CN101265252A - 笃斯越桔花青素及其分离纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明的笃斯越桔花青素及其分离纯化方法属于活性成分提取纯化和功能食品开发的技术领域。本发明的笃斯越桔花青素含量在29.8～40％，其中锦葵色素含量占花青素的4.68～5.48％；抗氧化活性是Vc的7.8～15倍。制备方法包括原料预处理、浸提浓缩、纯化浓缩、冻干4个过程。采用超声波、微波辅助冷浸提法分离，AB－8大孔树脂静态－动态相结合的吸附纯化法。本发明提供了一种“绿色、高效、低成本”的笃斯越桔花青素分离纯化技术，保证了产品抗氧化等生物活性和理想分离效果，为广泛利用笃斯越桔的丰富资源，推动系列笃斯越桔保健食品的产业化开发奠定了基础，体现出笃斯越桔深加工蕴涵的巨大经济效益和社会效益。

Description

笃斯越桔花青素及其分离纯化方法

技术领域

本发明属于功能活性成分提取纯化和功能食品开发的技术领域，涉及到一种从笃斯越桔果实中分离纯化获得花青素的方法。

背景技术

笃斯越桔(Vaccinium uliginosum L.)又名蓝莓、中国蓝莓、笃斯、地果、甸果、都柿等，隶属杜鹃花科(Ericaceae)越桔属(Vaccinium L.)，为亚灌木野生植物。在全世界共有130多种，主要分布于中国、俄罗斯、欧洲、北美、日本、朝鲜等北半球高纬度国家。我国主要集中在东北、内蒙古、新疆等地区。吉林省长白山地区野生笃斯越桔分布极广、产量大、资源丰富。笃斯越桔含有黄酮类化合物、多酚类化合物、多糖类化合物等多种功能因子，保健功能在食品领域和医药领域的作用倍受国内外众多学者关注，其研究热点主要集中在治疗眼科疾病、血管障碍、糖尿病并发症等方面，已经被联合国粮农组织列为人类五大健康食品之一。目前，国内外市场中笃斯越桔饮料和保健酒比较畅销，其他相关产品的研究与开发还相对较缓慢。

花青素(anthocyanidin)属酚类化合物中的类黄酮类，是一种水溶性色素，主要存在于水果蔬菜、花卉等植物细胞液中。自然条件下游离的花青素极少，在果实中以糖苷的形式存在，如常与一个或多个葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖等通过糖苷形成花青苷，花青苷中的糖苷基和羟基还可以与一个或几个分子的香豆酸、阿魏酸、咖啡酸、对羟基苯甲酸等芳香酸和脂肪酸通过酯键形成酰基化的花青苷。花青素具有类黄酮的典型结构，属于2-苯基苯并吡喃阳离子的衍生物，以C6-C3-C6为基本骨架，其结构式如下：

在自然界中常见是氯化物，花青素的氯化物结构式如下：

花青素是一种强有力的抗氧化剂，它能够保护人体免受一种叫做自由基的有害物质的损伤，现代医学已证明，花青素比维生素和茶酸等有更强的除去自由基的功能，此外还具有抗自由基作用、抗视力退化、抗癌作用及抗动脉硬化和血栓形成等特殊保健功效。现已知的花青素中有20多种花色素，但在食品中主要的有6种，即天竺葵色素、矢车菊色素、飞燕草色素、芍药色素、牵牛花色素和锦葵色素。花青素溶于水和乙醇、不溶于乙醚、氯仿等有机溶剂，遇醋酸铅试剂会深沉，并能被活性炭吸附，其颜色随pH不同而改变，在中性、接近中性条件下呈无色，而在酸性条件下显红色，且在可见光区465～560nm处和紫外光区270～280nm处有2个吸收波长范围，这也是研究花青素含量测定方法和研究分离纯化技术的基础。

