CN103764671B - 酶共固定化的聚氯乙烯表面及其用途 - Google Patents

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Abstract

一种与多种酶共固定化的PVC表面，其可用于洗涤或清洗衣物及其它家用纺织品如毛巾和床单等领域的污渍去除。本发明还提供了此类PVC表面的制备方法及此类PVC表面的使用方法。所述与酶共固定化的PVC表面可用作便宜并可重复使用的衣物洗涤用替代物。

Description

酶共固定化的聚氯乙烯表面及其用途
技术领域
本发明涉及酶共固定化的聚氯乙烯表面及其多种用途。
背景技术
酶作为清洁剂和织物护理剂已被用于洗涤产品中。大多数所使用的酶将附着至织物或瓷器上的大的水不溶性泥污(soil)和污渍分解为较小的更加水溶的碎片。随后，较小的分子由洗衣(洗碗)机的机械运动或通过与其它洗涤剂成分的相互作用被除去。酶在对一个污渍起作用后并未失去其功能性，并可继续作用于下一个污渍。酶还通过更好地维持白度或保持颜色鲜艳而实现织物护理功能。在洗涤剂中使用酶的最重要原因是i)极少量的这些取之不尽的生物催化剂可以替代非常大量的人造化学剂，并且ii)酶可以在非常低的温度下发挥功能，而常规化学制剂在该温度下通常失效；iii)酶可被完全生物降解。
以下各类酶已知可改善洗衣工艺：蛋白酶可作用于内含蛋白质的泥污和污渍，例如衣领和袖口的泥污纹(soil-line)，草和血液等。蛋白酶是可将大的蛋白质分解为称为肽的较小链(简单来说肽就是短的氨基酸链)的酶。淀粉酶去除淀粉类泥污和污渍，如调味汁，冰淇淋，肉汁。淀粉酶将淀粉链分解成较小的糖分子。脂肪酶可以有效地去除油/油性物质(greasy body)和食物污渍。纤维素酶提供一般的清洁能力，特别是对尘泥，也作用于由纤维素纤维制成的衣物，尽量减少起球，以还原色彩和柔软性。
在市场上出售的昂贵的洗涤剂粉是化学洗涤剂和酶分别以粉末的90%和10%构成的混合物。为了轻松去除衣物上的污渍而将酶混入洗涤剂中。因此，所述洗涤剂的售价高于普通洗涤剂。然而，这些酶性洗涤剂存在提供一次性使用酶的缺点。
α-淀粉酶现已被用于商业洗涤剂，用以清洗或去除衣物上的淀粉污渍(Rani,P.等,2007,Indian L Biotech.6:230-233)。在纤维素酶分子中的表面疏水性氨基酸残基作为负责其洗涤性能的结构因素，用以除去衣物上的纤维素纤维污渍。因此，纤维素酶在洗涤剂工业中具有新的显著作用。目前在洗涤剂中使用的纤维素酶一般都不稳定，因此需要保护其免受蛋白酶的攻击和避免洗涤剂的其它组分如表面活性剂反过来抑制纤维素酶的活性。
不同来源的α-淀粉酶被固定在支持体上，如人红细胞、纤维素、聚苯乙烯、共价偶联的烷基胺玻璃珠、阳离子交换树脂、照相明胶(photographic gelatin)、塑料支持体、琼脂凝胶、丙烯腈/丙烯酰胺膜、聚(2-甲基丙烯酸羟乙酯)微球、聚(甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸)微球、聚丙烯酰胺凝胶、玻璃珠、藻酸钠珠、超多孔细胞珠(superporous celbead)、聚酯表面游离和附着有烷基和芳基胺的玻璃珠，藻酸盐凝胶珠，带有杂化材料的环状碳酸酯，纤维素纤维材料和纤维素包覆的磁铁矿(CCM)的纳米颗粒。
用于纤维素酶固定化的各种支持体为聚氨酯泡沫、三(4-甲酰苯氧基)氰脲酸酯、聚丙烯酰胺-丙烯酸凝胶、丙烯酰胺接枝的丙烯腈共聚物(PAN)、化学修饰的浮石颗粒、纳米纤维聚(乙烯醇)PVA、磁过滤等离子体流改性的被动环氧丙烯酸酯膜、硅酸盐粘土矿物、改性的聚乙烯醇包裹的脱乙酰壳多糖珠、丝瓜海绵(loofa sponge)、脂质体、以经戊二醛和硅片的砖粉或氨基为末端的表面。
已根据不同目的通过不同的方法将不同来源的蛋白酶固定至各种支持体上，例如来自动物胰腺的蛋白酶通过共价键固定和离子相互作用固定至共聚(乙烯/丙烯酸)纤维的表面上；风味酶(蛋白酶)通过使用戊二醛共价键结合固定至羧酸阳离子交换树脂(Lewatit)R-258-K、活化的巯基-Sepharose上；来自木瓜乳胶的酶固定化和稳定化至螯合的Sepharose上；木瓜蛋白酶通过戊二醛交联和重氮偶合固定至大孔聚合物载体上；来自地衣芽孢杆菌(Bacillus lickeniformis)的蛋白酶通过共价偶联固定至以理化为特征的二氧化硅支持体上；来自真菌的蛋白酶固定至载有金纳米颗粒的沸石微球上；蛋白酶通过包埋法固定至各种基质上，如纳米颗粒表面上、纱布绷带上、高度多孔活性炭(HPAC)上、功能化介孔活性炭(FMAC)上和组装在多孔MCM-41(移动晶体材料41号)颗粒上的TiO2纳米粒子上。
