CN112813048A - 用作固定化脂肪酶涂层的组合物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本申请提供了用作固定化脂肪酶涂层的组合物及其制备方法和应用。本申请所提供的用作固定化脂肪酶涂层的组合物包含壳寡糖和二氧化硅，涂覆于固定化脂肪酶后，能够显著提高固定化脂肪酶的酯交换反应活力并延长其使用寿命。

Description

用作固定化脂肪酶涂层的组合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及酶工程领域，具体涉及一种固定化脂肪酶涂层及其制备方法和应用。
背景技术
脂肪酶是一种工业中常用的生物催化剂，广泛存在于动植物和微生物体内。脂肪酶在油脂酯交换、油脂催化水解及油脂精炼加工领域均得到了广泛的应用。
脂肪酶应用于油脂酯交换反应通常需要进行固定化。固定化脂肪酶的工业应用依赖于其活力与稳定性。在固定化脂肪酶酯交换过程中，除了酶本身的因素外，系统中的其它因素，如系统的水活度、反应温度、反应时间、溶剂、底物品质等都会对固定化脂肪酶的活力及稳定性产生影响。
目前已有一些尝试以推动固定化脂肪酶催化酯交换的工业应用。例如，美国专利US8349594B2中，描述了一种提高脂肪酶酯交换反应寿命的方法，该方法先将原料油与磷酸或柠檬酸接触除去其中的金属，然后加入碱，再加入脂肪酶进行酯交换反应。日本专利JP08-140689中，描述了利用离子交换树脂Duolite A-7处理棕榈油与油酸乙酯的混合底物，使固定化Rhizopus脂肪酶的寿命由3天提高到了8天。然而，这些方法由于步骤繁琐而不利于工业操作，并且成本高而不适合工业应用。
因此，为了实现固定化脂肪酶催化酯交换的工业应用，仍然需要开发提高固定化脂肪酶活力和寿命的方法。
发明概述
一方面，本申请提供了用作固定化脂肪酶涂层的组合物，其包含壳寡糖和二氧化硅，且壳寡糖和二氧化硅的质量比为1:50～50:1。在一实施方案中，用作固定化脂肪酶涂层的组合物包含的壳寡糖和二氧化硅的质量比为1:20～10:1，优选1:10～10:1。
在另一实施方案中，用作固定化脂肪酶涂层的组合物包含的壳寡糖和二氧化硅的质量比为1:10。
在一实施方案中，用作固定化脂肪酶涂层的组合物包含的壳寡糖的数均分子量为1200～5000。
在一实施方案中，用作固定化脂肪酶涂层的组合物包含的壳寡糖的数均分子量为1500～4500。在另一实施方案中，用作固定化脂肪酶涂层的组合物包含的壳寡糖的-NH2基团质量分数为4％～9％。
在另一实施方案中，用作固定化脂肪酶涂层的组合物包含的壳寡糖的-NH2基团质量分数为7％～9％。
在一实施方案中，用作固定化脂肪酶涂层的组合物包含的二氧化硅粒径为10～100μm。
在一实施方案中，用作固定化脂肪酶涂层的组合物包含的二氧化硅粒径为10～60μm。
另一方面，本申请提供了将上述组合物用作固定化脂肪酶涂层的用途。
又一方面，本申请提供了制备固定化脂肪酶涂层的方法，其包括：将壳寡糖溶于水中，加入二氧化硅混匀。
在一实施方案中，壳寡糖与水的质量体积比(mg/mL)为10:1～5。在另一实施方案中，壳寡糖与水的质量体积比(mg/mL)为10:3。在一实施方案中，壳寡糖与二氧化硅的质量比为1:50～50:1。在另一实施方案中，壳寡糖与二氧化硅的质量比为1:20～10:1，优选1:10～10:1)。在另一实施方案中，壳寡糖与二氧化硅的质量比为1:10。
在一实施方案中，壳寡糖的数均分子量为1200～5000。另一实施方案中，壳寡糖的数均分子量为1500～4500。
壳寡糖的-NH2基团质量分数为4％～9％。另一实施方案中，壳寡糖的-NH2基团质量分数为7％～9％。