与本发明相近的现有技术是一份申请日为2003年1月13日的名称为“越桔花青素的提取方法”的中国专利，公开号CN1517343，涉及越桔花青素提取方法的改进。用乙醇溶剂提取分离过滤，将滤液混合进浓缩机蒸掉乙醇，上大孔树脂吸附柱吸附至饱和，用净水冲洗吸附柱至无酸无色，再用5％～55％浓度的乙醇洗脱树脂得解吸液，将解吸液浓缩蒸掉乙醇，用水稀释后再经离子树脂吸附。除公开其工艺获得的越桔花青素纯度达到35％外，没有公开越桔花青素中锦葵色素含量和越桔花青素的抗氧化活性程度。

以上所述的现有的花青素的分离纯化方法中有很多因素制约着提取效果、产品纯度及其功效特性，主要表现在以下几个方面：

(1)花青素分离纯化方法是受花青素本身的性质及所达到目的影响，因为花青素在中性或弱碱性溶液中不稳定，多采用甲醇、乙醇、水等酸性的极性溶剂提取分离，但该方法同时分离出材料中由原花青素及花白素转化形成的花青素。

(2)笃斯越桔花青素对温度很敏感，长时间加热可使其降解、退色。

(3)食用花青素应更多注意安全性、着色力及稳定性。常用甲醇溶液浸提花青素可获得比较理想的提取效果，但是考虑到甲醇毒性问题而采用酸化乙醇替代，尽管其提取效果远不如甲醇的高。为获得更接近于天然状态的花色苷，常采用60％正丁醇、乙二醇、丙二醇、丙酮/甲醇/水混合物和水等中性溶剂做初步提取。

(4)由于初步分离得到的天然花青素产品，通常品质低，稳定性和着色性不好，需要进一步的纯化精制。

(5)高纯度花青素产品市场价格极其昂贵，因为在对花青素进行纯化过程中，仅用一种手段很难达到对其纯化的目的，往往需要借助两种或两种以上的手段进行配合，如可用柱层析初分离，再同时用薄层层析快速检测，再用制备高效液相分离出更纯的花青素类，因而其生产工艺极其复杂，没有大规模工业生产技术与设备，制约着应用领域和范围。

目前，发明人在《食品科学》杂志2007年第10期发表的笃斯越桔中花青素的含量分析方法研究论文，可以用于本发明笃斯越桔花青素粗品提取率和产品中花青素含量的检测方法；在《食品科学》杂志2007年第11期发表的纤维素酶法提取笃斯越桔花青素的试验研究，获得产品提取率4.533％；在《食品科学》杂志2007年第11期发表的笃斯越桔花青素的分离纯化试验研究中技术参数公开可以用于实施本发明笃斯越桔花青素产品纯化，获得产品纯度只能达20％。

发明内容

本发明所需要解决的技术问题是：公开一种能从长白山野生笃斯越桔中分离纯化获得笃斯越桔花青素的方法，使研制的笃斯越桔花青素产品，用紫外分光光度法检测花青素含量在29.8～40％，高效液相色谱法检测锦葵色素含量占花青素的4.68～5.48％；抗氧化活性是Vc的7.8～15倍。

本发明的技术方案是：

一种笃斯越桔花青素，其特征在于，是采用超声波、微波辅助冷浸提法分离后，采用AB-8大孔树脂静态、动态相结合的吸附纯化法获得的。

本发明的笃斯越桔花青素冻干粉，组分用紫外分光光度法检测花青素含量在29.8～40％，高效液相色谱法检测锦葵色素含量占花青素的4.68～5.48％；抗氧化活性是Vc的7.8～15倍。

本发明的笃斯越桔花青素的分离纯化方法，包括原料预处理、浸提浓缩、纯化浓缩的过程；其特征在于，

(1)所述的原料预处理过程，是将新鲜的笃斯越桔果实进行速冻处理得冷冻的笃斯越桔果实；或者在-18℃～-35℃环境下保藏备用；或者冻干至水分含量为5％以下，再粉碎至颗粒度为60～120目，制得笃斯越桔果实冻干粉，为下步浸提提供原料；

(2)所述的浸提浓缩过程，是将笃斯越桔冷冻果实或冻干粉在酸化乙醇溶液中采用超声波、微波辅助冷浸提法分离获得笃斯越桔花青素浸提液，再经减压浓缩处理至花青素含量为1.5～4.0mg/mL；其中：

