JPS6158160B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は固定化プロテアーゼ及びその製造法に
関する。 酵素は、種々の化学反応に対して基質特異性が
高く、又反応条件が温和で且つ反応効率も高く、
極めて有用な触媒として現在食品工業、医薬品工
業界に広く利用されている。しかしながら一般に
酵素は水溶性であるため、使用后の回収が困難で
あり、単に不経済であるのみならず、反応生成物
との分離が難しい欠点を有している。 この背景の下に酵素の各種担体等への固定化が
多く提案されてきた。例えばガラスピーズ担体へ
の共有結合、イオン結合による酵素の固定化をは
じめ、ポリアクリルアミドゲル体への酵素の包括
法等が広く研究され、又一部実用化されている。 プロテアーゼに就いても同様であるが特に医薬
品、食品及び化粧品等にプロテアーゼを使用する
に際し、熱安定性、PH安定性、経時安定性等に優
れたものに固定化すること、及び得られたものは
当然人体に悪影響を及ぼさないことが望まれてい
る。 しかしながら、種々の化学反応を用いてプロテ
アーゼを固定化した場合、酵素が失活したり、保
存又は使用時に架橋剤を分解し害を及ぼすことが
ある。又、ポリアクリルアミドを用いてプロテア
ーゼを包括する方法では、一般に酵素を安定に固
定化出来るが、ゲル強度並びに酵素の活性保持性
が充分でなく、薬品、食品等に使用した場合、保
存中に毒性の高いアクリルアミドモノマー等が生
成するという欠点がある。 特開昭51−67785号公報には酵素を絹糸蛋白質
に固定させる不溶化酵素の製造法が記載されてお
り、吐糸直前の蚕より取り出された絹糸線を牽引
して得られる繊維又は蚕の口から吐出直後の絹糸
を酵素溶液中をくぐらせる方法が開示されている
が、斯かる方法では繊維又はフイルムに酵素を固
定せしめるため、酵素の含有量を高くすることは
できず、又その安定性も悪い。更に、形態も繊維
又はフイルム状のため自らその用途も限定される
し、しかもセリシンを含んでいる為腐敗し易く保
存性に欠ける。更に又、本発明者等の追試による
と、この方法により絹糸にプロテアーゼを固定化
することは実質的に不可能であつた。これは非晶
部に付着したプロテアーゼが絹蛋白質を分解し、
水洗工程で流出した為と考えられ、活性は発現し
なかつた。 又、特開昭52−57592号公報にはフイプロイン
溶液に酵素を添加混合したのち製膜し、次いでこ
の膜を不溶化処理することにより、固形フイプロ
イン中に酵素を含有させてなる固定化酵素を製造
することが記載されているが、前者と同様膜のた
め用途は限定されざるを得ないばかりが、この方
法によりプロテアーゼを固定化する場合添加より
製膜に至る間に蛋白分解が進行する為プロテアー
ゼが固定化されたまともな膜を得ることは不可能
である。本発明者等は従来の欠陥を改良し安定性
を優れた固定化プロテアーゼを得べく鋭意研究の
結果本発明を完成したものである。 本発明の目的は、安定性、特に熱安定性、PH安
定性及び経時安定性等に優れた固定化プロテアー
ゼを提供するにある。他の目的は安定性、特に熱
安定性、PH安定性及び経時安定性等に優れた固定
化プロテアーゼを工業的容易且つ安価に製造する
方法を提供するにある。 本発明はフイプロイン中に酸性プロテアーゼを
0.1〜20重量％含有する固定化プロテアーゼであ
り、本発明方法はフイプロイン水溶液とPH８〜11
の酸性プロテアーゼの水溶液とを混合してPHを８
〜11に調整した後、無機塩及び／又は有機塩を用
いてフイプロインと前記プロテアーゼを塩析沈澱
せしめ、次いで得られた沈澱を水洗後乾燥するこ
とを特徴とする。 本発明の固定化プロテアーゼは、酵素を0.1〜
20重量％、好ましくは１〜15重量％、特に好まし
くは２〜10重量％含有する。酵素が0.1重量％未
満の場合、得られた固定化酵素の酵素活性能が低
く実用に乏しい。一方20重量％を超えると、酵素
活性能は飽和し、使用時に酵素の溶出が起こり易
い上に経済性が劣る。 本発明に適用する酸性プロテアーゼの種類は特