已根据不同目的通过不同的方法将不同来源的脂肪酶固定至各种支持体上，例如来自皱落假丝酵母(Candida rugosa)的脂肪酶通过共价偶联固定至Sepharose6-B上；来自荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescence)的脂肪酶使用用于水解甘油三乙酸酯的两相乳化技术固定至聚苯乙烯丁二烯橡胶上；来自根霉(Rhizopus)的脂肪酶使用用于植物油水解的反相法固定至聚氯乙烯超滤膜上；来自皱落假丝酵母的脂肪酶通过吸附固定至微孔聚丙烯上；来自柱状假丝酵母(Candida cylindracea)、黑曲霉(Aspergillus niger)和荧光假单胞菌的脂肪酶通过吸附固定至阴离子交换树脂和硅藻土上以便其用于酯基转移和酯化反应为非水体系；来自皱落假丝酵母的脂肪酶固定至多孔聚氨酯颗粒和有机聚合物珠上，以增加酶对洗涤剂的稳定性，以及固定至聚乙烯粉末上以便其用于由紫苏油水解生产α-亚麻酸；不同的脂肪酶通过吸附现象固定至EP-100聚丙烯粉上；来自页硅酸盐溶胶-凝胶基质中的洋葱假单胞菌(Pseudomonas cepacia)的脂肪酶和假单胞菌属的脂肪酶通过共价偶联固定至空心管式反应器上用于借助酶反应器水解玉米油的多元响应动力学；来自南极假丝酵母(Candida antarctica)的脂肪酶固定至丙烯酸类树脂上用于在有机介质中合成抗坏血酸盐脂肪酸酯；来自猪胰脏的脂肪酶通过戊二醛偶联固定至游离烷基胺玻璃珠并使其在各种洗涤剂的存在下用于洗涤棉织物；粘稠色杆菌脂肪酶(Chromobacteriumviscosum lipase)通过包埋法固定至通过聚合四甲氧基硅烷(TMOS)硬化的明胶的固体纳米复合基质上；洋葱假单胞菌脂肪酶通过包埋技术固定至页硅酸盐溶胶-凝胶基质上，用于生产饭店油污(restaurant grease)的烷基酯作为生物柴油；来自杆菌(Bacillus)GK8的脂肪酶通过戊二醛共价偶联固定至不同支持体上，如二氧化硅、sepabcads、CNBr活化的sepharose4B、HP-20珠和苯基-sepharose上；脂肪酶通过戊二醛偶联固定至添加于塑料烧杯内部的烷基胺玻璃珠上，并且其用于在多种洗涤剂的存在下洗涤棉织物；皱落假丝酵母脂肪酶为了长期稳定性而通过共价偶联固定至γ-Fe2O3磁性纳米颗粒上，以及固定至藻酸钙凝胶上、硅酸钙的无机微囊体中和大孔丙烯酸类树脂珠上以提高脂肪酶的热稳定性，并且通过物理吸附法固定至天然高岭土上；假丝酵母(Candida sp.)99-125脂肪酶固定至大孔树脂上，从而在低水介质中的生物柴油合成中显示最高的活性；洋葱假单胞菌脂肪酶固定至硅藻土上用于在无溶剂体系中由麻疯果油制备生物柴油，和固定至添加于塑料表面的洋葱膜上；来自简青霉(Penicillium simplicissimum)的脂肪酶通过选择性吸附固定至疏水支持体上。
胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶也已共价地共固定于塑料烧杯内部，其作为三电极类系统用电化学电池用于测量血清总胆固醇。(Hooda,V.等,2009,Sens.and Actuat.B.136:235-241)。
脂肪酶、胰蛋白酶和α-淀粉酶已共固定至无纺布聚酯材料的表面上，实现了多种酶类的均匀分布，其中不同的酶活性结合在支持体上(Bachmann,M.N.,等,2007,Biotechnol Bioeng.96:623-30)。
脂肪酶与甘油激酶、甘油-3-磷酸氧化酶和过氧化物酶已共固定至游离并附着有芳香胺和烷基胺的玻璃珠上(Kalia,V.等,2002,Indian J.Biochem.Biophys.39:342-346)，该珠子通过重氮化附着于塑料带上，用于血清中甘油三酯的测定。(Kalia,V.,等,2002,Indian J.Biochem.Biophys.39:342-346,Minakshi,等,2008,Indian J ofBiochem.Biophy.45:111-115)。
固定化α-淀粉酶通过多种洗涤剂从棉织物除去淀粉污渍的应用已经化学方法试验。所有洗涤剂在固定化α-淀粉酶存在时比只用洗涤剂时洗得更好。(Rani,P.等,2007,Indian.Biotech.6:230-233)。
脂肪酶与甘油激酶(GK)、甘油-3-磷酸氧化酶(GPO)和辣根过氧化物酶(HRP)已共固定至人工制备的PVC膜上，以便其用于甘油三酯的安培测定(Narang,J.等,2010,Anal.Lett.43:1–11)。
然而，目前为止α-淀粉酶、纤维素酶、蛋白酶和脂肪酶还没有共固定化。在此我们首次报道将商业α-淀粉酶、纤维素酶、蛋白酶(从大豆种子中纯化)和脂肪酶共价地共固定至塑料烧杯和刷子上，并将它们在非酶洗涤剂洗涤衣物时重复使用。由于聚氯乙烯(PVC)的性质例如化学惰性、无腐蚀、耐候性、坚韧、轻量、免维护，并由于高强度-重量比而易于加工成型为各种形状及大小，因而PVC片是一种很有前途的用于酶固定化的材料(Pundir,C.S.等,2008,Anal.Biochem.374:272-277)。
US专利7250253描述了涉及包含大量附着于表面的聚合物链的单层多官能聚合物(聚合物刷)的发明，其中每个聚合物链含有大量的至少携带允许聚合物链与试样分子(sample molecule)相互作用的官能团的单元。
US专利3860536描述了一种稳定的酶洗涤剂的组合的水性配方。该水性配方的稳定性使其在洗涤柔性织物时具有更广泛的适用性。
US专利5707950公开了关于洗衣用洗涤剂组合物的发明，所述组合物包含脂肪酶(特别是由柔毛腐质霉(Humicola lanuginosa)衍生的天然脂肪酶的变体D96L)、蛋白酶和表面活性剂，其中所述组合物包含脂肪酶和蛋白酶的水平使得所述组合物的增白性能增加。这些组合物为织物提供了改进的白度保持性和/或污渍清理性。
US专利3637339描述了用于从织物去除污渍的组合物，所述组合物包括酶、过化合物(per-compound)和过硼酸盐的活化剂。从织物去除污渍的方法，其包括将所述织物置于洗涤水中，向洗涤水添加足以提供约1-40ppm的可用氧的量的下述组合物，所述组合物基本上由有效量的无机过氧化物及过氧化物用活化剂组成，所述活化剂的存在量可有效地转换所述过氧化物，从而增加所述过氧化物对咖啡渍/茶渍的漂白效果。
