2组成的复合酶对桑叶在pH为6、温度为60℃条件下酶解1.5-2.5h，所述复合酶的用量为桑叶质量的1％，离心，得到滤液A和滤渣A，滤渣A置于乙醇溶液进行超声波萃取，过滤，得到滤液B，滤液A和滤液B混合并蒸发浓缩，α-淀粉酶、糖化酶和木瓜蛋白酶的，所述柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液的用量为使桑叶的终浓度为1g/33mL缓冲液-1g/10mL缓冲液。

发明人在研究过程中发现，包括以下步骤：在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液存在下，以α-淀粉酶、糖化酶和木瓜蛋白酶按照配比关系1:1:2组成的复合酶对桑叶在pH为6、温度为60℃条件下酶解1.5-2.5h，所述复合酶的用量为桑叶质量的1％，离心，得到滤液A和滤渣A，滤渣中加入乙醇溶液进行超声波萃取，过滤，得到滤液B，将滤液A和滤液B混合并蒸发浓缩，α-淀粉酶、糖化酶和木瓜蛋白酶的，所述柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液的用量为使桑叶的终浓度为1g/14mL缓冲液-1g/16mL缓冲液；的方法能够提高桑叶黄酮的提取率，提高抗氧化水平。

本发明的有益效果在于：

本发明的方法能够提高桑叶黄酮的提取率。

本发明的方法能够提高抗氧化水平。

具体实施方式

所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

以下桑叶来自重庆市畜牧科学院蚕业研究所；

以下α-淀粉酶购自北京奥博星生物技术有限公司；

以下糖化酶购自北京奥博星生物技术有限公司；

以下木瓜蛋白酶购自上海如吉生物科技发展有限公司；

以下磷酸氢二钠、柠檬酸、分析纯无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝和氢氧化钠购自成都市科隆化学品有限公司。

实施例1

桑叶黄酮的提取方法，具体步骤为：

A.柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液的配制：

0.1mol/L柠檬酸溶液(称取21.014g柠檬酸，用适量无离子水充分溶解后，倒入1000mL容量瓶定容，备用)；0.2mol/L磷酸氢二钠溶液(称取71.628g磷酸氢二钠，用适量无离子水充分溶解并定容至1000mL，备用)。将0.1mol/L柠檬酸溶液和0.2mol/L磷酸氢二钠溶液按照1:1.06的体积比混合，配制成pH为6.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液；将0.1mol/L柠檬酸溶液和0.2mol/L磷酸氢二钠溶液1:4.7的体积比混合，配制成pH为7.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液。

B.芦丁标准曲线的制作

称取芦丁标准品20mg，加入体积分数为70％的乙醇溶液，溶解并定容，得到芦丁标准液(含无水芦丁0.02g/L)。分别吸取芦丁标准液0mL、2.0mL、4.0mL、6.0mL、8.0mL、10.0mL到25mL容量瓶中，加入体积分数为70％的乙醇溶液至6mL，吸取750uL 50g/L亚硝酸钠溶液至容量瓶中，摇匀，静置6min；再吸取750μL 100g/L硝酸铝溶液至容量瓶中，摇匀，静置6min；再加入40g/L氢氧化钠10mL，用体积浓度为70％乙醇溶液定容至刻度线，摇匀，静置10min。利用分光光度计与510nm测定溶液吸光值。以质量浓度P为横坐标，吸光度D(A)为纵坐标，得到回归方程：

Y＝0.0107+0.0557R²＝0.9978

C.桑叶黄酮的提取

称取桑叶干粉45.00g(水分质量含量为8.26％)，平均分为6份，分别为实验组1、实验组2、对照组1、对照组2、对照组3和对照组4，每个组别的桑叶干粉均平行处理三次，以其平均值作为检测结果；

实验组1的桑叶干粉按照以下方法进行处理：

取桑叶干粉2.50g，加入pH为6.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液35.7mL，将α-淀粉酶、糖化酶和木瓜蛋白酶按照配比关系1:1:2进行复配得到复合酶，在pH为6.0、温度为60℃条件下酶解1.5h，所述复合酶的用量为桑叶质量的1％，离心，得到滤液A和滤渣A，滤渣中加入25mL体积分数为70％的乙醇溶液进行超声波萃取，超声波功率200w，超声时间30min，温度80℃,萃取3次，合并滤液，过滤，得到滤液B，将滤液A和滤液B混合，并于真空度0.01MPa，温度为50℃，蒸发浓缩至干，然后定容至10mL。

实验组2的桑叶干粉按照以下方法进行处理：

取桑叶干粉2.50g，加入pH为6.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液25mL，将α-淀粉酶、糖化酶和木瓜蛋白酶按照配比关系1:1:2进行复配得到复合酶，在pH为6.0、温度为60℃条件下酶解1.5h，所述复合酶的用量为桑叶质量的0.75％，离心，得到滤液A和滤渣A，滤渣中加入25mL体积分数为70％的乙醇溶液进行超声波萃取,超声波功率200w，超声时间30min，温度80℃,萃取3次，合并滤液，过滤，得到滤液B，将滤液A和滤液B混合，并于真空度0.01MPa，温度为50℃下蒸发浓缩至干，然后用体积分数为70％的乙醇溶液定容至10mL。

