JPS5826957B2 - タンタイコテイアミノカゴウブツ ノ セイゾウホウ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 不溶性担体上にペプチド性物質（例えばペプチドホルモ
ン、酵素、抗体）を固定することは、多方面にわたる利
用可能性があるため以前から関心が持たれており、〔グ
ループホーファー（Ｇｒｕｂｈｏ−ｆｅｒ ）及びシャ
イス（Ｓｃｈｅｉｔｈ） ：ホソペザイラース・ツアイ
トシュリフト°フユール・フイジオロジツシエ・へＺ
（Ｈｏｐｐｅ ５ｅｙｌｅｒ’ ｓ Ｚ、 Ｐｈｙｓ
ｉｏｌ −Ｃｈｅｍ、）第２９７巻第１０８頁（１９５
４年）、ミシール（Ｍｉｃｈｅｅｌ ）及びエワーズ（
Ｅｗｅｒｓ ） ：マクロモレキュラー・ヘミ−（Ｍａ
ｋｒｏｍｏｌ 、 Ｃｈｅｍ、 ）第３巻第２００頁（
１９４９年）、レビン（Ｌｅｖｉｎ）。

ペヒト（Ｐｅｃｈｔ ）、ボルドスタイン（Ｇｏｌｄｓ
ｔｅｉｎ ）及びカチャルスキー（Ｋａｔｃｈａｌｓｋ
ｉ ） ：バイオケミストリー（Ｂ ｉ ｏｃｈｅｍｉ
５ｔｒｙ ）第３巻第１９０５頁（１９６４年）、ラ
イタール（Ｗｅｅ ｔａ １１ ）及びウイリキ（Ｗｅ
ｌ ｉｋｙ ） ：ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ ）第
２０４巻第８９６頁（１９６４年）参照〕、この方面に
おける研究成果の最初の発表以来数多くの特許明細書中
に記載が見られる。

それらのうち、多糖類および多糖類誘導体上への固定が
特に効果的であると認められるが、これは、おそらく、
担体上の固定物質が、例えば水和された多糖類からなる
担体上の固定化酵素で見られるように、天然に近い状態
にあるためだと考えられる。

その本質が比較的よく解明されていることから、担体と
しては、例えば、デキストランをエピクロルヒドリンで
処理して得られるような網目構造物質が好ましい（スイ
ス特許第５０１６９５号参照）。

この特許中では、膨潤性の大きいことから、同様に網目
構造化された澱粉ゲル、アガロース並びにマーセル化セ
ルロースが推奨されている。

ペプチド結合をもつ物質の固定には、との担体が、官能
基を導入することにより活性化されなければならない。

即ち、担体に結合した官能基とペプチド物質との間の化
学反応によりペプチド分子１個当り少なくとも１個の化
学結合ができるようにしなければならない。

これについても、多くの提案がなされている〔例えば、
アキセン等による、ネイチャー第２１４巻第１３０２頁
（１９６７年）ほかの引用文献〕。

緩和な方法のものとしては、先述のスイス特許（第５０
１６９５号）中の同じ箇所に、ヒドロキシ基もしくはア
ミノ基含有ポリマーをハロゲン化シアン処理して活性化
することが提案されている。

その後この方法は、原料物質（予め網目構造化したポリ
マーと、ブロムシアン）が比較的高価につくことを無視
し、またハロゲン化シアンの好ましからぬ性質を無視し
て広く普及した。

活性化工程における化学的過程、活性官能基の性質およ
びペプチド物質との反応様式については、担体の水酸基
の活性化とペプチド物質の塩基性窒素上への固定が起る
ことだけしか知られていない。

このような状態では、製品の品質が均質であり、原料物
質に欠点がなく、技術手段が簡潔で、しかも全体として
広範な利用性を有し、かつ経済性のすぐれた方法は、現
れる見込みが少ないと思われる。

一方また、このような方法は明らかに要望されている。

その理由は、生物工学における固定化酵素の製造と実用
化にとっては、今日の技術水準から考えて、価格面に問
題が残るだけだからである。

ところが、この発明によると、短工程の、安価な、しか
も極めて簡単な方法により、アミン固定能のある担体、
及び該担体上に固定された、良品質の、生物活性を有し
得るア□ノ化合物を、高収率で得ることが可能であるこ
とが判明した。

