CN104109403A - 野生蓝莓花青素提取、纯化新方法 - Google Patents

野生蓝莓花青素提取、纯化新方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于天然有机化学领域，涉及一种从大兴安岭野生蓝莓果里提取、纯化花青素的方法，特别是涉及一种采用生物酶法、离子液体微波提取、超滤膜浓缩藕联高速逆流色谱纯化，最终得到高纯度蓝莓花青素的新方法。本发明优点：1、离子液体具有很强的微波吸收能力，离子液体微波提取法具有提取更快、更高效的优势，并且工艺简便易行，蓝莓花青素有效成分提取充分，花青素有效成分含量高。2、高速逆流色谱纯化技术相对于传统的固-液柱色谱技术，具有操作灵活、高效、分离速度快、制备量大、费用低等优点，并且可以工业化使用。本发明利用上述技术所得蓝莓花青素含量高、活性高，纯度最高可达42.7％。

Description

野生蓝莓花青素提取、纯化新方法
技术领域：
本发明属于天然有机化学领域，涉及一种从大兴安岭野生蓝莓果里提取、纯化蓝莓花青素的新方法，特别是涉及一种利用离子液体微波提取，高速逆流色谱分离纯化蓝莓花青素的新方法。
背景技术：
蓝莓(Blueberry)学名越桔，杜鹃花科越橘属植物。大多生长于我国大兴安岭以北原始森林之中。果实呈蓝色，果肉细腻，果味酸甜，风味独特，营养丰富。蓝莓花青素对人体视力的独特保健作用使其在保健食品、医学界深受欢迎。蓝莓花青素作为一种天然食用色素，安全、无毒、资源丰富，而且具有一定营养和药理作用，在食品、化妆、医药等方面有着巨大的应用潜力。
国内一般用有机溶剂提取法，近年来超声波提取和超临界流体萃取技术也时有介绍。传统方法有机溶剂提取需要几小时至十几小时，操作温度高且得率低，能耗大；超临界流体萃取一次性投资较大，不容易形成规模化。
本发明的不同之处在于主要采用生物酶解技术，离子液体微波提取，后期采用超滤膜低温浓缩、高速逆流色谱法分离纯化蓝莓花青素，产品不仅得率高，而且纯度高。所得提取物蓝莓花青素用HPLC进行检测，含量最高可达42.7％。
发明内容：
本发明方法全程采用非热力高效提取分离技术，提取快捷、产品纯度高。本发明优点：大大提高了萃取速度，同时极大提高花青素有效成分含量，克服了常规提取提取物纯度低、得率低的缺点。
本发明的目的在于克服常规技术提取率较低、提取纯度低等缺点，提供一种主要采用生物酶解技术，离子液体微波提取，超滤膜浓缩技术，后期采用高速逆流色谱法(HSCCC)分离纯化蓝莓花青素的新方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种采用生物酶法、离子液体微波提取、超滤膜浓缩藕联高速逆流色谱纯化，最终得到高纯度蓝莓花青素的新方法，其步骤如下：
(1)生物酶解：蓝莓果加入果胶酶与纤维素酶混合酶解，在一定酶浓度、酶解温度下，酶解时间2-3h；
(2)微波回流提取：加入一定体积百分浓度的离子液体水溶液，采用微波加热回流提取法，微波功率为400-600W，频率5000-10000MHz，在一定料液比下较低温度提取，提取两次，每次提取时间30-60min；
(3)收集：回收离子液体，薄层层析检测分析，收集蓝莓花青素部分；
(4)粗过滤：过滤，合并两次滤液，得蓝莓花青素粗提液；
(5)微孔过滤：粗提液用0.8um微孔过滤。膜压力0.2MPa，过滤温度50-60℃；
(6)超滤：采用一定截留分子量的超滤膜分离，膜操作压力为0.2-0.3MPa，截留率为90-95％；
(7)真空冷冻干燥：收集花青素溶液，在适当温度、干燥压力下冷冻干燥；
(8)分相：称取一定克数蓝莓花青素，选择HSCCC溶剂系统，按比例将各种溶剂加入分液漏斗中，震荡使溶液充分混合，放置过夜。分相平衡后分出上相和下相；
(9)HSCCC分离纯化：以溶剂系统的上相为固定相，下相为流动相，调整转速，以一定流速泵入HSCCC螺旋管，分离纯化蓝莓花青素提取物；
(10)检测：纯化后的蓝莓花青素用高效液相色谱法，紫外检测器在一定波长进行检测，花色苷含量为41％以上。
具体实施方式：
实施例1：一种采用生物酶法、离子液体微波提取、超滤膜浓缩藕联高速逆流色谱纯化，最终得到高纯度蓝莓花青素的新方法，其步骤如下：
(1)生物酶解：取10kg蓝莓鲜果，破碎后加入果胶酶与纤维素酶混合酶解，酶添加量0.2g／kg，酶解温度45℃，酶解时间2h；
(2)微波回流提取：将酶解后混合物加入体积百分浓度60％的1-烷基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐离子液体水溶液，采用微波加热回流提取法，微波功率为400W，频率5000MHz，料液比1：5，提取温度55℃，提取两次，每次提取时间0.5h；