US专利7469703提供了一种电动去污刷。同时提供使用电动去污刷清洁非生物表面的方法。所述电动去污刷包括其中设置有电动机的手柄、具有纵轴的头部和设置在手柄与头部之间的颈部。毛刷(bristle holder)与头部相连。电动机可操作地与毛刷相连。
US专利5858117公开了在食品加工工业中用作泥污去除剂的组合物。可清洁食品制作和准备区的食品污染表面。以浓缩物的形式制造所述组合物，由水稀释后使用。该清洁物质由两部分系统制备，即用稀释源稀释和使用前的混合。该产品含有高品质的清洁组合物并使用多种活性成分。在两部分系统中的优选材料含有洗涤剂组合物、降解食品组合物的酶、表面活性剂、低碱助洗剂(low alkaline builder)、水质调节(软化)剂，以及依据产品形态可选的多种处方佐剂。
US专利6265191描述了脂肪酶在表面的固定化，以便于从表面除油并改变表面的湿润能力。所述脂肪酶从假单胞菌属生物体如恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)ATCC53552中可分离，或表达在假单胞菌中发现或从其克隆的编码区的生物体可分离。特别优选的脂肪酶具有约30至35KD的分子量，并可通过SDS凝胶电泳分离到单一条带。吸附在织物上的脂肪酶形成脂肪酶-织物复合体，用于油渍去除。
US专利5232843描述了通过将脂肪酶和非脂肪酶蛋白质如卵清蛋白、牛血清白蛋白或酪蛋白酸钠的实质涂层吸附到载体，使脂肪酶支持于可具有疏水性或由离子交换树脂形成的载体材料上。所述蛋白质与脂肪酶同时或在其之前施加。蛋白质涂层提高了酶的活性，特别是其在酯化和酯交换中的用途方面。
US专利6596520描述了一种固定化脂肪酶，其通过将来自脂肪酶粗溶液的脂肪酶吸附至聚烯烃颗粒如非极性的聚丙烯颗粒上来制备。粗溶液可为无细胞的培养肉汤。脂肪酶的来源包括类鼻疽伯克氏菌(Pseudomonas burkholderia)和绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa)。固定化脂肪酶的用途包括底物的对映选择性转换，如对映选择性酰化或水解。
US专利5445955公开了一种固定化脂肪酶，其制备用于在包括极少量水如50-2,000ppm的反应体系中反式酯化油、脂肪或磷脂。所述脂肪酶可为磷脂酶如磷脂酶A2。在第一实施方案中，来自根霉属、毛霉属、产碱杆菌属或假丝酵母菌属等微生物的脂肪酶固定化于疏水的、不溶性有机聚合物载体上，该载体具有平均直径约为10nm以上的孔。脂肪酶溶液与聚合物载体接触10分钟至40小时，以使脂肪酶与载体共价结合。固定化脂肪酶减压干燥至含水量为0.5至30wt%。
US专利4343901公开了酶固定化用磁性支持体基质的制备，所述基质包括含有分散在其内部的铁磁颗粒的多孔耐火性无机氧化物和与浸渍于其中的过量双官能试剂交联的多胺，以便提供侧基官能团。然而，当与在非磁性支持体上制备的相比时，此类磁性支持体基质并未显著降低随后固定化酶的负载，也未以任何其他方式显著改变固定化酶体系的性质。
US专利5474925公开已经建立了在棉纤维细胞中表达固定化蛋白的转基因棉花植株。所述棉纤维可以从此类转基因棉花植株中回收，然后用作用于工业或实验室工艺的固定化蛋白的固定基质。美国研究者已表明他们可制造含有活性酶的塑料膜。
US专利申请20060053567公开了一种织物处理组合物的涂布器及其应用。更具体地，所述发明涉及一种通用地、有效方便地适用的织物处理涂布器及其施涂方法。请求保护和描述了织物处理组合物的施涂方法，所述组合物包括漂白剂并且在将其施涂至织物后放置以便挥发。
US专利申请20040161860公开了多变量型分析方法，其包括在固体支持体表面和各分离的区域上共固定不同配体基团，不同区域依次与单种或多种分析物接触，检测分析物与配体基团的相互作用，并由此确定各分析物的配体结合量。
该工艺基于典型用于生产扁平塑料制品如CD，DVD和平面显示器的方法(明尼苏达大学，St.Paul,US)。他们用化学结合到酶的聚苯乙烯化学修饰薄膜(Tong等,2008Biotechnol.Progr.24:714–719)。
明尼苏达大学研究员Ping Wang使用10厘米直径的光盘，他将该光盘涂布四层膜构成的层(Tong等,2008Biotechnol.Progr.24:714–719)。在解释苛刻的化学处理不能破坏酶的保护时，Wang说“酶与聚合物涂层之间的结合与负责塑料整体性的化学键一样强”。尽管如此，当产生污渍时酶的活性足以溶解蛋白质。
发明内容
本发明一方面提供了一种用于去除污渍的聚氯乙烯表面，其中，所述聚氯乙烯表面与脂肪酶、纤维素酶、淀粉酶和蛋白酶等酶共固定化。
参考以下附图、说明书、实施例和所附权利要求将变得更好地理解本发明的该方面及其它特征和优势。本概要以简单的形式提供介绍所述概念的选择。本概要并不意欲确定所要求主题的必要特征和基本特征，也并不意欲限定所要求主题的范围。
附图说明
图1示出将酶共价固定至PVC/塑料表面及其在去除污渍时的应用(衣物洗涤)的方案。
图2示出用共固定化酶化学修饰的PVC表面(A)以及没有用共固定化酶化学修饰的PVC表面(B)的扫描电子显微照片(SEM)。
图3示出pH对游离蛋白酶(从大豆种子中纯化)及共固定至塑料杯/刷上的蛋白酶的影响。
图4示出温育温度对游离蛋白酶及共固定至塑料杯/刷上的蛋白酶活性的影响。
图5示出温育时间对游离蛋白酶及共固定至塑料杯/刷上的蛋白酶活性的影响。