その方法は次の通りである。

即ち、シアン化水素酸及び／又は水溶性シアン化物と、
陽性塩素又は臭素を含有する試剤、例えば次亜塩素酸も
しくは次亜臭素酸及び／又はそれらの水溶性塩、又は加
水分解によりそれらの酸を与えるところの塩素もしくは
臭素化合物、又はそのようなハロゲン誘導体の混合物を
、アルカリ性条件下で、水溶性又は水膨潤性で非水溶性
であるポリヒドロキシ化合物に好ましくは低温で反応さ
せ、この反応生成物を必要に応じて中和し、（ａ）溶液
のときは、清澄化及び透析もしくはゲル沢過等により、
（ｂ）懸濁液のときは、沢過もしくは遠心分離及び洗浄
等により、これら溶液もしくは懸濁液中に存在する低分
子物質を除去してカルボンイミドイルジオキシ基を有す
るポリヒドロキシ化合物からなる担体を得ること、及び
該担体に、溶液もしくは懸濁液中において、水の存在下
に、必要に応じて緩衝液系中、５０℃以下、好ましくは
低温で、必要に応じて生物学的活性を有する、水溶性の
、少くとも１つの塩基性窒素原子において置換可能なア
□ノ化合物を反応させ、反応混合物から、例えば透析可
能な、もしくは溶液状に存在する物質を、水もしくは塩
水で透析することにより、該アミノ化合物が上記担体上
に固定された生成物を得ることである。

水溶性シアン化物としては、特にアルカリ金属のシアン
化物、例えばシアン化ナトリウムもしくはシアン化カリ
ウムが好適である。

全シアン化物、即ち、シアン化水素酸と水溶性シアン化
物との合計量は特に限定されず、ポリヒドロキシ化合物
の水酸基１グラム当量に対して、０．２５ないし６グラ
ム当量の広範囲の量比に亘って使用し得る。

反応にあたっては、全シアン化物とポリヒドロキシ化合
物を先に仕込み、これに陽性塩素又は臭素を含有する試
剤（以下、単に「試剤」と称する）を加えることができ
る。

網目構造化の度合い及びアミン固定能は、この「試剤」
が全シアン化物に対して不足する場合には、専らこの「
試剤」の量に従って変わる。

その他の因子として、使用したポリヒドロキシ化合物の
分子の水酸基密度とか、分子量又は反応性などがある。

有機結合した水酸基１グラム当量当りに消費された「試
剤」量が１／４グラム当量から１／２グラム当量である
場合には、そこに残存する過剰の全シアン化物は、網目
構造化並びに活性化の反応上に何ら取上げるべき程の影
響を与えるものでない。

しかしながら、「試剤」の少過剰量又は理論量を添加す
ることによって、存在する全シアン化物の大部分、又は
全部を消費し尽すということが、好都合である。

後者（理論量）の場合においては、たとえば次亜塩素酸
塩を用いる場合、アルカリ性反応溶液による法度カリ澱
粉紙の青色着色を検知しその当量点をふみ越えないよう
にすることができる。

この網目構造化が完遂されたときはじめて当量点に近づ
くのが有利である。

「試剤」過剰は早期に網目構造化反応や活性化反応を挫
折させてしまうものである。

網目構造化と活性化が十分行われた後「試剤」が過剰に
存在することは有利ではないが、１００％を実質的に越
える場合でない限り、何ら害は存在１−ない。

上記越える場合には、副反応により生じたシアン酸塩は
、網目構造化し活性化したポリマーの例えば次亜塩素酸
塩による損傷を防ぐに充分でｉい。

シアン酸塩は次亜塩素酸塩を次式により還元する： ２ＮＣＯ＋３０Ｃｌ＋Ｈ２０→２ＨＣＯ３＋３ＣＩｌ十
Ｎ２〔リスター（Ｌｉｓｔｅｒ） ：カナディアン・ジ
ャーナル・オブ・ケミストリー（Ｃａｎ、 Ｊ 、 Ｃ
ｈｅｍ、 ）第３３巻第４２６−４４０頁（１９５５年
）〕 上記の量的関係が、実際に損傷防止できる範囲を表わし
ており、それより上でも下でもないことを示している。