(3)收集：回收离子液体，薄层层析检测分析，收集花青素部分；
(4)粗过滤：过滤，合并两次滤液，得蓝莓花青素粗提液；
(5)微孔过滤：粗提液用0.8um微孔过滤，膜压力0.2MPa，过滤温度60℃；
(6)超滤：采用截留分子量6000的超滤膜分离，膜操作压力为0.3MPa，截留率为90％，得液体花青素2.67kg；
(7)真空冷冻干燥：收集花青素溶液，预冻温度-20℃，工作压力25Pa，升华温度55℃，解析温度65℃，得花青素粉末75.17g；
(8)分相：称取2000mg蓝莓花青素，选择正己烷-醋酸乙酯-甲醇-水(2：3：5：2)作为HSCCC溶剂系统，按比例将各种溶剂加入分液漏斗中，震荡使溶液充分混合，放置过夜。分相平衡后分出上相和下相；
(9)HSCCC分离纯化：采用醋酸乙酯-甲醇-水溶剂系统的上相为固定相，下相为流动相，调整转速为800r／min，单次进样200mg，以2ml／min的流速，泵入HSCCC螺旋管，分离纯化蓝莓花青素提取物；
(10)检测：将HSCCC分离得到的流分挥干，得花青素紫色粉末1.46g。采用高效液相色谱法，紫外检测器在波长520nm处进行检测，花色苷含量为41.1％。
实施例2：一种采用生物酶法、离子液体微波提取、超滤膜浓缩藕联高速逆流色谱纯化，最终得到高纯度蓝莓花青素的新方法，其步骤如下：
(1)生物酶解：取50kg蓝莓鲜果，果胶酶与纤维素酶混合酶解，酶添加量0.25g／kg酶解温度50℃，酶解时间3h；
(2)微波回流提取：将酶解后混合物加入体积百分浓度70％的1-丁基-3-甲基咪唑氯盐离子液体水溶液，采用微波加热回流提取法，微波功率为600W，频率8000MHz，料液比1：8，提取温度60℃，提取两次，每次提取时间1h；
(3)收集：回收离子液体，薄层层析检测分析，收集花青素部分；
(4)粗过滤：过滤，合并两次滤液，得蓝莓花青素粗提液；
(5)微孔过滤：粗提液用0.8um微孔过滤，膜压力0.3MPa，过滤温度60℃；
(6)超滤：采用截留分子量8000的超滤膜分离，膜操作压力为0.3MPa，截留率为95％，得液体花青素13.5kg；
(7)真空冷冻干燥：收集花青素溶液，预冻温度-10℃，工作压力30Pa，升华温度50℃，解析温度60℃，得花青素粉末351.28g；
(8)分相：称取2000mg蓝莓花青素提取物，选择甲基叔丁基醚-正丁醇-乙腈-水(2：4：2：5)HSCCC溶剂系统，按比例将各种溶剂加入分液漏斗中，震荡使溶液充分混合，放置过夜。分相平衡后分出上相和下相；
(9)HSCCC分离纯化：以甲基叔丁基醚-乙腈-水溶剂的上相为固定相，下相为流动相，调整转速为1000r／min，单次进样200mg，以3ml／min的流速泵入流动相，分离纯化蓝莓花青素提取物；
(10)检测：将HSCCC分离得到的流分挥干，得花青素紫色粉末1.41g。采用高效液相色谱法，紫外检测器在波长540nm处进行检测，蓝莓花青素花色苷含量为42.7％。
实施例3：一种采用生物酶法、离子液体微波提取、超滤膜浓缩藕联高速逆流色谱纯化，最终得到高纯度蓝莓花青素的新方法，其步骤如下：
(1)生物酶解：取1kg蓝莓鲜果，果胶酶与纤维素酶混合酶解，酶添加量0.3g／kg酶解温度50℃，酶解时间2h；
(2)微波回流提取：将酶解后液体加入体积百分浓度50％的1-己基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐离子液体水溶液，采用微波加热回流提取法，微波功率为500W，频率10000MHz，料液比1：10，提取温度55℃，提取两次，每次提取时间1h；
(3)收集：回收离子液体，薄层层析检测分析，收集花青素部分；
(4)粗过滤：过滤，合并两次滤液，得蓝莓花青素粗提液；
(5)微孔过滤：粗提液用0.8um微孔过滤，膜压力0.2MPa，过滤温度60℃；
(6)超滤：采用截留分子量10000的超滤膜分离，膜操作压力为0.3MPa，截留率为95％，得液体花青素0.27kg；
(7)真空冷冻干燥：收集花青素溶液，预冻温度-15℃，工作压力35Pa，升华温度55℃，解析温度65℃，得花青素粉末7.26g；
(8)分相：称取1000mg蓝莓花青素提取物，选择氯仿-乙醇-水(5：4：3)HSCCC溶剂系统，按比例将各种溶剂加入分液漏斗中，震荡使溶液充分混合，放置过夜。分相平衡后分出上相和下相；
(9)HSCCC分离纯化：以氯仿-乙醇-水溶剂的上相为固定相)，下相为流动相，调整转速为900r／min，单次进样200mg，以2ml／min的流速泵入流动相，分离纯化蓝莓花青素提取物；
(10)检测：将HSCCC分离得到的流分挥干，得花青素粉末1.45g。采用高效液相色谱法，紫外检测器在波长560nm处进行检测，花色苷含量为41.3％。