图6示出底物浓度对游离蛋白酶及共固定至塑料杯/刷上的蛋白酶活性的影响。
图7示出pH对与塑料杯/刷结合的α-淀粉酶的影响。
图8示出温育温度对与塑料杯/刷结合的α-淀粉酶的影响。
图9示出温育时间对与塑料杯/刷结合的α-淀粉酶的影响。
图10示出底物浓度对与塑料杯/刷结合的淀粉酶的影响。
图11示出pH对与塑料杯/刷结合的纤维素酶的影响。
图12示出温度对与塑料杯/刷结合的纤维素酶的影响。
图13示出温育时间对与塑料杯/刷结合的纤维素酶的影响。
图14示出底物浓度对与塑料杯/刷结合的纤维素酶的影响。
图15示出pH对与塑料杯/刷结合的脂肪酶的影响。
图16示出温度对与塑料杯/刷结合的脂肪酶的影响。
图17示出温育时间对与塑料杯/刷结合的脂肪酶的影响。
图18示出底物浓度对与塑料杯/刷结合的脂肪酶的影响。
图19示出塑料杯/刷上游离蛋白酶的双倒数图(Lineweaver-Burk plot)。
图20示出共固定至塑料杯/刷上的蛋白酶的双倒数图。
图21示出共固定至塑料杯/刷上的α-淀粉酶的双倒数图。
图22示出共固定至塑料杯/刷上的纤维素酶的双倒数图。
图23示出共固定至塑料杯/刷上的脂肪酶的双倒数图。
图24示出分别固定至PVC片上的α-淀粉酶、纤维素酶、蛋白酶和脂肪酶在4℃贮存一百天后其活性的可重用性的影响。
图25示出PVC片上共固定酶的可重用性。
具体实施方式
本发明提供与脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶和纤维素酶等酶共固定化的聚氯乙烯(PVC)表面。本发明也提供了与酶共固定化的PVC表面的制备方法和该PVC表面的使用方法。如本发明所公开，所述与酶共固定化的PVC表面用于洗涤和清洁衣物及其它家用纺织品如毛巾和床单等领域。
本发明特别提供容器和刷的形式的与脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶和纤维素酶共固定化的PVC表面，其中所述酶使用具有两个末端-CHO基团的偶联剂共固定化，所述两个末端-CHO基团通过共价偶联，其中一个与PVC表面结合，另一个与酶(蛋白质)上的-NH2基团结合。
容器和刷的内部用无机酸处理后在缓冲水溶液中用具有至少两个末端-CHO基团的偶联剂处理，从而获得活化的固相支持体，其进一步与具有至少一个游离的氨基官能团的酶接触。
共固定于PVC表面的酶不仅提供酶的重复利用，而且还保护酶不受蛋白酶作用和表面活性剂的抑制。共固定化酶在洗涤剂用途中非常重要，因为它们在费用和反应流程中有很多优点，其包括：便利性：微量的蛋白质溶于反应，因此操作可更容易。完成后，反应混合液里通常只含有溶剂和反应产物。经济性：固定化酶容易从反应中去除而使得容易回收该生物催化剂。稳定性：与溶解形式的酶相比，固定化酶通常具有更高的热稳定性和操作稳定性。
与脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶和纤维素酶等酶共固定化的PVC容器和刷作为廉价和可重复使用的衣物洗涤用替代物是有用的。
然而，如果酶以固定化形式用于化学洗涤剂，不仅更高效率地工作，而且还重复利用200次。在洗涤剂中重复使用相同量的酶将减少洗涤费用。在一些特殊化学物质的帮助下，酶共固定至塑料瓶和刷的内壁，提供了在市售可得的洗涤剂中以其游离形式使用的α-淀粉酶、纤维素酶、蛋白酶和脂肪酶等酶的重复利用，从而容易去除衣物上的污渍。游离形式的酶可使用一次。而固定化的酶可重复使用200次。
因此，本发明提供包括α-淀粉酶、纤维素酶、蛋白酶和脂肪酶的酶共固定化的容器和刷。酶的共固定化对于从衣物上去除污渍是有用的。
还提供包括α-淀粉酶、纤维素酶、蛋白酶和脂肪酶的酶共固定化容器和刷的制备方法。
在一个实施方案中，本发明提供与α-淀粉酶、纤维素酶、蛋白酶和脂肪酶等酶共固定化的PVC表面，其中所述PVC表面是容器和刷的形式，且用于从衣物上去除污渍。所述共固定化于容器和刷上的酶作为廉价和可重复使用的衣物洗涤用替代物是有用的。
根据本发明，提供用于去除污渍的聚氯乙烯表面，其中所述聚氯乙烯表面与脂肪酶、纤维素酶、淀粉酶和蛋白酶等酶共固定化。
在本发明的另一实施方案中，提供用于去除污渍的聚氯乙烯表面，其中所述聚氯乙烯表面与脂肪酶、纤维素酶、淀粉酶和蛋白酶等酶共固定化，其中所述表面为片、刷、容器、管、反应器、芯片、盘、带和量规(gauge)的形式。
在本发明的另一实施方案中，提供用于去除污渍的聚氯乙烯表面，其中所述聚氯乙烯表面与脂肪酶、纤维素酶、淀粉酶和蛋白酶等酶共固定化，其中所述PVC表面能够从蒸馏水、运河水、地下水、自来水、井水和硬水中去除污渍。
在本发明的另一实施方案中，提供用于去除污渍的聚氯乙烯表面，其中所述聚氯乙烯表面与脂肪酶、纤维素酶、淀粉酶和蛋白酶等酶共固定化，其中所述PVC表面能够在非酶洗涤剂的存在下去除污渍。
在本发明的另一实施方案中，提供用于去除污渍的聚氯乙烯表面，其中所述聚氯乙烯表面与脂肪酶、纤维素酶、淀粉酶和蛋白酶等酶共固定化，其中所述PVC表面能够去除淀粉、蛋白质、草、油、泥污、血液、油脂、调味汁、冰淇淋、肉汁、蛋、人体汗液、巧克力、灰尘和泥浆。
在本发明的另一实施方案中，提供用于去除污渍的聚氯乙烯表面，其中所述聚氯乙烯表面与脂肪酶、纤维素酶、淀粉酶和蛋白酶等酶共固定化，其中所述PVC表面能够重复利用至少200次。
在本发明的另一实施方案中，提供用于去除污渍的聚氯乙烯表面，其中所述聚氯乙烯表面与脂肪酶、纤维素酶、淀粉酶和蛋白酶等酶共固定化，其中所述PVC表面可为聚氯乙烯容器或刷。