上記と類似の実施態様として、ポリヒドロキシ化合物に
全シアン化物の１部分のみをまず反応させ、残りを「試
剤」と共に反応混合物に加える方法がある。

この場合、少なくとも添加終了時までシアン化物が反応
混合物中に過剰に存在するように配慮するのが有利であ
る。

さらに、「試剤」を先に仕込み、後に全シアン化物とポ
リヒドロキシ化合物の混合物を添加することができる。

この場合、「試剤」を過剰にして作業すると、シアン化
物が消費されてしまうので不利である。

「試剤」特に次亜塩素酸塩のポリヒドロキシ化合物への
添加は、シアン化物の添加の前に行うことができる。

この場合、例えば次亜塩素酸塩とポリヒドロキシ化合物
との水性混合物を約Ｏ℃によく冷却して、攪拌下に、シ
アン化物水溶液中に滴下してゆくのが有利である。

又以下に記述する如く、一定条件下にシアン化物を、例
えば次亜塩素酸塩とポリヒドロキシ化合物との混合物に
、一度に添加することもできる。

この場合発熱が著しいので特に効果的な冷却を必要とす
る。

「試剤」特に次亜塩素酸塩がポリヒドロキシ化合物と反
応する際、一部のヒドロキシ基が次亜塩素酸によりエス
テル化されると思われる。

この反応は、必要により、ＣＯ２を導入することにより
又はドライアイスを入れることにより促進することがで
きる。

このように処理した。特に次亜塩素酸塩とポリヒドロキ
シ化合物との混合物を用いるに際しては、シアン化物溶
液のアルカリ性が、ＣＯ２のために失なわれた「試剤」
溶液のアルカリ性を十分補償するように注意しなければ
ならない。

次亜塩素酸塩としての次亜塩素酸ナトリウムまたはカリ
ウム漂白液は、好ましい「試剤」の例である。

次亜塩素酸塩の代りに、アルカリ溶液もしくは炭酸アル
カリ溶液と塩素ガスとの混合物を用いることもできる。

この場合には、アルカリとポリヒドロキン化合物及びシ
アン化物を仕込み、塩素ガスを通じる間に次第に反応混
合物を主成させることができる。

この仕込順序は、変えることができる。

すなわち、ポリヒドロキシ化合物とアルカリにまず塩素
を導入し、次にこれにシアン化物を加える。

反応に必要な量については、次亜塩素酸塩を用いた場合
と同様である。

次亜塩素酸塩溶液の製造の場合と同様に、塩素に対して
アルカリがやや過剰にあることが好ましい。

本発明の方法においては、一般に、次亜塩素酸のアルカ
リ塩は、加水分解により次亜塩素酸を生成しうるような
化合物によって代替することができる。

これには、次亜塩素酸と含窒素化合物とからなるエステ
ルであって、塩素が窒素に結合したものが該当する〔ツ
ーベン−ワイル（Ｈｏｎｂｅｎ −Ｗｅｙｌ ）第５／
３巻第７６０頁（１９６２年〕〕。

例えば、クロルイミド、クロルアミド、クロルイミン及
びクロルアミンのようなものがこれに含マれる。

代替化合物としては、次亜塩素酸エチル、プロピル、及
び第３級ブチル（ツウベン−ワイル第５／３巻第７６５
頁及び第６／３巻第４９１−４９２頁）、Ｎ−クロルア
セトアミド（ツウベン−ワイル第５／３巻第８００頁）
、Ｎ−クロルアセトアミド（ツウペン−ワイル第５／３
巻第７９９頁）、クロルアミンＴ及びジクロルアミンＴ
（ツウベン−ワイル第５／３巻第８０８頁）並びにクロ
ルアミン（ツウベン−ワイル第５／３巻第７９６頁）が
用いられる。

クロルアミンがカリウムのシアン化物でクロルシアンに
転化するだろうと述べている報告（パイルシュタイン第
３巻ＥＴＩ第３２頁）があるが、これは正しくないこと
がわかっている。

この反応ではクロールシアンは全く生成せず、可成りの
量のカリウムシアネートが生成する〔マルクバルト（Ｍ
ａｒｋｗａｌｄ ）及びウイレ（Ｗｉｌｌｅ ）、ベリ
ヒテ・デル・ドイツチェン・ヘミツシエン・ゲゼルシャ
フト（Ｂｅｒ、 ｄｔｓｃｈ 、 ｃｈｅｍ 、 Ｇｅ
ｓ 、 ）第５６巻第１３２５頁（１９２３年）〕。

Ｎ−クロル化合物と同様に、その類似体の臭素化合物、
例えば、Ｎ−プロムサクシンイミドもしくはＮ−ブロム
アセトアミドのようなものは最も効果よ（使用すること
ができる。

それ故、この発明の方法には、相当するＮ−ブロム化合
物特に次亜臭素酸アルカリ及び次亜臭素酸自身を使用す
る場合が含まれる。

塩基性窒素含有Ｎ−ハロゲン化合物を用いる際には、−
・ロゲンの放出の際に、直接、又は緩和な加水分解後、
アンモニア又は第３級アミンを遊離するものに限定する
のが有利である。