在一实施方案中，二氧化硅粒径为10～100μm。另一实施方案中，二氧化硅粒径为10～60μm。
又一方面，本申请还提供了固定化脂肪酶，其包含上述组合物作为涂层，其中以固定化脂肪酶总质量计，涂层的质量分数为10％～60％。在一实施方案中，以固定化脂肪酶总质量计，涂层的质量分数为10％～30％。
进一步地，本申请还提供了制备固定化脂肪酶的方法，其包括：采用流化床制粒或包衣方法，将上述组合物间歇式涂覆于固定化脂肪酶，其中进风温度为10～30℃，涂覆结束后于20～60℃下继续流化干燥，直至水分达到2％～10％。
进一步地，本申请还提供了上述固定化脂肪酶在催化酯交换反应中的用途。
本申请提供的用作固定化脂肪酶涂层的组合物，涂覆于固定化脂肪酶后，能够显著提高固定化脂肪酶的酯交换反应活力并延长其使用寿命。此外，本申请提供的方法使用简单方便，无需增加催化反应前处理步骤。
具体实施方案
应当理解，下文描述的方法中的各个步骤并不一定是实施本申请的方法的必要或全部步骤，一些步骤可以被省略，可以被其他相似步骤替换，或者也可以增加一些其他步骤。
此外，还应当理解，下文描述的各个技术特征(例如，参数值和范围)并不局限于其所在语境的具体实施方案，而是可以在本领域技术人员所能预见的合理情况下与其他技术特征进行任意地组合。
本申请发明人经过不断尝试和研究，开发了用于涂覆固定化脂肪酶的涂层，能够显著提高固定化脂肪酶活力并延长其使用寿命。
本申请所提供的涂层，适用于目前可利用的任何固定化脂肪酶，例如，可通过商购直接获得的固定化脂肪酶Lipozyme TL IM(诺维信(中国)生物技术有限公司)，LipozymeRM IM(诺维信(中国)生物技术有限公司)，Novozyme 435(诺维信(中国)生物技术有限公司)，Lipase PL(名糖糖株式会社)，Lipase QLM(名糖糖株式会社)，Lipase SL(名糖株式会社)，Lipase TL(名糖糖株式会社)，Lipase DF“Amano”15(天野酶制品株式会社)，Lipase G“Amano”50(天野酶制品株式会社)，Lipase R“Amano”(天野酶制品株式会社)等。
此外，本申请所提供的涂层，同样适用于自制的固定化脂肪酶，例如利用有机或无机粉末或颗粒为载体(包括但不限于二氧化硅、淀粉、树脂、麦芽糊精、硅藻土、白土等中的一种或多种组合)自制的固定化脂肪酶，其中脂肪酶可以是一种来源的脂肪酶，也可为多种来源的脂肪酶的混合物，其来源例如是来自动物或植物的脂肪酶，如猪胰脂肪酶，也可以是来自微生物的脂肪酶，如来自疏绵状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)、米黑毛霉(Mucor miehei)、萤光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、黑曲霉(Aspergillusniger)、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)、解脂假丝酵母(Candida lipolytica)、根霉(Rhizopus sp.)等中的任何一种或其基因改造菌种。
除非特别说明，本文所使用的术语“壳寡糖”，又被称为壳聚寡糖、低聚壳聚糖，是由壳聚糖经解聚得到的聚合度在2～30之间的寡糖，其分子量范围为400～6000
除非特别说明，本文所使用的术语“二氧化硅”，是指水合无定型二氧化硅，是一种白色、无毒、无定型微细粉状物，具有多孔性、高分散、质轻、化学稳定性好等优异性能。例如，所述的二氧化硅灼烧失重0％～5％，干燥减量0％～10％，pH值2～8，比表面积≥150m2/g，孔容0.5-2.0ml/g。