在本发明的另一实施方案中，提供与α-淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶和蛋白酶共固定化的PVC表面的生产方法，所述方法包括将从大豆种子中纯化的酶共价地共固定化至塑料(PVC)烧杯的内表面和刷上，其结合率分别为0.02mg/cm2和0.016mg/cm2。共固定化酶分别保留约66.7%、54.2%、44.64%、62.8%(结合于烧杯)以及44.01%、66.23%、33.9%、45.8%(结合于刷)的游离酶初始活性。在固定过程中，通过用HNO3/H2SO4处理分解PVC材料的乙烯基聚合物，所述处理在长链聚合物中引入缺口，并生成从聚合物表面突出的自由端。该强氧化剂的反应在拉链作用(zipper action)中从被破坏的聚合物端去除氯分子并在这些短链聚合物端引入一个双键(Pundir,C.S.等,2008,Anal.Biochem.374:272-277)。当处理后的聚合物的自由端与双官能交联剂如戊二醛的醛基反应时，戊二醛的一个醛基与乙烯基链的自由端反应，从而在PVC片的戊二醛之间形成-C=CH-键，因而导致表面活化，用于共价固定化酶。酶表面的-NH2基团与已通过希夫形成希夫碱的PVC片的戊二醛的另外的-CHO基团共价结合。这导致蛋白质/酶与PVC膜表面的共价连接(Pybdurm C.S.,等,2008,Anal.Biochem.374:272-277)(图1)。
PVC片的SEM
含固定化酶的化学修饰的PVC片的表面的SEM在高分辨率下显示沿串珠结构的褶皱和簇，该结构在不含有酶的膜上未观察到(分别为附图2A和B)。这种固定化后支持体表面表型的改变证实了酶的固定化。代替球状串珠结构所形成的褶皱可能是由于PVC膜表面上高浓度的共固定化酶。
动力学参数的改变
共固定化酶与游离酶的各种动力学参数的比较已在表1中给出。结果显示酶在共固定化后经受细微改变，其揭示了酶的稳定性，并且不受PVC膜支持体的干扰(附图3至23)。附图3、4、5和6显示pH值、温育温度、温育时间和底物(酪蛋白)浓度分别对游离的和共固定化的蛋白酶的活性的影响。除了根据规定变化的X轴参数以外使用蛋白酶标准测定条件。最佳活性被认为是100%，其余活性与最佳活性相比以百分比(%)计算。类似地，附图7至10、11至14、15至18分别显示这些参数对共固定化的α-淀粉酶、纤维素酶和脂肪酶的影响。附图19和20示出游离和共固定化的蛋白酶的LB图，而附图21、22和23分别示出共固定化至塑料表面上的α-淀粉酶、纤维素酶和脂肪酶的LB图。
固定化后酶的最适pH的略微升高可归因于由于固定化作用期间酶表面失去-HN2基团导致酶的微环境中氢离子浓度的变化所致。固定化后酶的最适温度的升高可能是由于因为固定化支持体屏障而造成从周围向催化体系的热传递缓慢所致。由于该原因，体系和周围环境的温度变化，并且催化体系需要略微较高的周围温度以使体系中保持最适催化温度。最适温度的变化在早期固定化研究中也被观察到(Kennedy,J.P.,Hand Book ofEnzyme Technology,Marcel Dekker Inc.,NewYork,1985)。固定化后也观察到Km值和Vmax值的变化。Km在α-淀粉酶、纤维素酶和蛋白酶的情况中略有升高，而在脂肪酶的情况中略有降低。酶的催化速率根据Vmax值测定。在α-淀粉酶和纤维素酶的情况中，Vmax或略微降低或略微升高。固定化后酶的Km和Vmax的变化取决于微环境和产物抑制等多种变化。由于固定化后酶微环境的变化，底物和产物的扩散性不同于原酶(native enzyme)的扩散性，所以通常观察到Km和催化效率的变化(Pundir,C.S.等,2009,Talanta.77:1688-1693)。
在衣物洗涤中酶共固定化至烧杯和刷的应用
单独用洗涤剂和在共固定化酶存在下洗涤淀粉、草、卵清蛋白和油污染的棉衣物片。测定衣物片中污渍残留含量作为洗涤性能的标准。污渍残留含量越低洗涤越好。已试验了两种洗涤剂，昂贵的(酶)洗涤剂如Surf Excel和非酶洗涤剂如Ghari。洗涤在四种不同的水中进行，即蒸馏水、运河水、地下水(手压泵水)和井水。相比于对照组(不含洗涤剂仅含水)、单独的含酶洗涤剂和非酶洗涤剂，任何洗涤剂与共固定化酶的组合显示出更好的洗涤效果(表2-9)。表2、3、4和5示出在结合有共固定化的α-淀粉酶、纤维素酶、蛋白酶和脂肪酶的PVC/塑料烧杯的存在下非酶洗涤剂与含酶洗涤剂的洗涤性能的比较(分别从棉衣物中去除淀粉、纤维素、卵清蛋白和油渍)。表中给出的数值表示洗涤后淀粉在衣物中的残留量(mg/cm2)，表6、7、8和9示出使用结合有酶的PVC/塑料刷的相似的比较。
洗涤剂通常含有表面活性剂、助洗剂、共助洗剂、漂白剂、漂白活化剂和特殊添加剂例如荧光增白剂、填料、腐蚀抑制剂、消泡剂和酶(仅在含酶洗涤剂的情况下)和香料。作为洗涤剂的主要组分的表面活性剂有四种类型：(i)阴离子型(例如十二烷基硫酸钠)，(ii)阳离子型(例如十六烷基三甲基溴化铵作为织物柔软剂)，(iii)非离子型(例如w-十二烷基八甘醇单醚乙氧基化物)，和(iv)两性离子(例如月桂基酰氨基丙基二甲基甜菜碱作为皮肤清洁剂)。洗涤剂可含有一种以上的表面活性剂。因此，由于职业保密，特别是在当不能获得商用洗涤剂的化学组成时，无法得知洗涤剂的整体离子状态。目前来讲，酶(α-淀粉酶、纤维素酶、蛋白酶和脂肪酶)通过共价键合而与PVC表面结合，从而牢固地附着在塑料烧杯的内壁和刷的表面。该形式的酶几乎不受溶液中表面活性剂的影响。因此，在各种固定化酶的存在下各种洗涤剂洗涤性能的比较是归因于其各自性能，而不是归因于其对酶的不同/组合影响。酶共固定化于内表面保护酶免受表面活性剂的影响以使其重复利用。