①酸化乙醇溶液：乙醇与盐酸体积比：95∶5～70∶30，乙醇浓度50％～100％；

②浸提料液：按重量比笃斯越桔果实冻干粉∶酸化乙醇＝1∶25～1∶150；或者冷冻的笃斯越桔果实研磨至均匀浆液后投料，按重量比笃斯越桔果实浆料∶酸化乙醇＝9∶25～9∶150；

③超声功率200～600W，超声时间5～30min；

④微波功率在400～900W，微波时间4～10min；

⑤浸提温度10℃～40℃，浸提次数1～4次，浸提总时间为1～8h；

⑥减压浓缩：真空度为0.075～0.095Mpa，温度为45℃～60℃，浓缩至花青素含量为1.5～4.0mg/mL；

(3)所述的纯化浓缩过程，

是将笃斯越桔花青素浸提液浓缩液，采用柱层析AB-8大孔树脂静态、动态相结合吸附纯化以获得笃斯越桔花青素洗脱液，再经减压浓缩处理至原体积的1/5～1/20。

上述的纯化浓缩过程，可以用通常的纯化浓缩方法进行；最好用下列纯化浓缩方法进行：柱层析AB-8大孔树脂的径高比为1∶10～30，单柱或双柱串联；静态吸附条件：柱层析上样量为1～15mL/min，操作温度在30℃～50℃，吸附pH值2～6；动态吸附条件：洗脱液乙醇浓度为20～80％；洗脱流速为1.5～15mL/min；减压浓缩：真空度为0.075～0.095Mpa，温度为50～55℃，浓缩至原体积的1/5～1/20。

为制得笃斯越桔花青素冻干粉，对纯化浓缩过程得到的笃斯越桔花青素纯化浓缩液，进行冻干处理，制得笃斯越桔花青素冻干粉；所述的冻干处理，是经-40～-60℃冻干至水分含量为5％以下，包装保藏。

此外，所述的浓缩技术，也可采用超滤或减压蒸馏的方法。

本发明有益效果主要表现在：

①本发明设计的笃斯越桔花青素分离纯化技术真正体现了“绿色、高效、低成本”生产技术研究与开发，采用酸化乙醇和乙醇在笃斯越桔花青素浸提和纯化洗脱，不但安全可靠，而且还可回收重复利用而大大降低生产成本；微波、超声波辅助低温浸提工艺及冷冻干燥技术相结合，保证了笃斯越桔花青素的抗氧化等生物活性和理想分离效果，获得抗氧化活性高于Vc7.8倍的笃斯越桔花青素产品。

②本发明制备笃斯越桔花青素冻干粉，用紫外分光光度法检测花青素含量在29.8～40％，高效液相色谱法检测锦葵色素含量占花青素的4.68～5.48％；抗氧化活性是Vc的7.8～15倍。而报道，含量高25％的花色素提取物已经被收入法国药典；意大利、法国、西班牙、韩国、美国和新西兰已将其用于夜盲症、毛细血管硬化、脑血管障碍、胃溃疡的治疗；因此本发明成果将有利于增强视力，治疗眼病，以及开发降低心血管疾病患病几率和为开发应用于心血管疾病的药物奠定基础。

③本发明社会意义和经济意义大。本发明可以为广泛利用长白山笃斯越桔的丰富资源，大力开发和研制系列笃斯越桔保健食品，填补本领域研究的空白，为早日实现笃斯越桔保健食品产业化发展奠定基础，推动长白山笃斯越桔的综合开发进程，以实现笃斯越桔层层增值，真正体现出笃斯越桔深加工蕴涵的巨大经济效益和社会效益。