除非特别说明，本文所使用的术语“流化床顶喷制粒方法”，又被称为流化床喷雾制粒，或沸腾制粒，其过程为将颗粒置于流化床的流化室内，通入空气，使颗粒处于沸腾状态，再将经预处理的料液，通过流化室顶端的喷嘴，以雾状喷于颗粒表面，继续流化至颗粒水量适宜。
除非特别说明，本文所使用的术语“流化床包衣方法”，又被称为Wurster系统，将颗粒置于物料槽隔圈外侧，通入空气，控制气流强度使颗粒处于沸腾状态，包衣液通过位于筛底的雾化器雾化，当颗粒通过包衣区时，雾化的包衣液被喷射到颗粒表面并在表面铺展，当颗粒连续循环地通过包衣区，最终形成均匀连续的衣膜。
以下举出实施例具体地说明本发明，但是本发明并非仅限于这些实施例。除非特别指明，以下实施例中所使用的仪器、设备和试剂均可通过商购获得。
在以下实施例中，壳寡糖的数均分子量采用乙酰丙酮法测定，具体请参见韩宝芹等，乙酰丙酮法测定甲壳胺寡糖数均分子量[J]，中国海洋药物,2004,23(6):13-15；-NH2基团的质量分数采用胶体滴定法测定，具体请参见王伟等，胶体滴定法测定壳聚糖的氨基含量[J]，日用化学工业,1989,(2):36-38。
实施例1制备固定化脂肪酶涂层并将其涂覆于固定化脂肪酶
1、将1g壳聚糖(青岛百成海洋生物资源有限公司，脱乙酰度87％，-NH2基团质量分数8.7％，分子量6.36×105)溶于300mL 1％的醋酸溶液，所得溶液命名为涂层1
将涂层1置于沸腾式流化床(Midi Glatt)，采用顶喷制粒方法间歇式涂覆于30g固定化脂肪酶Lipozyme TL IM(诺维信(中国)生物技术有限公司)，进风温度15℃。
待所有液体喷完后，将进风温度调为40℃继续沸腾流化，控制最终固定化酶的水分约为5％。所得涂层后的固定化脂肪酶命名为酶1。
2、将1g壳聚糖(青岛百成海洋生物资源有限公司，脱乙酰度87％，-NH2基团质量分数8.7％，分子量6.36×105)溶于300mL 1％的醋酸溶液，加入10g二氧化硅(青岛博瑞特硅能科技有限公司，B1010，平均粒径13.2μm)充分搅拌混合均匀，所得溶液命名为涂层2。
将涂层2置于沸腾式流化床(Midi Glatt)，采用顶喷制粒方法间歇式喷于30g固定化脂肪酶Lipozyme TL IM(诺维信(中国)生物技术有限公司)，进风温度15℃。
待所有液体喷完后，将进风温度调为40℃继续沸腾流化，控制最终固定化酶的水分约为5％。所得涂层后的固定化脂肪酶命名为酶2。
3、将1g壳寡糖(青岛博智汇力生物科技有限公司，-NH2基团质量分数8.3％，数均分子量3300)溶于300mL水中，所得溶液命名为涂层3。
将涂层3置于沸腾式流化床(Midi Glatt)，采用顶喷制粒方法间歇式涂覆于30g固定化脂肪酶Lipozyme TL IM(诺维信(中国)生物技术有限公司)，进风温度15℃。
待所有液体喷完后，将进风温度调为40℃继续沸腾流化，控制最终固定化酶的水分约为5％。所得涂层后的固定化脂肪酶命名为酶3。
4、将1g壳寡糖(浙江金壳药业股份有限公司，-NH2基团质量分数7.9％，数均分子量1560)溶于300mL水中，加入10g二氧化硅(青岛博瑞特硅能科技有限公司，B1010，平均粒径13.2μm)充分搅拌混合均匀，所得溶液命名为涂层4。
将涂层4置于沸腾式流化床(Midi Glatt)，采用顶喷制粒方法间歇式喷于30g固定化脂肪酶Lipozyme TL IM(诺维信(中国)生物技术有限公司)，进风温度15℃。
待所有液体喷完后，将进风温度调为40℃继续沸腾流化，控制最终固定化酶的水分约为7％。所得涂层后的固定化脂肪酶命名为酶4。
5、将1g壳寡糖(青岛博智汇力生物科技有限公司，-NH2基团质量分数8.3％，数均分子量3300)溶于300mL水中，加入10g二氧化硅(邱博，Zeofree，平均粒径23.2μm)充分搅拌混合均匀，所得溶液命名为涂层5。