存储的稳定性和可重用性
共固定化酶可在4℃下的三个月时间内被重复使用200次。在冷存储(4-10℃)时，此类洗涤过程不会造成酶活性的大量损失。一般来说，游离形式的酶由于其可能被蛋白酶攻击或被表面活性剂抑制而不安全。所以在不同玷污的衣物的洗涤过程中，使用结合有酶的烧杯不仅在无消耗下增强其洗涤效果，而且还使较便宜的洗涤剂达到与昂贵洗涤剂相当的洗涤效果。共固定化酶的半衰期(+1/2)为三个月(图24、25)。图24示出在4℃下共固定至PVC片上的α-淀粉酶、纤维素酶、蛋白酶和脂肪酶的存储稳定性。图25示出当在4℃存储时经100天时间共固定化酶的重复使用次数。
实施例
提出下述实施例用以为本领域普通技术人员提供完整的发明及描述如何制备和使用本发明，并且不意欲限制本发明人所认为的其发明的范围，他们也不意欲表明下述实验为所进行的所有和唯一的实验。
实施例1
化学品和试剂
来自绿色木霉(Trichoderma viridae)的纤维素酶、α-淀粉酶(细菌来源)、来自猪胰脏的脂肪酶(40-70U/mg蛋白)，酒石酸钾钠、二硝基水杨酸(DNS)、蒽酮TCA和淀粉来自SISCO Research Laboratory Pvt.Ltd.,Mumbai.。戊二醛(25%)来自Sigma St.Louis,USA.。丙酮、甲醇、乙醇和酚酞来自E.Merck,Mumbai。Tris碱、氯化钙和苯甲酸钠购自Qualigen Mumbai,Mumbai。所有其它化学品均为分析纯试剂级。白色PVC烧杯(100ml)和刷，商用含酶洗涤剂(Surf Excel)和非酶洗涤剂(Ghari)，橄榄油和大豆种子(Glycine maxvar.Ogden)购自当地市场。井水、运河水、地下(手压泵)水收集自罗塔克附近农村。
实施例2
从大豆种子提取和部分纯化蛋白酶及粗提酶的制备
提取
大豆种子在冷瓦林混碎机(waring blender)中研磨成粉末，每两分钟暂停一次。在冷瓦林混碎机中将大豆粉(100g)混入1.0L冷蒸馏水中。将其填满容器容量并使泡沫最少化。将悬浮液共混6min，间隔两分钟暂停一次以防止过热。将悬浮液共混6min，间隔两分钟暂停一次以防止过热。将所得悬浮液在4℃、15000×g下离心10min。将所得薄的白色油层撇去，收集上清液和沉淀二者，并试验酶活性和蛋白质含量(Weil,J.等,1966,Cerealchem.3:392-399)。因显示很低的酶活性而弃去沉淀，并将上清液贮存于4℃以备进一步研究。
蛋白酶分析
蛋白酶活性通过Nam Sun Wang修饰法测定。该方法基于使用茚三酮与氨基酸的颜色反应来定量蛋白酶水解酪蛋白所产生的氨基酸。在15ml试管中分析酶。反应混合物包括3.8ml0.05M的磷酸钠缓冲液(pH6.3)、0.1ml反应缓冲液中的1%酪蛋白和0.2ml的酶，总体积4.0ml。50℃温育90min后，在连续搅拌下，将0.5ml茚三酮(2%丙酮中)添加至反应混合物，并在100℃沸水浴中保持10min。出现黄色显示氨基酸的存在。浊度(若有的话)通过在850×g下离心10min来确定。对对照(除了用反应缓冲液替代蛋白酶以外，以与上述相似的方式进行)记录A570nm。酪氨酸(casein acid)的浓度由酪蛋白的浓度和A570之间的标准曲线决定。
蛋白酶的测定
各种酶制剂中蛋白含量由使用牛血清白蛋白(BSA)作为标准蛋白的方法(Lowry,O.H.等,1951,J.of Biochem.193:265-275)确定。
蛋白酶的纯化
使用以下纯化技术部分纯化粗提酶。
TCA沉淀
将TCA加入到上清液(粗提酶)中，使其终浓度为5%。将混合物低温搅拌直至TCA溶解。将该混合物放置过夜以使其沉淀。然后将该溶液在15000×g下离心10min。将沉淀用最低量的反应缓冲液溶解，测定其蛋白水解活性和蛋白质。
DEAE-纤维素柱层析及DEAE柱的制备
将DEAE纤维素酶浸于蒸馏水中并使其溶胀过夜。用2%HCl处理胶30min，然后用蒸馏水洗涤数次直至洗涤弃液(discard)的pH值为7.0。现将用2%NaOH处理胶30min。再次用蒸馏水洗涤数次直至洗涤弃液的pH值为7.0。取其下端有玻璃棉(glass wool)的玻璃柱(1.5×10)直立固定在滴定管架上，并将其出口关闭。在玻璃棒的辅助下搅拌胶并在玻璃棒的辅助下将其沿柱壁缓慢加入。使胶静止一段时间。随后将柱用0.01M pH6.8的磷酸钠缓冲液以0.5ml/min的流度洗涤24hr。
在加样前首先停止输入洗脱液，并将洗脱液排至床面(bed surface)上。然后将溶解的TCA沉淀沿柱侧壁平缓地置于凝胶上。使pH4.8的乙酸盐缓冲液渗过该柱。该处理溶解部分沉淀物。使柱子以0.5ml/min的流度注入0.01MpH5.6的乙酸钠缓冲液。然后收集3ml级分并检测活性和蛋白质。
实施例3
游离酶分析
α-淀粉酶分析
α-淀粉酶分析基于使用DNS反应测定由α-淀粉酶水解淀粉产生的葡萄糖和麦芽糖。在试管中向含有2%淀粉的1.9ml0.05M的乙酸盐缓冲液(pH5.6)添加0.1ml酶溶液。作为空白对照，取含有2%淀粉的2ml反应缓冲液置于试管中。将空白对照和分析试管二者均置于37℃水浴中温育并持续搅拌。温育10min后，将0.1ml2N NaOH和0.9ml二硝基水杨酸(DNS)试剂加入到两只试管。试管置于沸水浴5min，冷却至室温，读取红色A540，并由葡萄糖浓度和A540之间的标准曲线推断反应中产生的葡萄糖的量。