对照组1的桑叶干粉按照以下方法进行处理：

取桑叶干粉2.50g，加入pH为7.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液为溶剂25mL，在pH为6.0、温度为60℃条件下处理1.5h，得到滤液A和滤渣A，滤渣中按照1:10加入体积分数为70％的乙醇溶液进行超声波萃取，超声波功率200w，超声时间30min，温度80℃，萃取3次，合并滤液，过滤，得到滤液B，将滤液A和滤液B混合，并于真空度0.01MPa，温度为50℃下蒸发浓缩至干，然后用体积分数为70％的乙醇溶液定容至10mL。

对照组2的桑叶干粉按照以下方法进行处理：

取桑叶干粉2.50g，加入pH为7.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液为溶剂25mL，加入为桑叶质量的0.45％的α-淀粉酶，在pH为6.5、温度为50℃条件下酶解1.5h，酶解完后酶活，离心，得到滤液A和滤渣A，滤渣中按照1:10加入体积分数为70％的乙醇溶液进行超声波萃取，超声波功率200w，超声时间30min，温度80℃，萃取3次，合并滤液，过滤，得到滤液B，将滤液A和滤液B混合，并于真空度0.01MPa，温度为50℃下蒸发浓缩至干，然后用体积分数为70％的乙醇溶液定容至10mL。

对照组3的桑叶干粉按照以下方法进行处理：

取桑叶干粉2.50g，加入pH为7.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液为溶剂25mL，加入为桑叶质量的0.45％的糖化酶，在pH为4.18、温度为60℃条件下酶解1.5h，酶解完后酶活，离心，得到滤液A和滤渣A，滤渣中加入体积分数为70％的乙醇溶液(乙醇溶液的用量为使滤渣在终浓度为1g滤渣/10mL溶液)进行超声波萃取，超声波功率200w，超声时间30min，温度80℃，萃取3次，合并滤液，过滤，得到滤液B，将滤液A和滤液B混合，并于真空度0.01MPa，温度为50℃下蒸发浓缩至干，然后用体积分数为70％的乙醇溶液定容至10mL。

对照组4的桑叶干粉按照以下方法进行处理：

取桑叶干粉2.50g，以pH为7.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液为溶剂，按照料液比1:20加入溶剂，加入为桑叶质量的0.45％的木瓜蛋白酶，在pH为6.0、温度为60℃条件下酶解1.5h，酶解完后酶活，离心，得到滤液A和滤渣A，滤渣中按照1:10加入体积分数为70％的乙醇溶液进行超声波萃取，超声波功率200w，超声时间30min，温度80℃，萃取3次，合并滤液，过滤，得到滤液B，将滤液A和滤液B混合，并于真空度0.01MPa，温度为50℃下蒸发浓缩至干，然后用体积分数为70％的乙醇溶液定容至10mL。

桑叶总黄酮测定

检测实验组1、实验组2、对照组1、对照组2、对照组3和对照组4得到的提取液的浓度，具体方法为：

分别吸取实验组1、实验组2、对照组1、对照组2、对照组3和对照组4得到的提取液，并分别稀释至2mg/mL、4mg/mL、6mg/mL、8mg/mL、10mg/mL、12.5mg/mL，待测。分别取2mL稀释液于25mL容量瓶中，加入4mL体积浓度为70％乙醇溶液，吸取0.75mL 50g/L亚硝酸钠溶液至容量瓶中，摇匀，静置6min；再吸取0.75mL 100g/L硝酸铝溶液至容量瓶中，摇匀，静置6min；再加入40g/L氢氧化钠10mL，用体积分数为70％的乙醇溶液定容至刻度线，摇匀，静置10min。利用分光光度计于510nm波长处测定溶液吸光值，结果如表1所示。

表1桑叶总黄酮测检测结果

由表1可知，无酶处理的对照组1的黄酮含量最低1.44mg/g。与空白对照组相比，对照组2、对照组3和对照组4处理的桑叶黄酮含量均有所增加，分别为2.08mg/g、3.18mg/g、1.85mg/g。经本申请的复合酶处理的实验组1的桑叶中黄酮含量最高，达到12.90mg/g，而经复合酶处理的实验组2其黄酮含量仅为6.19mg/g。由此证明，本发明的方法能够显著提高桑叶黄酮提取率。