④在本发明的分离纯化方法中，经浸提过程或浓缩过程得到的浸提液或粗提浓缩液添加或不添加其他组分可以制成口服液、冲剂、胶囊、片剂(咀嚼片或含片)食用。

⑤本发明设计的工艺路线简捷，设备投入少，工业化推广可行。

⑥笃斯越桔花青素产品添加或不添加其他组分制作成抗氧化作用显著的食品色素广泛应用于饮料/冷饮制品、焙烤制品、酒类制品等各领域中。

具体实施方式

实施例1：

将新鲜的笃斯越桔果实剔除叶片、枝干等杂质，进行速冻处理得冷冻的笃斯越桔果实。取出在-18℃环境下保藏备用的笃斯越桔果实，进行研磨至均匀浆液后，采用超声波、微波辅助冷浸提法、冷冻干燥技术相结合方法制备笃斯越桔花青素。

浸提工艺条件：①酸化乙醇溶液：乙醇浓度100％，乙醇与盐酸体积比：95∶5；②浸提料液：按重量比笃斯越桔果实：酸化乙醇＝9∶150；③浸提温度10℃，浸提次数4次，浸提总时间为8h；④浸提前先超声处理，超声功率200W，超声时间30min；⑤浸提前先微波处理，微波功率在400W，微波时间10min。⑥浸提后减压浓缩：真空度可以为0.075～0.095Mpa，温度可以为60℃，浓缩至无乙醇味，花青素含量为4.0mg/mL。

纯化工艺条件：①单柱柱层析，AB-8大孔树脂的径高比为1∶30；②静态吸附条件：柱层析上样量为15mL/min；操作温度在50℃，吸附pH值2；③动态吸附条件：洗脱液乙醇浓度为80％；洗脱流速为1.5mL/mim；④减压浓缩：真空度可以为0.075～0.095Mpa，温度可以为55℃以下，浓缩至无乙醇味，且为原体积的1/20。

冻干工艺条件：将笃斯越桔花青素纯化浓缩液进行真空冷冻干燥，经-40℃冻干至水分含量为5％以下，包装保藏。

实施例2：

将新鲜的笃斯越桔果实剔除叶片、枝干等杂质，进行速冻处理得冷冻的笃斯越桔果实。取出在-35℃环境下保藏备用的笃斯越桔果实放入真空冷冻干燥机中冻干至水分含量为5％以下，再粉碎至颗粒度为100目，制得笃斯越桔果实冻干粉，采用超声波、微波辅助冷浸提法、冷冻干燥技术相结合方法制备笃斯越桔花青素。

浸提工艺条件：①酸化乙醇溶液：乙醇浓度50％，乙醇与盐酸体积比：70∶30；②浸提料液：按重量比笃斯越桔果实冻干粉∶酸化乙醇＝1∶25；③浸提温度40℃，浸提次数1次，浸提时间为1h；④浸提前先超声处理，超声功率600W，超声时间5min；⑤浸提前先微波处理，微波功率在600W，微波时间5min。⑥浸提后减压浓缩：真空度可以为0.075～0.095Mpa，温度可以为45℃，浓缩至无乙醇味，花青素含量为1.5mg/mL。

纯化工艺条件：①双柱串联柱层析AB-8大孔树脂的径高比为1∶10；②静态吸附条件：柱层析上样量为1mL/min；操作温度在30℃，吸附pH值6；③动态吸附条件：洗脱液乙醇浓度为20％；洗脱流速为15mL/min；④减压浓缩：真空度可以为0.075～0.095Mpa，温度可以为50℃以下，浓缩至无乙醇味，且为原体积的1/5。

冻干工艺条件：将笃斯越桔花青素纯化浓缩液进行真空冷冻干燥，经-60℃冻干至水分含量为5％以下，包装保藏。

本实施例可获得较高的纯度。

实施例3：

将新鲜的笃斯越桔果实剔除叶片、枝干等杂质，进行速冻处理得冷冻的笃斯越桔果实。取出在-18℃环境下保藏备用的笃斯越桔果实放入真空冷冻干燥机中冻干至水分含量为5％以下，再粉碎至颗粒度为80目，制得笃斯越桔果实冻干粉，采用超声波、微波辅助冷浸提法、冷冻干燥技术相结合方法制备笃斯越桔花青素。