纤维素酶分析
纤维素酶分析基于使用DNS反应测定由纤维素酶水解纤维二糖水解产生的葡萄糖。在试管中向含有4.0mg纤维二糖的1.9ml0.05M的磷酸钠缓冲液(pH7.0)添加0.1ml溶解在反应缓冲液中的酶(1mg/ml)。作为空白对照，取含有4.0mg纤维二糖的2ml反应缓冲液。将分析和空白对照试管都置于40℃水浴中温育30min。温育后，将0.1ml2N NaOH和0.9ml DNS试剂加入到两只试管。试管置于沸水浴10min，冷却至室温，读取相对于空白对照的红色A540，并由葡萄糖浓度和A540之间的标准曲线推断分析中产生的葡萄糖的量。
脂肪酶分析
脂肪酶活性根据修改的Naher(Naher,G.,1974,Lipase titrimetric assay.In:Methods of Enzymatic Analysis,vol.2.(Bergmeyer,H.IL,),pp.814-818,Academic Press,New York)来分析。在100ml的锥形瓶中，将5.0ml的橄榄油乳液添加至5.0ml0.1M的tris缓冲液(pH8.0)并在35℃温育10min。添加1.0ml脂肪酶溶液(5mg/ml)并在35℃温育20min。反应混合物随后于室温下保持20min。添加10ml丙酮和甲醇混合物(1:1)以终止反应，并在加入1%酚酞作为指示剂后，用0.025N NaOH滴定。对每个样品进行对照以纠正由除脂肪酶或者通过丙酮和甲醇混合物引起的不完全反应以外的任何因素引起的pH值任何下降的终止。在对照的情况中，将1.0ml的脂肪酶溶液在沸水浴中保持5min以使其热变性。其余步骤与试验所述步骤相同。
实施例4
α-淀粉酶、纤维素酶、蛋白酶和脂肪酶与PVC/塑料烧杯和刷的共固定化
使用Pundir等于2008年提出的方法，将混合物中的α-淀粉酶、纤维素酶、蛋白酶和脂肪酶(1mg/ml)通过共价偶联共固定至PVC/塑料烧杯和刷的内侧上。PVC表面首先用硝化酸(浓缩(cone)的混合物，硝酸与硫酸比例为5:1)温育6h，以氧化切割聚氯乙烯聚合物为具有朝向表面的突出端的短链聚合物。用水冲洗该酸处理的PVC片，并在0.05M磷酸钠缓冲液(pH7.0)中与2.5%(w/v)戊二醛溶液在30±5℃下温育7h。用蒸馏水多次或两次冲洗戊二醛处理的表面以去除过量的戊二醛。戊二醛活化的PVC表面在50mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)中与酶溶液(总计50mg蛋白质)在黑暗中在4℃下温育24h。倾倒掉过量的酶，并检测活性和蛋白浓度。试验所述PVC烧杯和刷的四种酶的活性。
实施例5
扫描电子显微照相(SEM)
使结合有酶的PVC烧杯和刷进行扫描电子显微照相(SEM)以确认其共固定化。在SEM中，电子从涂布有蒸镀的金-碳膜的试样的表面反射，然后经处理用探测器收集以产生三维样图像。未处理的和酶结合的塑料质地的烧杯的扫描电子显微照像由ElectronMicroscopy Facility,AIIMS,N.Delhi进行。
实施例6
PVC(烧杯/刷)上的共固定化酶的分析
共固定化酶的分析在与其中它们被固定化的相同的塑料烧杯中进行。将烧杯标记为“反应烧杯”，对于刷，在含有酶共固定化的塑料刷的100ml烧瓶中进行。除了游离酶替换为反应缓冲液以外，共固定化酶的分析过程与上述检测游离形式酶的相似的方式进行，温育期间在持续搅拌下保持反应混合物。温育后，将反应混合物转移至试管或烧瓶中。在塑料刷的情况中，在温育后从反应混合物中取出刷。
PVC(烧杯/刷)上共固定化酶的动力学性质
研究共固定化酶的下述动力学参数并与游离酶的动力学参数相比较：最适pH、温度、温育时间和底物浓度的影响，以及Km与Vmax的计算。为了确定共固定化酶的最适pH，使用在其有效pH范围内的不同缓冲体系，例如pH4.0至6.0的0.05M乙酸钠、pH6.0至7.5的0.05M磷酸钠和pH7.5至9.0的0.05MTris-HCl，使反应缓冲液的pH从4.0变化至9.0。相似地，对于共固定化酶的最适温度，以5℃的间隔从25至70℃范围内的不同温度下温育反应混合物。以5min为间隔，从5至100min研究共固定化酶的最适时间。为了研究底物浓度对共固定化酶初始速率的影响，在不同的浓度范围内进行分析，对于α-淀粉酶为0.1-3.5%的淀粉，对于纤维素酶为25-250mM的纤维二糖，对于蛋白酶为0.1-3.5%的酪蛋白，而对于脂肪酶为30-100%的橄榄油。由底物浓度的倒数[1/S]和初始反应速率的倒数[1/v]之间的双倒数作图计算共固定化酶的Km和Vmax值对共固定化酶的影响。
实施例7
在衣物洗涤中共固定化酶的应用
共固定化酶的洗涤性能
将白色棉衣物的矩形片(尺寸：4.5×4.5cm)用于试验并因此命名为试验布。分别用0.2ml2%的淀粉、草渍、2%卵清蛋白和0.2ml的芥末油污染这些布片。分别将共固定化的α-淀粉酶、纤维素酶、蛋白酶和脂肪酶用于去除淀粉、草、卵清蛋白和油等污渍。商用含酶洗涤剂和非酶洗涤剂粉末以2g/L的浓度溶解于不同水中(蒸馏水、运河水、地下水(手压泵)和井水)。50ml洗涤剂溶液转移至塑料烧杯中。对于各洗涤性能，取4个试验布片。一片仅用水洗涤，第二片用非酶洗涤剂洗涤，第三片用含酶洗涤剂洗涤，和第四片在含有共固定化酶的反应烧杯中用非酶洗涤剂洗涤。在由烧杯洗涤的情况中，将布片浸于含有50ml的洗涤剂溶液的反应烧杯中，而在由刷洗涤的情况中，将污渍的布片浸于洗涤剂溶液中2min，然后在刷的辅助下摩擦3-4次。洗涤在35℃中在持续震荡下进行20min，此后用水手动冲洗2次。各洗涤中分别使用四种水：收集于罗塔克附近农村的蒸馏水、运河水、地下水(手压泵)和井水。洗涤性能通过定量洗后的残留污渍(淀粉/纤维素/蛋白质/油)进行判定。