に限定されず、例えばペプシン、レンニン、アス
ペルギルロペプチダーゼーＢ、カテプシンＡ、カ
テプシンＣ等が挙げられる。これらの酸性プロテ
アーゼは２種以上を混合して使用することもでき
る。 本発明方法に適用するフイプロイン水溶液は生
糸、まゆ、生糸屑、キキ、ビス、ブーレツト等の
絹原料を常法に従い、セリシンを精練除去したも
のをフイプロインを溶解し得る例えばアルカリ金
属塩又はアルカリ土類金属塩等の水溶液又はシユ
バイツアー試薬（銅−アンモニア液）等を溶解せ
しめたもの、或いは更にそれを透析脱塩して得ら
れたものが挙げられるが、特に透析脱塩したもの
が好ましい。 前記のアルカリ金属塩及びアルカリ土類金属塩
としては、LiCl，LiBr，Nal，LiNO₃，MgCl₂，
MgBr₂，Mg（NO₃）₂，ZnCl₂，Zn（NO₃）₂等が使
用されるが、溶解性並びにフイプロインの分子量
を出来る限り高く保つためにCacl₂又はCa
（NO₃）₂の使用が好ましい。又、該金属塩濃度は
５〜80重量％、好ましくは20〜70重量％、特に好
ましくは40〜60重量％である。 又溶解性をより一層良好ならしめる為に、該水
溶液にメチルアルコール、エチルアルコール、プ
ロピルアルコール等のアルコール類の添加が好ま
しい。添加時期は、絹の溶解の前又は途中が良
く、又添加量は該金属塩溶液に対し、20〜60重量
％、好ましくは25〜50重量％である。 フイプロイン水溶液として前記の水溶液にフイ
プロインを溶解したものをそのまま用いても良い
が固定化プロテアーゼの酵素活性能をより高くす
る、あるいは塩析沈澱時に水不溶性塩の生成を防
ぐ等の観点から、好ましくはセロフアン膜に代表
される透析膜や中空繊維を用いた透析器により前
記塩類を除去したものを使用するフイプロイン水
溶液の濃度は通常２〜20重量％、好ましくは３〜
15重量％、特に好ましくは４〜10重量％に調整す
る。 一方酸性プロテアーゼの酵素水溶液の酵素濃度
は通常0.5〜30重量％、好ましくは１〜20重量
％、特に好ましくは５〜15重量％に調整する。フ
イプロイン水溶液と酵素水溶液を何らの調整もな
しに混合すれば酵素の量によるが数秒ないし少な
くとも数十秒以内にフイプロインが著しく分解さ
れ、実質的に工業的には固定化酵素を得ることが
できない。従つて安定した固定化酵素を得るため
には一時的に酵素活性を低減せしめ、フイプロイ
ンの分解をできる限り抑えねばならない。そのた
めには酵素水溶液及び酵素水溶液とフイプロイン
水溶液を混合した液のPHを８〜11、好ましくはPH
8.5〜10.5に調整しなくてはならない。PH11を超
えるとプロテアーゼが短時間に不可逆的に失活
し、得られた固定化プロテアーゼは酵素活性を発
現しない。又PH８未満では混合時に急速にフイプ
ロインが分解され実質的にプロテアーゼをフイプ
ロインで固定化し得ない。フイプロイン水溶液の
PHは特に限定されないが酵素水溶液と混合した場
合にPH調整することなくPH８〜11の範囲になるの
がよく、通常は該酵素水溶液と同程度のものが使
用される。酵素水溶液のPHは使用する酵素の種類
によりPH８〜11の範囲において最も安定して製造
できる条件を選択すればよい。又、酵素水溶液、
又は酵素水溶液とフイプロイン水溶液の混合液を
PH８〜11に調整して長時間放置すれば、酵素は
徐々に不可逆的に失活するので、少なくとも２〜
３時間以内に塩析沈澱させることが好ましい。 フイプロイン水溶液、酵素水溶液及びそれらの
混合液のPH調整にはカ性ソーダ、カ性カリ等のア
ルカリ、あるいはリン酸系、炭酸系、トリス等ア
ミン系等の緩衝水溶液等を用いることができる。
フイプロイン水溶液と酵素水溶液の混合は適当な
撹拌装置により両者が均一になるまで撹拌混合す
る。混合する際より操作を容易にかつ安定して固
定化酵素を製造するために液温を低温下、例えば
０〜15℃で行なつてもよい。 得られた酵素含有フイプロイン水溶液を無機塩
及び／又は有機塩によりフイプロインと酵素を塩
析沈澱せしめる。無機塩及び／又は有機塩の種類