浸提工艺条件：①酸化乙醇溶液：乙醇浓度80％，乙醇与盐酸体积比：85∶15；②浸提料液：按重量比笃斯越桔果实冻干粉∶酸化乙醇＝1∶100；③浸提温度30℃，浸提次数2次，浸提总时间为4h；④浸提前超声处理，超声功率500W，超声时间20min；⑤浸提前微波处理，微波功率在400W，微波时间20min。⑥浸提后减压浓缩：真空度可以为0.075～0.095Mpa，温度可以为50℃，浓缩至无乙醇味，花青素含量为3.0mg/mL。

纯化工艺条件：①单柱柱层析AB-8大孔树脂的径高比为1∶20；②静态吸附条件：柱层析上样量为5mL/min；操作温度在30℃，吸附pH值4；③动态吸附条件：洗脱液乙醇浓度为60％；洗脱流速为10mL/min；④减压浓缩：真空度可以为0.075～0.095Mpa，温度可以为55℃以下，浓缩至无乙醇味，且为原体积的1/10。

冻干工艺条件：将笃斯越桔花青素纯化浓缩液进行真空冷冻干燥，经-50℃冻干至水分含量为5％以下，包装保藏。

实施例4：

将新鲜的笃斯越桔果实剔除叶片、枝干等杂质，进行速冻处理得冷冻的笃斯越桔果实。取出在-35℃环境下保藏备用的笃斯越桔果实放入真空冷冻干燥机中冻干至水分含量为5％以下，再粉碎至颗粒度为70目，制得笃斯越桔果实冻干粉，采用超声波、微波辅助冷浸提法、冷冻干燥技术相结合方法制备笃斯越桔花青素。

浸提工艺条件：①酸化乙醇溶液：乙醇浓度90％，乙醇与盐酸体积比：80∶20；②浸提料液：按重量比笃斯越桔果实冻干粉∶酸化乙醇＝1∶150；③浸提温度30℃，浸提次数3次，浸提总时间为5h；④浸提前先微波处理，微波功率在400W，微波时间10min；⑤浸提前先超声处理，超声功率300W，超声时间20min；⑥减压浓缩：真空度可以为0.075～0.095Mpa，温度可以为50℃，浓缩至无乙醇味，花青素含量为2.0mg/mL。

纯化工艺条件：①柱层析AB-8大孔树脂的径高比为1∶30；双柱串联；②静态吸附条件：柱层析上样量为5mL/min；操作温度在50℃，吸附pH值6；③动态吸附条件：洗脱液乙醇浓度为60％；洗脱流速为4.5mL/min；④浸提后减压浓缩：真空度可以为0.075～0.095Mpa，温度可以为55℃以下，浓缩至无乙醇味，且为原体积的1/15。

冻干工艺条件：将笃斯越桔花青素纯化浓缩液进行真空冷冻干燥，经-60℃冻干至水分含量为5％以下，包装保藏。

本实施例获得较高的纯度。

实施例5：

将新鲜的笃斯越桔果实剔除叶片、枝干等杂质，进行速冻处理得冷冻的笃斯越桔果实，取出在-18℃环境下保藏备用的笃斯越桔果实，进行研磨至均匀浆液后，采用超声波、微波辅助冷浸提法、冷冻干燥技术相结合方法制备笃斯越桔花青素。

浸提工艺条件：①酸化乙醇溶液：乙醇浓度100％，乙醇与盐酸体积比：95∶5；②浸提料液：按重量比笃斯越桔果实∶酸化乙醇＝9∶150；③浸提温度10℃，浸提次数4次，浸提总时间为8h；④浸提前先超声处理，超声功率200W，超声时间30min；⑤浸提前先微波处理，微波功率在400W，微波时间10min。⑥浸提后减压浓缩：真空度可以为0.075～0.095Mpa，温度可以为60℃，浓缩至无乙醇味，花青素含量为4.0mg/mL。

纯化工艺条件和冻干工艺条件同实施例2。

本实施例获得较高的纯度。

实施例6：

将新鲜的笃斯越桔果实剔除叶片、枝干等杂质，进行速冻处理得冷冻的笃斯越桔果实，取出在-18℃环境下保藏备用的笃斯越桔果实，进行研磨至均匀浆液后，采用超声波、微波辅助冷浸提法、冷冻干燥技术相结合方法制备笃斯越桔花青素。