将涂层5置于沸腾式流化床(Midi Glatt)，采用顶喷制粒方法间歇式喷于50g固定化脂肪酶Lipozyme TL IM(诺维信(中国)生物技术有限公司)，进风温度15℃。
待所有液体喷完后，将进风温度调为40℃继续沸腾流化，控制最终固定化酶的水分约为5％。所得涂层后的固定化脂肪酶命名为酶5。
6、将1g壳寡糖(山东昌瑞生物科技有限公司，-NH2基团质量分数8.8％，数均分子量4430)溶于300mL水中，加入10g二氧化硅(福斯曼，Y60，平均粒径60μm)充分搅拌混合均匀，所得溶液命名为涂层6。
将涂层6置于沸腾式流化床(Midi Glatt)，采用顶喷制粒方法间歇式喷于20g固定化脂肪酶Lipozyme TL IM(诺维信(中国)生物技术有限公司)，进风温度15℃。
待所有液体喷完后，将进风温度调为40℃继续沸腾流化，控制最终固定化酶的水分约为5％。所得涂层后的固定化脂肪酶命名为酶6。
7、将1g壳寡糖(宝莱生物科技有限公司，-NH2基团质量分数1.9％，数均分子量3100)溶于300mL水中，加入10g二氧化硅(邱博，Zeofree，平均粒径23.2μm)充分搅拌混合均匀，所得溶液命名为涂层7。
将涂层7置于沸腾式流化床(Midi Glatt)，采用顶喷制粒方法间歇式喷于30g固定化脂肪酶Lipozyme TL IM(诺维信(中国)生物技术有限公司)，进风温度15℃。
待所有液体喷完后，将进风温度调为40℃继续沸腾流化，控制最终固定化酶的水分约为5％。所得涂层后的固定化脂肪酶命名为酶7。
8、将1g壳寡糖(青岛博智汇力生物科技有限公司，-NH2基团质量分数8.3％，数均分子量3300)溶于300mL水中，加入10g二氧化硅(德固赛，平均粒径2.3μm)充分搅拌混合均匀，所得溶液命名为涂层8。
将涂层8置于沸腾式流化床(Midi Glatt)，采用顶喷制粒方法间歇式喷于30g固定化脂肪酶Lipozyme TL IM(诺维信(中国)生物技术有限公司)，进风温度15℃。
待所有液体喷完后，将进风温度调为40℃继续沸腾流化，控制最终固定化酶的水分约为5％。所得涂层后的固定化脂肪酶命名为酶8。
9、将1g壳寡糖(实验室自制：用0.03g/mL脱乙酰度95％的壳聚糖为底物，加入5U/g的壳聚糖酶，pH5.0，50℃，水解20min灭酶后离心将上清冷冻干燥所得，-NH2基团质量分数8.1％，数均分子量20000)溶于300mL水中，加入10g二氧化硅(邱博，Zeofree，平均粒径23.2μm)充分搅拌混合均匀，所得溶液命名为涂层9。
将涂层9置于沸腾式流化床(Midi Glatt)，采用顶喷制粒方法间歇式喷于30g固定化脂肪酶Lipozyme TL IM(诺维信(中国)生物技术有限公司)，进风温度15℃。
待所有液体喷完后，将进风温度调为40℃继续沸腾流化，控制最终固定化酶的水分约为5％。所得涂层后的固定化脂肪命名为酶9。
10、将10g二氧化硅(邱博，Zeofree，平均粒径23.2μm)分散于300mL水中，充分搅拌混合均匀，所得溶液命名为涂层10。
将涂层10置于沸腾式流化床(Midi Glatt)，采用顶喷制粒方法间歇式喷于30g固定化脂肪酶Lipozyme TL IM(诺维信(中国)生物技术有限公司)，进风温度15℃。
待所有液体喷完后，将进风温度调为40℃继续沸腾流化，控制最终固定化酶的水分约为5％。所得涂层后的固定化脂肪酶命名为酶10。
11、将1g壳寡糖(青岛博智汇力生物科技有限公司，-NH2基团质量分数8.3％，数均分子量3300)溶于300mL水中，加入10g二氧化硅(邱博，Zeofree，平均粒径23.2μm)充分搅拌混合均匀，所得溶液命名为涂层11。