洗涤后试验布中残留淀粉含量的测定
将布片浸于5.0ml的热蒸馏水中并挤压到单独烧杯中以收集残留淀粉，并收集洗涤废液。该过程重复三次。合并AH级分并用蒸馏水将其体积加至100ml。将5mL该稀释提取物置于25ml试管中，并加入10mL新配制的蒽酮试剂(2%于95%H2SO4中)。将试管置于沸水浴中10min，冷却至室温，并读取A540。通过葡萄糖浓度和A540之间的标准曲线推断葡萄糖含量。葡萄糖的值乘以0.9得到淀粉含量。
洗涤后试验布中残留纤维素的测定
为了测定洗涤布中的残余纤维素，在90℃水浴中将布片浸于10ml5%H2SO4中2hr。通过加入少量浓氢氧化钾溶液中和酸来终止水解反应。水解的纤维素中的葡萄糖含量由前所述DNS反应测定。由葡萄糖浓度和A540之间的标准曲线推断葡萄糖/纤维素含量。
洗涤后试验布中残留酪蛋白的测定
为了测定洗涤后试验布中残留蛋白质的含量，在轻微震荡下将其浸于10ml(1NKOH)溶液中20min，以使布的残留酪蛋白被提取至溶剂中。随后由Lowry's法测定溶液中的蛋白质含量。
试验布中残留油的测定
为了测定洗涤后试验布的残余油的含量，在轻微震荡下将其浸于10ml石油醚中20min，以使试验布中的残留油被提取至脂溶剂(石油醚)中。随后将该脂溶液转移至100ml圆底蒸馏烧瓶中。向其中加入25ml0.5M的氢氧化钾醇溶液(alcoholic potassiumhydroxide)。将烧瓶安装至回流冷凝器，并将混合物在沸水浴中回流30min。移除烧瓶，冷凝至室温，并使用1%酚酞作为指示剂用0.5M盐酸滴定混合物。空白对照经同样处理但其中不含油。记录滴定所消耗的HCl体积。
表2：非酶洗涤剂和酶洗涤剂在结合有共固定化α-淀粉酶的PVC烧杯的存在下的洗涤性能(去除棉衣物上的淀粉)的比较。表中所给数值为洗涤后衣物中的淀粉残留含量(mg/cm2)
*对照：不含洗涤剂仅含水
Ghari用作非酶洗涤剂
Surf Excel用作酶洗涤剂
表3：非酶洗涤剂和酶洗涤剂在结合有共固定化纤维素酶的PVC烧杯的存在下的洗涤性能(去除棉衣物上的草渍)的比较。表中所给数值为洗涤后衣物中的纤维素残留含量(mg/cm2)
*对照：不含洗涤剂仅含水
Ghari用作非酶洗涤剂
Surf Excel用作酶洗涤剂
表4：非酶洗涤剂和酶洗涤剂在结合有共固定化蛋白酶的PVC烧杯的存在下的洗涤性能(去除棉衣物上的卵清蛋白渍)的比较。表中所给数值为洗涤后衣物中的卵清蛋白残留含量(mg/cm2)。白蛋白含量越少洗涤越好。
*对照：不含洗涤剂仅含水
Ghari用作非酶洗涤剂
Surf Excel用作酶洗涤剂
表5：非酶洗涤剂和酶洗涤剂在结合有共固定化脂肪酶的PVC烧杯的存在下的洗涤性能(去除棉衣物上的油渍)的比较。表中所给数值为洗涤后油的残留含量(微摩当量/cm2)。
*对照：不含洗涤剂仅含水
Ghari用作非酶洗涤剂
SurfExcel用作酶洗涤剂
表6：非酶洗涤剂和酶洗涤剂在结合有共固定化α-淀粉酶的PVC刷的存在下的洗涤性能(去除棉衣物上的淀粉)的比较。表中所给数值为洗涤后衣物中的淀粉残留含量(mg/cm2)
*对照：不含洗涤剂仅含水
Ghari用作非酶洗涤剂
Surf Excel用作酶洗涤剂
表7：非酶洗涤剂和酶洗涤剂在结合有共固定化纤维素酶的PVC刷的存在下的洗涤性能(去除棉衣物上的草渍)的比较。表中所给数值为洗涤后衣物中的纤维素残留含量(mg/cm2)
*对照：不含洗涤剂仅含水
Ghari用作非酶洗涤剂
Surf Excel用作酶洗涤剂
表8：非酶洗涤剂和酶洗涤剂在结合有共固定化蛋白酶的PVC刷的存在下的洗涤性能(去除棉衣物上的卵清蛋白渍)的比较。表中所给数值为洗涤后衣物中的卵清蛋白残留含量(mg/cm2)。白蛋白含量越少洗涤越好。
*对照：不含洗涤剂仅含水
Ghari用作非酶洗涤剂
Surf Excel用作酶洗涤剂
表9：非酶洗涤剂和酶洗涤剂在结合有共固定化脂肪酶的PVC刷的存在下的洗涤性能(去除棉衣物上的油渍)的比较。表中所给数值为洗涤后油的残留含量(微摩当量/cm2)。
*对照：不含洗涤剂仅含水
Ghari用作非酶洗涤剂
Surf Excel用作酶洗涤剂

Claims (6)

1.一种用于去除污渍的聚氯乙烯表面，其中所述聚氯乙烯表面与纤维素酶、淀粉酶或蛋白酶共固定化，其中所述表面为片、刷、容器、管、反应器、芯片、盘、带和量规的形式，其中，在4℃存储时经100天时间所述共固定化酶重复使用200次时相对活性为50％以上。
2.根据权利要求1所述的聚氯乙烯表面，其能够在蒸馏水、运河水、地下水、自来水、井水和硬水中去除污渍。
3.根据权利要求1所述的聚氯乙烯表面，其能够在非酶洗涤剂的存在下去除污渍。
4.根据权利要求1所述的聚氯乙烯表面，其能够去除淀粉、蛋白质、草、油、泥污、血液、油脂、调味汁、冰淇淋、肉汁、蛋、人体汗液、巧克力、灰尘和泥浆。
5.根据权利要求1所述的聚氯乙烯表面，其可重复使用至少200次。
6.根据权利要求1所述的聚氯乙烯表面，其为聚氯乙烯容器或刷。
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