この例としては、クロルアミン（ＮＨ２Ｃｌ）及びピリ
ジニウムブロマイド−パーブロマイドがある〔ビュルタ
ン・ド・う・ソシエテ・シミク・ド・フランス（Ｂｕｌ
ｌ。

Ｓｏｃ、 Ｃｈｉｍ、Ｆｒａｎｃｅ １９５２年第３３
１頁）〕。

アンモニアは、経験上ア□ン固定用の基（ＣＣ＝ＮＨ）
をおかすことはない。

その理由は、その作用が交換反応のみであり、交換反応
のみでは上記固定用の基が変らないからだと考えられる
。

第３級塩基は、置換可能な水素原子をもたないため固定
されない。

次亜塩素酸エステルから生ずる低級脂肪族アルコールは
、普通０−シアン化反応が行われるとき、ポリヒドロキ
シ化合物とほとんど競合して反応しない。

網目構造化と活性化には、その反応系がアルカリ性であ
ることが必要とされ、特にそのｐＨが１０乃至１３位で
あることが好ましい。

例えば、ポリヒドロキシ化合物とシアン化ナトリウムの
水性混合物に、次亜塩素酸ナトリウム（ソーダ漂白液）
、クロルアミン、クロルアミンＴ１もしくは次亜塩素酸
第３級ブチルの伺れか１つの溶液を添加するときこのこ
とが必要になる。

また、このことは、まずポリヒドロキシ化合物の水性混
合物を作り、次に（・わゆる・・ロゲン搬送体を作り、
この混合物にシアン化ナトリウム水性溶液を添加すると
きも、同様である。

その他の場合として、混合物中に存在するか又は添力旧
７た成分のアルカリ性が強すぎるとか、はとんどアルカ
リ性がないとか、又は全く酸性であるとかであり、他の
成分に充分な緩衝能がない場合には、好ましいｐＨ値を
この混合物中で維持するために、強酸もしくは弱酸、強
塩基もしくは弱塩基、又は緩衝剤の塩類の１種以上の必
要量を添加する。

これらの添加化合物としては、塩酸、二酸化炭素、水酸
化アルカリ、アンモニア、炭酸アルカリ、炭酸水素アル
カリもしくはアンモニウムクロライド等が含まれる。

このような場合の例は、陽性塩素として塩素水を使用す
る場合、及びシアン化物としてのシアン化水素酸を使用
する場合である。

両成分が強アルカリ性もしくは弱アルカリ性でありすぎ
たり又は酸性であったりするときは、勿論適当な緩衝作
用仝得る措置をとることができる。

ポリヒドロキシ化合物とシアン化物および／又はシアン
化水素酸との混合物、又はポリヒドロキシ化合物と「試
剤」の混合物は、反応系の一成分として理解される。

この場合、相手の成分は、この発明の方法の反応に必要
な物質即ち「試剤」又はシアン化物および／もしくはシ
アン化水素酸である。

上記各成分は、置換反応を行うために仕込み、その後で
相手成分を添加するか、又は逆の順序で仕込む。

上記のｐＨ範囲下限ではシアン化水素酸、次亜塩素酸及
び次亜臭素酸は同様に不完全中和状態にある。

陽性塩素又は陽性臭素含有有機次亜塩素酸エステル又は
窒素化合物の加水分解により生成する次亜塩素酸又は次
亜臭素酸を、全部叉は一部中和することは、上述のよう
にしばしば有利である。

窒素化合物がそれ自身塩基性を有しているときは、中和
することば必要でない。

水酸化アルカリ又は炭酸アルカリのアルカリ化作用は過
剰のシアン化アルカリで代替できる。

例えば、クロルアミンＴＣＨ３Ｃ６Ｈ４ＳＯ２ＮＮａＣ
ｌのように窒素化合物が塩の形のときは、次亜ハロゲン
酸の中和を考えてアルカリを添加することはむしろ有害
である。

ポリヒドロキシ化合物としては、特に、澱粉、澱粉糊、
水溶性澱粉、デキストリン、デキストラン、網目構造テ
キストラン、セルロース、マーセル化セルロース、セル
ロース繊維、アガロース、ペクチンなどの炭化水素化合
物が好適である。