将涂层11置于沸腾式流化床(Midi Glatt)，采用顶喷制粒方法间歇式喷于30g固定化脂肪酶Lipozyme RM IM(诺维信(中国)生物技术有限公司)，进风温度15℃。
待所有液体喷完后，将进风温度调为40℃继续沸腾流化，控制最终固定化酶的水分约为5％。所得涂层后的固定化脂肪酶命名为酶11。
12、将1g山梨糖醇(国药，分子量182.17)溶于300mL水中，加入10g二氧化硅(福斯曼，Y60，平均粒径60μm)充分搅拌混合均匀，所得溶液命名为涂层12。
将涂层12置于沸腾式流化床(Midi Glatt)，采用顶喷制粒方法间歇式喷于30g固定化脂肪酶Lipozyme TL IM(诺维信(中国)生物技术有限公司)，进风温度15℃。
待所有液体喷完后，将进风温度调为40℃继续沸腾流化，控制最终固定化酶的水分约为7％。所得涂层后的固定化脂肪酶命名为酶12。
13、将1g壳寡糖(浙江金壳药业股份有限公司，-NH2基团质量分数8.6％，数均分子量720)溶于300mL水中，加入10g二氧化硅(福斯曼，Y60，平均粒径60μm)充分搅拌混合均匀，所得溶液命名为涂层13。
将涂层13置于沸腾式流化床(Midi Glatt)，采用顶喷制粒方法间歇式喷于30g固定化脂肪酶Lipozyme TL IM(诺维信(中国)生物技术有限公司)，进风温度15℃。
待所有液体喷完后，将进风温度调为40℃继续沸腾流化，控制最终固定化酶的水分约为7％。所得涂层后的固定化脂肪酶命名为酶13。
14、将1g鱼精蛋白(江西百盈生物技术有限公司，数均分子量约4000)溶于300mL水中，加入10g二氧化硅(福斯曼，Y60，平均粒径60μm)充分搅拌混合均匀，所得溶液命名为涂层14。
将涂层14置于沸腾式流化床(Midi Glatt)，采用顶喷制粒方法间歇式喷于30g固定化脂肪酶Lipozyme TL IM(诺维信(中国)生物技术有限公司)，进风温度15℃。
待所有液体喷完后，将进风温度调为40℃继续沸腾流化，控制最终固定化酶的水分约为7％。所得涂层后的固定化脂肪酶命名为酶14。
15、将1g麦芽糊精(罗盖特)溶于300mL水中，加入10g二氧化硅(福斯曼，Y60，平均粒径60μm)充分搅拌混合均匀，所得溶液命名为涂层15。
将涂层15置于沸腾式流化床(Midi Glatt)，采用顶喷制粒方法间歇式喷于30g固定化脂肪酶Lipozyme TL IM(诺维信(中国)生物技术有限公司)，进风温度15℃。
待所有液体喷完后，将进风温度调为40℃继续沸腾流化，控制最终固定化酶的水分约为7％。所得涂层后的固定化脂肪酶命名为酶15。
16、将1g壳寡糖(国药集团化学试剂有限公司，-NH2基团质量分数10％，数均分子量3300)溶于300mL水中，加入10g二氧化硅(邱博，Zeofree，，平均粒径23.2μm)充分搅拌混合均匀，所得溶液命名为涂层16。
将涂层16置于沸腾式流化床(Midi Glatt)，采用顶喷制粒方法间歇式喷于50g固定化脂肪酶Lipozyme TL IM(诺维信(中国)生物技术有限公司)，进风温度15℃。
待所有液体喷完后，将进风温度调为40℃继续沸腾流化，控制最终固定化酶的水分约为5％。所得涂层后的固定化脂肪酶命名为酶16。
17、将1g壳寡糖(山东昌瑞生物科技有限公司，-NH2基团质量分数8.8％，数均分子量4430)溶于300mL水中，加入10g白土(福斯曼，Y60，，平均粒径60μm)充分搅拌混合均匀，所得溶液命名为涂层17。
将涂层17置于沸腾式流化床(Midi Glatt)，采用顶喷制粒方法间歇式喷于20g固定化脂肪酶Lipozyme TL IM(诺维信(中国)生物技术有限公司)，进风温度15℃。
待所有液体喷完后，将进风温度调为40℃继续沸腾流化，控制最终固定化酶的水分约为5％。所得涂层后的固定化脂肪酶命名为酶17。