浸提工艺条件：①酸化乙醇溶液：乙醇浓度100％，乙醇与盐酸体积比：95∶5；②浸提料液：按重量比笃斯越桔果实∶酸化乙醇＝9∶80；③浸提温度10℃，浸提次数4次，浸提总时间为8h；④浸提前先超声处理，超声功率200W，超声时间30min；⑤浸提前先微波处理，微波功率在400W，微波时间10min。⑥浸提后减压浓缩：真空度可以为0.075～0.095Mpa，温度可以为60℃，浓缩至无乙醇味，花青素含量为4.0mg/mL。

纯化工艺条件和冻干工艺条件同实施例4。

实施例7：

将新鲜的笃斯越桔果实剔除叶片、枝干等杂质，进行速冻处理得冷冻的笃斯越桔果实，取出在-18℃环境下保藏备用的笃斯越桔果实，进行研磨至均匀浆液后，采用超声波、微波辅助冷浸提法、冷冻干燥技术相结合方法制备笃斯越桔花青素。

浸提工艺条件：①酸化乙醇溶液：乙醇浓度100％，乙醇与盐酸体积比：95∶5；②浸提料液：按重量比笃斯越桔果实∶酸化乙醇＝9∶100；③浸提温度10℃，浸提次数4次，浸提总时间为8h；④超声功率200W，超声时间30min；⑤微波功率在400W，微波时间10min。⑥减压浓缩：真空度可以为0.075～0.095Mpa，温度可以为60℃，浓缩至无乙醇味，花青素含量为4.0mg/mL。

纯化工艺条件和冻干工艺条件同实施例3。

实施例8：

将新鲜的笃斯越桔果实剔除叶片、枝干等杂质，进行速冻处理得冷冻的笃斯越桔果实，取出在-35℃环境下保藏备用的笃斯越桔果实放入真空冷冻干燥机中冻干至水分含量为5％以下，再粉碎至颗粒度为100目，制得笃斯越桔果实冻干粉，采用超声波、微波辅助冷浸提法、冷冻干燥技术相结合方法制备笃斯越桔花青素。

浸提工艺条件：①酸化乙醇溶液：乙醇浓度50％，乙醇与盐酸体积比：70∶30；②浸提料液：按重量比笃斯越桔果实冻干粉∶酸化乙醇＝1∶25；③浸提温度40℃，浸提次数1次，浸提时间为1h；④超声功率600W，超声时间5min；⑤微波功率在600W，微波时间5min。⑥减压浓缩：真空度可以为0.075～0.095Mpa，温度可以为45℃，浓缩至无乙醇味，花青素含量为1.5mg/mL。

纯化工艺条件和冻干工艺条件同实施例1。

实施例9：

将新鲜的笃斯越桔果实剔除叶片、枝干等杂质，进行速冻处理得冷冻的笃斯越桔果实，取出在-35℃环境下保藏备用的笃斯越桔果实放入真空冷冻干燥机中冻干至水分含量为5％以下，再粉碎至颗粒度为100目，制得笃斯越桔果实冻干粉，采用超声波、微波辅助冷浸提法、冷冻干燥技术相结合方法制备笃斯越桔花青素。

浸提工艺条件：①酸化乙醇溶液：乙醇浓度50％，乙醇与盐酸体积比：70∶30；②浸提料液：按重量比笃斯越桔果实冻干粉∶酸化乙醇＝1∶25；③浸提温度40℃，浸提次数1次，浸提时间为1h；④超声功率600W，超声时间5min；⑤微波功率在600W，微波时间5min。⑥减压浓缩：真空度可以为0.075～0.095Mpa，温度可以为45℃，浓缩至无乙醇味，花青素含量为1.5mg/mL。

纯化工艺条件和冻干工艺条件同实施例4。

实施例10：

将新鲜的笃斯越桔果实剔除叶片、枝干等杂质，进行速冻处理得冷冻的笃斯越桔果实，取出在-35℃环境下保藏备用的笃斯越桔果实放入真空冷冻干燥机中冻干至水分含量为5％以下，再粉碎至颗粒度为70目，制得笃斯越桔果实冻干粉，采用超声波、微波辅助冷浸提法、冷冻干燥技术相结合方法制备笃斯越桔花青素。