DPPH自由基清除率检测

检测实验组1、实验组2、实验组3、对照组1、对照组2、对照组3和对照组4得到的提取液的DPPH自由基清除率，具体方法为：吸取待测液稀释至2mg/mL、4mg/mL、6mg/mL、8mg/mL、10mg/mL、12.5mg/mL，待测。分别取5mL 2mmol/L的DPPH试剂于10mL离心管中，再分别加入各浓度稀释液1mL，混合摇匀，在避光条件下静置30min后，与517nm下测定吸光值，每个浓度平行测定3次，并以空白样品进行对照，空白样品除未添加DPPH试剂外，其他与待测液的处理相同。

计算公式：

式中，A1为的为空白样品的吸光度，A2为待测液的吸光度，

根据测定不同浓度样品DPPH清除率，得到以DPPH清除率为纵坐标，以浓度为横坐标得到线性回归方程(线性回归方程如表2所示)，然后依据线性回归方程计算出DPPH清除率为50％时的浓度IC₅₀值，IC₅₀值越小DPPH清除作用越强，结果如表2所示。

表2 DPPH自由基清除IC₅₀测定结果

由表2可知，实验组1的DPPH为50％的浓度IC₅₀值最低，为0.046mg/mL，表明该处理后的桑叶黄酮抗氧化性最强。对照组1处理的DPPH为50％的浓度IC₅₀值值最大，表明其抗氧化性最弱。实验组3、对照组3、对照组4的DPPH为50％的浓度IC₅₀值较实验组1值高，抗氧化性次之，而实验组2、对照组2的DPPH为50％的浓度IC₅₀值又较实验组3、对照组3和对照组4高，抗氧化效果最低。由此证明，本发明的方法能够显著提高桑叶黄酮抗氧化性。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims

1.复合酶提取桑叶黄酮的方法，其特征在于，以α-淀粉酶、糖化酶和木瓜蛋白酶组成的复合酶对桑叶进行酶解，α-淀粉酶、糖化酶和木瓜蛋白酶的配比关系为0.8-1.2:0.9-1.3:1.7-2.2。

2.根据权利要求1所述的复合酶提取桑叶黄酮的方法，其特征在于，α-淀粉酶、糖化酶和木瓜蛋白酶的配比关系为1:1:2。

3.根据权利要求1或2所述的复合酶提取桑叶黄酮的方法，其特征在于，所述复合酶的用量为桑叶质量的0.75％-1.2％。

4.根据权利要求1、2或3所述的复合酶提取桑叶黄酮的方法，其特征在于，包括以下步骤：在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液存在下，以α-淀粉酶、糖化酶和木瓜蛋白酶组成的复合酶对桑叶进行酶解，离心，得到滤液A和滤渣A，滤渣A置于乙醇溶液进行超声波萃取，过滤，得到滤液B，滤液A和滤液B混合并蒸发浓缩，α-淀粉酶、糖化酶和木瓜蛋白酶的配比关系为0.8-1.2:0.9-1.3:1.7-2.2。

5.根据权利要求4所述的复合酶提取桑叶黄酮的方法，其特征在于，所述柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液的用量为是桑叶的终浓度为1g/35mL缓冲液-1g/10mL缓冲液。

6.根据权利要求4或5所述的复合酶提取桑叶黄酮的方法，其特征在于，所述缓冲溶液的pH为4-7。

7.根据权利要求4、5或6所述的复合酶提取桑叶黄酮的方法，其特征在于，酶解温度为60-70℃。

8.根据权利要求4、5、6或7所述的复合酶提取桑叶黄酮的方法，其特征在于，酶解时间为1.5-2.5h。

9.根据权利要求4、5、6、7或8所述的复合酶提取桑叶黄酮的方法，其特征在于，包括以下步骤：在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液存在下，以α-淀粉酶、糖化酶和木瓜蛋白酶按照配比关系0.8-1.2:0.9-1.3:1.7-2.2组成的复合酶对桑叶在pH为4-7、温度为60-70℃条件下酶解1.5-2.5h，所述复合酶的用量为桑叶质量的0.75％-1.0％，离心，得到滤液A和滤渣A，滤渣A置于乙醇溶液进行超声波萃取，过滤，得到滤液B，滤液A和滤液B混合并蒸发浓缩，所述柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液的用量为使桑叶的终浓度为1g/35mL缓冲液-1g/10mL缓冲液。

10.根据权利要求9所述的复合酶提取桑叶黄酮的方法，其特征在于，包括以下步骤：在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液存在下，以α-淀粉酶、糖化酶和木瓜蛋白酶按照配比关系1:1:2组成的复合酶对桑叶在pH为6、温度为60℃条件下酶解1.5-2.5h，所述复合酶的用量为桑叶质量的1％，离心，得到滤液A和滤渣A，滤渣A置于乙醇溶液进行超声波萃取，过滤，得到滤液B，滤液A和滤液B混合并蒸发浓缩，α-淀粉酶、糖化酶和木瓜蛋白酶的，所述柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液的用量为使桑叶的终浓度为1g/14mL缓冲液-1g/16mL缓冲液。