は蛋白を沈澱せしめ得るものならば何でも良く、
例えば硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、硫酸
マグネシウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、
硝酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、酢酸ナトリ
ウム、クエン酸ナトリウム等が挙げられるが、酵
素活性能の保持あるいは経済性、操作性の観点か
ら硫酸アンモニウム、クエン酸ナトリウムが特に
好ましい。 塩析沈澱する方法は塩を固体のまま酵素含有フ
イプロイン水溶液中に投入混合する、あるいは塩
水溶液にして混合することにより行なう。無機塩
及び／又は有機塩はフイプロイン及び酵素が塩析
沈澱するに足る量であれば良いが、通常各塩類の
25〜70重量％飽和で行なう。 次いで、前記塩類を水洗により除去するが水洗
は２回以上、通常は４回程度行なう。水洗中にプ
ロテアーゼによるフイプロインの分解の恐れがあ
る場合には第１回目の水洗水のPHを８〜11、好ま
しくはPH8.5〜10.5に調整すればよい。水洗後、
乾燥して固定化プロテアーゼを得るが、乾燥はプ
ロテアーゼの不可逆的失活を防止するために60℃
以下で常圧又は減圧下に行なうことができる。得
られた乾燥固定プロテアーゼは目的に応じ、粉末
あるいは粒状等に成型することができる。 本発明により得られた固定化酵素は非常に高い
活性収率を有し、水中における連続使用において
も高い活性を維持し、酵素が流出することはほと
んど認められない。 又本発明の固定化プロテアーゼは高温下、広い
PHの範囲、あるいは各種媒体中等において元の酵
素よりはるかに高い安定性を示す。その上生体に
無害な蛋白のみからなる利点のため医薬、食品及
び化粧品等に有効に利用することができる。以下
実施例により本発明を詳述する。 実施例 １ 絹精紡屑（プーレツト）１Kgをマルセル石けん
0.5重量％水溶液304中に浸漬し、80℃で１時間撹
拌混合し、実質的にセリシン及び油分を完全に除
き、充分に水洗後70℃で乾燥した。 次いで65重量％の塩化カルシウム水溶液４Kgと
エチルアルコール1.6Kgの入つたニーダー中に前
記精練ずみのプーレツト0.8Kgを投入し、80〜85
℃で１時間撹拌溶解した。得られた粘稠な溶解液
に80℃の温水3.2Kgを加え希釈した。該溶解液の
フイプロイン濃度は85重量％であつた。更に溶解
液の一部を再生セルロース系中空繊維を用いた透
析装置によりフイプロイン透析液を得た。該透析
液のフイプロイン濃度は5.5重量％であつた。前
記溶解液及び透析液を５規定水酸化ナトリウム水
溶液によりPH９となしフイプロイン水溶液とし
た。 一方酸性プロテアーゼとして、ペプシン（シグ
マ社製）を用いプロテアーゼの濃度が10重量％と
なるように水に溶解した後、５規定水酸化ナトリ
ウム水溶液によりPH９に調整し、酵素水溶液を得
た。 液温５℃の前記フイプロイン水溶液500ｇに第
１表に示すような量の前記酵素水溶液を添加し、
充分に混合した。混合液のPHは8.7〜9.1であつ
た。次に混合液を１の飽和硫酸アンモニウム水
溶液中に投入混合し、フイプロインとプロテアー
ゼを沈澱させた。該沈澱物を別後500c.c.の水で
５回繰り返し洗浄し、次いで40℃にて15時間乾燥
し、ジエツト・ミルにて10〜60μの粉末状固定化
プロテアーゼを得た。 (1) 酵素活性 ヘモグロピン水溶液を１夜透析した後、
0.5N−HCl水溶液でPH1.8とし、室温で20分間
放置し酸変性ヘモグロピン溶液とする。これを
ヘモグロピン濃度が２％となる様に希釈し、測
定直前に2N−NaOH水溶液でPH2.5に調節した
ものを基質溶液とする。 適当量の固定化プロテアーゼを加え、37℃で
15分間反応した後0.4M−トリクロル酢酸水溶
液で反応停止し、不溶蛋白及び固定化酵素を
別し液の280nm吸光度測定により活性を測定