18、将1g壳寡糖(山东昌瑞生物科技有限公司，-NH2基团质量分数8.8％，数均分子量4430)溶于170mL水中，在130mL水中加入20g Lipozyme TL IM(诺维信(中国)生物技术有限公司)，将二者搅拌均匀，所得溶液命名为涂层18。
将涂层18置于沸腾式流化床(Midi Glatt)，采用顶喷制粒方法间歇式喷于10g二氧化硅(福斯曼，Y60，平均粒径60μm)，进风温度15℃。
待所有液体喷完后，将进风温度调为40℃继续沸腾流化，控制最终固定化酶的水分约为5％。所得涂层后的固定化脂肪酶命名为酶18。
将以上各涂层原料组成总结如表1所示。
表1各涂层原料组成
Figure BDA0002276854290000101
Figure BDA0002276854290000111
其中，1和2为壳聚糖，3-11，13和16-18为壳寡糖；除1和2溶解于300ml 1％醋酸溶液之外，其余均溶解于300mL水；17中利用白土替代了二氧化硅。
将所制备的涂层利用顶喷制粒方法间歇式喷涂于固定化脂肪酶，除11的固定化脂肪酶为30g Lipozyme RM IM(丹麦诺维信)之外，其他的固定化脂肪酶均为Lipozyme TL IM(丹麦诺维信)(其中除5和16为50g，6，17和18为20g之外，其余均为30g)。
实施例2涂层后的固定化脂肪酶的酯交换活力测定
以三棕榈酸硬脂精和油酸作为反应底物(质量比1:2)，各涂层后的固定化脂肪酶添加量为0.06g/g底物，60℃下反应6小时为一批实验，一批实验结束后，分离出产物，向剩下的固定化脂肪酶中重新加入新的底物，采用相同条件进行下一批的实验。固定化脂肪酶反应批次越多，说明其寿命越长，稳定性越好。
反应结束后分离出产物，用分子蒸馏除去产物中的游离脂肪酸后，参照“GB5009.168-2016《食品安全国家标准食品中脂肪酸的测定》”中的归一化法，对剩余产物的脂肪酸组成进行测定。
表2显示了各涂层后的固定化脂肪酶的油酸插入率(即油酸占总脂肪酸的百分比)。油酸插入率越高，表明固定化脂肪酶的酯交换活力越高。
表2固定化脂肪酶酯交换产物油酸插入率(％)
酶编号 1批 2批 3批 4批 5批 6批 7批 8批 9批 10批
TL IM 40.5 35.0 30.6 20.7 9.9 4.3 / / / /
1 30.5 19.8 9.5 / / / / / / /
2 30.6 19.5 9.7 / / / / / / /
3 41.1 36.7 33.8 30.6 25.5 18.3 8.2 / / /
4 45.8 45.8 45.6 45.6 45.3 45.2 45.0 44.8 44.5 43.9
5 48.7 48.6 48.6 48.4 48.3 48.0 47.9 47.8 47.8 47.4
6 50.6 50.6 50.5 50.4 50.4 49.8 50.0 49.7 49.5 49.6
7 40.8 35.4 27.7 18.3 8.5 / / / / /
8 29.3 19.6 9.1 / / / / / / /
9 42.1 36.9 31.8 21.2 10.3 5.7 / / / /
10 38.2 32.7 27.3 18.8 8.8 3.9 / / / /
RM IM 43.5 43.4 42.1 36.2 24.3 14.8 8.3 / / /
11 45.7 45.7 45.6 45.7 45.6 45.5 45.3 44.9 44.5 44.7
12 28.8 17.9 8.2 / / / / / / /
13 36.5 32.6 25.5 10.2 4.1 / / / / /