Claims (7)

1.一种采用生物酶法、离子液体微波提取、超滤膜浓缩藕联高速逆流色谱纯化，最终得到高纯度蓝莓花青素的新方法，其步骤如下：
(1)生物酶解：蓝莓果加入果胶酶与纤维素酶混合酶解，在一定酶浓度、酶解温度下，酶解时间2-3h；
(2)微波回流提取：加入一定体积百分浓度的离子液体水溶液，采用微波加热回流提取法，微波功率为400-600W，频率5000-10000MHz，在一定料液比下较低温度提取，提取两次，每次提取时间30-60min；
(3)收集：回收离子液体，薄层层析检测分析，收集蓝莓花青素部分；
(4)粗过滤：过滤，合并两次滤液，得蓝莓花青素粗提液；
(5)微孔过滤：粗提液用0.8um微孔过滤。膜压力0.2MPa，过滤温度50-60℃；
(6)超滤：采用一定截留分子量的超滤膜分离，膜操作压力为0.2-0.3MPa，截留率为90-95％；
(7)真空冷冻干燥：收集花青素溶液，在适当温度、干燥压力下冷冻干燥；
(8)分相：称取一定克数蓝莓花青素，选择HSCCC溶剂系统，按比例将各种溶剂加入分液漏斗中，震荡使溶液充分混合，放置过夜。分相平衡后分出上相和下相；
(9)HSCCC分离纯化：以溶剂系统的上相为固定相，下相为流动相，调整转速，以一定流速泵入流动相，分离纯化蓝莓花青素提取物；
(10)检测：纯化后的蓝莓花青素用高效液相色谱法，紫外检测器在一定波长进行检测，花色苷含量为41％以上。
2.根据权利要求1所述的采用生物酶法、离子液体微波提取、超滤膜浓缩藕联高速逆流色谱纯化，最终得到高纯度蓝莓花青素的新方法，其特征是：在所述的步骤(1)中，酶浓度0.2-0.3g／kg，酶解温度45-50℃。
3.根据权利要求2所述的采用生物酶法、离子液体微波提取、超滤膜浓缩藕联高速逆流色谱纯化，最终得到高纯度蓝莓花青素的新方法，其特征是：在所述的步骤(2)中，离子液体体积百分浓度为50％-70％；离子液体为1-烷基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐、1-丁基-3-甲基咪唑氯盐、1-己基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐中的任意一种；料液比为1：5-10；微波提取温度为55-60℃。
4.根据权利要求3所述的采用生物酶法、离子液体微波提取、超滤膜浓缩藕联高速逆流色谱纯化，最终得到高纯度蓝莓花青素的新方法，其特征是：在所述的步骤(6)中，超滤膜截留分子量为6000-10000。
5.根据权利要求4所述的采用生物酶法、离子液体微波提取、超滤膜浓缩藕联高速逆流色谱纯化，最终得到高纯度蓝莓花青素的新方法，其特征是：在所述的步骤(7)中，预冻温度-10至-20℃，工作压力25-35Pa，升华温度50-55℃，解析温度60-65℃。
6.根据权利要求5所述的采用生物酶法、离子液体微波提取、超滤膜浓缩藕联高速逆流色谱纯化，最终得到高纯度蓝莓花青素的新方法，其特征是：在所述的步骤(8)中，HSCCC溶剂系统为正己烷-醋酸乙酯-甲醇-水(2：3：5：2)、甲基叔丁基醚-正丁醇-乙腈-水(2：4：2：5)、氯仿-乙醇-水(5：4：3)中的任意一种。
7.根据权利要求6所述的采用生物酶法、离子液体微波提取、超滤膜浓缩藕联高速逆流色谱纯化，最终得到高纯度蓝莓花青素的新方法，其特征是：在所述的步骤(9)中，分离时螺旋管转速为800-1000r／min，流速为2-3ml／min。
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