する。 活性収率（％）＝固定化プロテアーゼ中の活性発現プロテアーゼ量（ｇ）／固定化プロテアーゼ中の総プロテアー
ゼ添加量（ｇ）×100 (2) 固定化プロテアーゼ量 塩析に用いた硫酸アンモニウム水溶液及び水
洗液の酵素活性の測定から流出プロテアーゼ
量を算出した。 固定化率（％）＝添加プロテアーゼ量（ｇ）−流出プロテアーゼ量（ｇ）／添加プロテアーゼ量（ｇ）×100 (3) 熱安定性 80℃の熱風乾燥機中で固定化プロテアーゼを
１週間保存した後、酵素活性を測定した。 活性残存率（％）＝熱処理後の活性収率（％）／未処理の活性収率（％）×100 (4) プロテアーゼの水流出 内径２cm、長さ20cmのカラム中に固定化プロ
テアーゼ10ｇを詰め込み、上部より２ml／min
の割合で水と通過せしめ、連続１週間使用した
後、固定化プロテアーゼを取り出し、酵素活性
を測定した。 プロテアーゼ流出率（％）＝Ａ−Ｂ／Ａ×100 Ａ：未処理の固定化プロテアーゼ活性収率（％） Ｂ：流水処理 〃 （％） (5) プロテアーゼ含有量 固定化プロテアーゼ中のプロテアーゼ含有量
は次式により算出した。 プロテアーゼ含有量（％）＝プロテアーゼ添加量（ｇ）×固定化率（％）／固定化プロテアーゼ収量（ｇ）

【表】 第１表実験No.−(1)の比較例の如くプロテアーゼ
含有量0.1重量％未満の場合活性収率は低く、固
定化プロテアーゼ単位重量当りの酵素活性が著し
く低く、実用上使用が困難であつた。又実験No.−
(7)の比較例の如くプロテアーゼ含有量が20重量％
を超えると活性収率が低い上に熱安定性プロテア
ーゼの水流出率も劣化してくる。更に含有量を上
げるためには大量のプロテアーゼを用いねばなら
ないが固定化率が急激に低下するため経済的に非
常に不利であつた。 一方本発明方法によつて作製した固定化プロテ
アーゼは何れも固定化率、活性収率が高く、水へ
のプロテアーゼの流出も至つて少なく、その上固
定化しない元のプロテアーゼの耐熱活性残存率が
45.3％に比較してはるかに高い安定性を示した。 実施例 ２ 実施例１と同様にして得られた5.3重量％フイ
プロイン透析液１及びペプシン10重量％水溶液
50ｇを予め５℃とし、各々を10重量％トリス（ヒ
ドロキシメチル）アミノメタン水溶液を用いて第
２表に示したPH値に設定した。約５分間放置した
後、両者を混合し、約３分間撹拌した。続いて、
これを５℃の66重量％飽和硫酸アンモニウム水溶
液２に撹拌しながら添加した。得られた沈澱を
別採取し、PH8.5の0.01トリス緩衡液１を用
いて洗浄し、更に水１ずつで４回洗浄した後、
風乾した。これをジエツト・ミル粉砕し粒径10〜
50ミクロンの粉末とした。 これ等の粉末に就き、収率及び実施例１に述べ
た方法で、固定化率、活性収率及びカラム充填水
流通法によるプロテアーゼ流出率を測定した。結
果を第２表に示す。

【表】 第２表より酵素溶液及び、これをフイプロイン
溶液と混合した際のPH値を８〜11の範囲内にした
場合、収率、固定化率共に良好、且、活性収率の
高い固定化プロテアーゼを得ることが出来た。
又、流通テストによるプロテアーゼの流出も実質
上ない。しかし、実験No.（12）のようにPH値が高
いと、酵素は不可逆的に失活し、活性収率は殆ん
ど発現しない。又酵素が失活した為、固定化率は
求められなかつた。 又、実験No.(8)のように、PH値が８より低い場合
フイプロインの分解が急速に進行し、硫酸アンモ
ニウム水溶液に添加しても凝固性が悪く、収率は
著しく低下した。 又、固定化率、活性収率共に低く、更に流通テス
トによる酵素の流出も大きく実用に適さない。 実施例 ３ 第３表に示す各種の無機塩又は有機塩を用い、
フイプロイン透析液500ｇとプロテアーゼ水溶液
20ｇを用い、実施例１と同じ手法により固定化プ
ロテアーゼを得た。

【表】 塩の種類、量、又は混合方法により若干の差は
あるが、何れの塩を使つた固定化プロテアーゼも
優れた固定化率と酵素活性能を有していた。 実施例 ４ 実施例１と同様にして得た透析フイプロイン水
溶液を3.5，5.0，10.0、及び15.0重量％にフイプ