浸提工艺条件：①酸化乙醇溶液：乙醇浓度90％，乙醇与盐酸体积比：80∶20；②浸提料液：按重量比笃斯越桔果实冻干粉∶酸化乙醇＝1∶150；③浸提温度30℃，浸提次数3次，浸提总时间为5h；④超声功率300W，超声时间20min；⑤微波功率在400W，微波时间10min。⑥减压浓缩：真空度可以为0.075～0.095Mpa，温度可以为50℃，浓缩至无乙醇味，花青素含量为2.0mg/mL。

纯化工艺条件和冻干工艺条件同实施例1。

Claims (5)

1、一种笃斯越桔花青素，其特征在于，是采用超声波、微波辅助冷浸提法分离后，采用AB-8大孔树脂静态、动态相结合的吸附纯化法获得的。

2、按照权利要求1所述的笃斯越桔花青素，其特征在于，冻干粉状的笃斯越桔花青素组分用紫外分光光度法检测花青素含量在29.8～40％，高效液相色谱法检测锦葵色素含量占花青素的4.68～5.48％；抗氧化活性是Vc的7.8～15倍。

3、一种权利要求1的笃斯越桔花青素的分离纯化方法，包括原料预处理、浸提浓缩、纯化浓缩的过程；其特征在于

(1)所述的原料预处理过程，是将新鲜的笃斯越桔果实进行速冻处理得冷冻的笃斯越桔果实；或者在-18℃～-35℃环境下保藏备用；或者冻干至水分含量为5％以下，再粉碎至颗粒度为60～120目，制得笃斯越桔果实冻干粉，为下步浸提提供原料；

(2)所述的浸提浓缩过程，是将笃斯越桔冷冻果实或冻干粉在酸化乙醇溶液中采用超声波、微波辅助冷浸提法分离获得笃斯越桔花青素浸提液，再经减压浓缩处理至花青素含量为1.5～4.0mg/mL；其中：

①酸化乙醇溶液：乙醇与盐酸体积比：95∶5～70∶30，乙醇浓度50％～100％；

②浸提料液：按重量比笃斯越桔果实冻干粉∶酸化乙醇＝1∶25～1∶150；或者冷冻的笃斯越桔果实研磨至均匀浆液后投料，按重量比笃斯越桔果实浆料∶酸化乙醇＝9∶25～9∶150；

③超声功率200～600W，超声时间5～30min；

④微波功率在400～900W，微波时间4～10min；

⑤浸提温度10℃～40℃，浸提次数1～4次，浸提总时间为1～8h；

⑥减压浓缩：真空度为0.075～0.095Mpa，温度为45℃～60℃，浓缩至花青素含量为1.5～4.0mg/mL；

(3)所述的纯化浓缩过程，

是将笃斯越桔花青素浸提液浓缩液，采用柱层析AB-8大孔树脂静态、动态相结合吸附纯化以获得笃斯越桔花青素洗脱液，再经减压浓缩处理至原体积的1/5～1/20。

4、按照权利要求3所述的笃斯越桔花青素的分离纯化方法，其特征在于，所述的纯化浓缩过程，柱层析AB-8大孔树脂的径高比为1∶10～30，单柱或双柱串联；静态吸附条件：柱层析上样量为1～15mL/min，操作温度在30℃～50℃，吸附pH值2～6；动态吸附条件：洗脱液乙醇浓度为20～80％；洗脱流速为1.5～15mL/min；减压浓缩：真空度为0.075～0.095Mpa，温度为50～55℃，浓缩至原体积的1/5～1/20。

5、按照权利要求3所述的笃斯越桔花青素的分离纯化方法，其特征在于，对纯化浓缩过程得到的笃斯越桔花青素纯化浓缩液，进行冻干处理，制得笃斯越桔花青素冻干粉；所述的冻干处理，是经-40～-60℃冻干至水分含量为5％以下。