14 27.6 16.6 9.1 / / / / / / /
15 35.1 30.3 20.1 7.6 / / / / / /
16 39.6 35.9 32.9 28.1 17.3 6.5 / / / /
17 41.2 37.1 33.0 19.9 7.5 / / / / /
18 28.9 9.1 / / / / / / / /
以上结果显示，利用壳聚糖(1和2)或者其他含氨基或糖醇的组分(12，14和15)替代壳寡糖，或者其他吸附剂如白土(17)替代二氧化硅，或者单独的壳寡糖(3)或二氧化硅(10)或者壳寡糖和脂肪酶单纯混合(18)来制备涂层，即使其他组分和制备工艺完全相同，对固定化酶进行涂覆后反而降低或未改变固定化酶活性。
进一步地，发现涂层中所使用壳寡糖的分子量和氨基含量、二氧化硅粒径均会产生影响涂层后固定化酶的活性或稳定性。例如，在完全溶解于水溶液的状态下壳寡糖的分子量过低(13)或过高(9)，壳寡糖的氨基含量过低(7)或过高(16)，均无法提高固定化酶的活性和/或稳定性。此外，发现二氧化硅粒径也会有一定的影响(8)。
可见，采用特定的壳寡糖和二氧化硅制备的涂层涂覆固定化酶(4、5、6和11)，使得固定化酶具有较高的酯交换活力和使用稳定性，能够显著提高固定化酶的活性并延长其使用寿命。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用以限定本发明的实质技术内容范围，本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中，任何他人完成的技术实体或方法，若是与申请的权利要求范围所定义的完全相同，也或是一种等效的变更，均将被视为涵盖于该权利要求范围之中。

Claims (10)

1.用作固定化脂肪酶涂层的组合物，其包含壳寡糖和二氧化硅，且壳寡糖和二氧化硅的质量比为1:50～50:1，优选1:20～10:1，更优选1:10。
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述壳寡糖的数均分子量为1200～5000，优选1500～4500；和/或任选地，所述壳寡糖的-NH2基团质量分数为4％～9％，优选7％～9％。
3.如权利要求1或2所述的组合物，其中所述二氧化硅粒径为10～100μm，优选10～60μm。
4.权利要求1至3中任一项所述的组合物用作固定化脂肪酶涂层的用途。
5.制备固定化脂肪酶涂层的方法，其包括：将壳寡糖溶于水中，加入二氧化硅混匀，其中壳寡糖与水的质量体积比(mg/mL)为10:1～5，优选10:3；壳寡糖与二氧化硅的质量比为1:50～50:1，优选1:20～10:1，更优选1:10。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述壳寡糖的数均分子量为1200～5000，优选1500～4500；
任选地，所述壳寡糖的-NH2基团质量分数为4％～9％，优选7％～9％；
任选地，所述二氧化硅粒径为10～100μm，优选10～60μm。
7.固定化脂肪酶，其包含权利要求1至3中任一项所述的组合物作为涂层，其中以固定化脂肪酶总质量计，涂层的质量分数为10％～60％，优选10％～30％。
8.制备固定化脂肪酶的方法，其包括：采用流化床制粒或包衣方法，将权利要求1至3中任一项所述的组合物间歇式涂覆于固定化脂肪酶，其中进风温度为10～30℃。
9.如权利要求8所述的方法，其还包括涂覆结束后于20～60℃下继续流化干燥，直至水分达到2％～10％的步骤。
10.权利要求7所述的固定化脂肪酶在催化酯交换反应中的用途。
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