ロイン濃度を調製し濃炭酸ナトリウム水溶液にて
PH9.0とした。 酵素としてレンニン（シグマ社製）を用い、５
％水溶液とし、これを濃炭酸ナトリウム水溶液に
てPH9.5とした。以下実施例１と同様にして混
合、塩析、水洗、乾燥して固定化プロテアーゼを
得た。この場合混合時のPHは9.0〜9.3であつた。 酵素活性の測定は下記方法によつた。 ポリ−Ｌ−グルミタン酸５％水溶液に適当量の
固定化プロテアーゼを加え、5N−水酸化ナトリ
ウム水溶液でPH4.0に保ちつつ30℃で30分間反応
した後、固定化プロテアーゼを別し、液５ml
又は10mlにつき、中和後フオルモール滴定、即ち
10mlのホルマリン水溶液を添加し、0.1N水酸化
ナトリウム水溶液で滴定する方法により末端アミ
ノ基量を測定した。 ポリ−Ｌ−グルタミン酸５％水溶液についても
同様に測定しこれをブランクとして、末端アミノ
基の増加より活性を測定した。

【表】

【表】 第４表に示すように各種フイプロイン濃度、プ
ロテアーゼ水溶液添加量に於いて、得られた固定
化プロテアーゼは何れも活性収率が高く、又流水
中へのプロテアーゼの流出も０〜１％と至つて少
なく安定性のある固定化プロテアーゼである。 実施例 ５ 実施例１に述べた実験No.(3)及びNo.(5)の固定化プ
ロテアーゼ及び、その対照として元のペプシンを
次のような環境下で処理した後、活性を測定し、
比較した。 (1) グリセリン中 60℃で２日間 (2) 流動パラフイン中 60℃で５日間 (3) 乾燥機中（媒体なし） 60℃で７日間 (4) 〃 80℃で７日間

【表】 第５表に示す如く、本発明方法により得た固定
化プロテアーゼは、何れの環境下に於いても元の
プロテアーゼに比較してはるかに活性が維持され
ており、固定化の優位性が明白であつた。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ フイプロイン中に酸性プロテアーゼを0.1〜
   20重量％含有する固定化プロテアーゼ。 ２ フイプロインが粉末状である特許請求の範囲
   第１項記載の固定化プロテアーゼ。 ３ 酸性プロテアーゼを１〜15重量％含有する特
   許請求の範囲第１項記載の固定化プロテアーゼ。 ４ フイプロイン水溶液と、PH８〜11の酸性プロ
   テアーゼの水溶液とを混合してPHを８〜11に調整
   した後、無機塩及び／又は有機塩を用いてフイプ
   ロインと前記プロテアーゼとを塩析沈澱せしめ、
   次いで得られた沈澱を水洗後乾燥することを特徴
   とするフイプロイン中に酸性プロテアーゼを0.1
   〜20重量％含有する固定化プロテアーゼの製造
   法。 ５ 前記プロテアーゼ水溶液及び／又は混合した
   後の液のPHを8.5〜10.5とする特許請求の範囲第
   ４項記載の製造法。 ６ フイプロイン水溶液のフイプロイン濃度が２
   〜20重量％である特許請求の範囲第４項記載の製
   造法。 ７ フイプロイン水溶液が銅−エチレンジアミン
   水溶液、水酸化銅−アンモニア水溶液、水酸化銅
   −アルカリ−グリセリン水溶液、臭化リチウム水
   溶液、カルシウム或いはマグネシウム又は亜鉛の
   塩酸塩或いは硫酸塩又はチオシアン酸塩の水溶
   液、チオシアン酸ナトリウム水溶液よりなる群か
   ら選ばれた少なくとも１種の溶媒に精練絹原料を
   溶解後透析したものである特許請求の範囲第４項
   又は第６項記載の製造法。 ８ 前記プロテアーゼ水溶液の該プロテアーゼの
   濃度が0.5〜60重量％である特許請求の範囲第４
   項記載の製造法。 ９ 混合を０〜15℃の液温で行なう特許請求の範
   囲第４項記載の製造法。 １０ 無機塩及び／又は有機塩が硫酸アンモニウ
   ム又はクエン酸ナトリウムである特許請求の範囲
   第４項記載の製造法。 １１ 水洗をPH８〜11の水で行なう特許請求の範
   囲第４項記載の製造法。 １２ 乾燥を60℃以下で常圧又は減圧下で行なう
   特許請求の範囲第４項記載の製造法。