原材料物質として用いる炭水化物即ちポリヒドロキシ化
合物の重合度は、これら化合物の溶解性と膨潤性の両性
質のわるくならぬ範囲内のものであれば任意にきめてよ
い。

また、蔗糖を用いても、この発明に従い、酵素固定能の
十分ある不溶性製品を得ることができる。

しかしながら炭水化物に限定されるものではない。

水溶性のポリビニルアルコールにおいても、例えばシア
ン化物／次亜塩素酸系での処理によって、満足すべきア
□ン固定能をもつ不溶性親水生成物を得ることができる
。

ポリヒドロキシ化合物の網目構造化と活性化は、溶液の
凝固点乃至５０℃位の範囲内で行うが、０℃乃至室温で
行うのが好適である。

ポリヒドロキシ化合物を「試剤」およびシアン化物で処
理するには、この発明に従い次のように行う。

ポリヒドロキシ化合物が例えば蔗糖のように水溶性で透
析できるものであるか、又は可溶性澱粉デキストリンお
よびデキストランのように単に水溶性のものである場合
には、短時間の中に、実質的に定量的収率で重縮合体が
濃いモロモロ状のものとなり沈澱してくる。

澱粉糊のような高分子物質は、そのゲル性を喪失してモ
ロモロ状の濾過し易い物質になる。

網目構造化したデキストランは、不溶性であり、その構
造組織が緻密なものとなる。

マーセル化セルロースとアガロースにおいては、それほ
ど明白ではないがしかし確認できる変化を示す。

これらすべての物質は、アミン固定に対する特別顕著な
能力を示す。

即ち、これらはすべて固定能がある。

この網目構造化と活性化との組合せにおいては安価なポ
リヒドロキシ化合物を用いて、簡単な手段により高品質
の活性網目構造生成物を得ることができ、しかも極めて
ありふれた薬品と設備とを用いることによって、重要か
つ意外でしかも経済性ある進歩した技術が得られる。

この活性化生成物には、特に、蛋白質、ポリペプチド、
オリゴペプチド、アミノ酸もしくはアミンなどで、次式
＝ＨＮ／Ｒ（ｘ） ＼Ｒ’（Ｙ） （ただし、式中Ｒ（ｘ）ｈ水素、又はＸのところに水素
もしくは官能基を有する基、Ｒ’（１つはＹ位置に水素
もしくは官能基を有する基である）で示されるものが適
当である。

それ故、水安定性を有する範囲内で任意の官能基を有す
るポリサッカライドを簡単な手段により得ることが可能
になった。

活性化生成物が水不溶性の場合には、これを懸濁液中に
存在させ、アルカリ性を中和してから直接アミノ化合物
を反応させることができる。

しかし、多くの場合には、不溶性物質をｒ過器上に集め
、水、塩水及び緩衝液で洗浄することが有利である。

このとき蛋白質安定剤（例えばグリセリン又は錯塩形成
剤）を添加してもしな（でもよい。

この湿ったｆ過残渣は活性基が失活し易いのですばやく
水溶性アミノ化合物溶液で置換反応させるのが有利であ
る。

活性化生成物が水溶性の場合には、必要に応じてアルカ
リ性を中和し、直接アミノ化合物を用い置換反応を続行
することもできる。

しかし、多くの場合には、必要に応じてアルカリ性を中
和後代分子物質を透析により除去し、その後でアミン化
合物を置換反応させることが有利である。

不溶性の固定生成物は、ｐ過可能なことと、その流体特
性のために流動反応系処理（連続式カラム処理）に使用
するのに最も適している。

しかし場合によっては、例えば網目構造化の程度が低く
そのためモロモロ状にならないところの水溶性澱粉のよ
うなものから作った活性化網目構造生成物を用いるか、
もしくは、網目構造化処理をしたにもかかわらず溶液状
に存在するところの活性化ペクチンおよび粘液素を用い
て、低分子量アミノ化合物の置換反応を行うと往々にし
て可溶性であるが透析しにくい固定生成物が得られる。

シアン化物／「試剤」処理、即ち網目化処理および活性
化処理ずみのポリヒドロキシ化合物と、アミン化合物と
の間に行われる置換反応は、好ましくは、中性乃至弱ア
ルカリ性乃至中程度アルカリ性の範囲内で、例えば水も
しくは炭酸水素ナトリウムもしくは炭酸ナトリウムの存
在下に行い得る。

この反応では、アミノ化合物を過剰に添加し、必要に応
じ冷却下に処理することが有利であり、この場合また反
応系の濃度をできるだけ高く保つことが有利である。

濾過残渣が、凍結乾燥されたアミノ化な物を溶かすに充
分な水を含んでいる場合がある。

この場合には、アミノ化合物を単に沢過残渣と共にかき
まぜるだけでよい。

これを放置することにより１司定化がすすむ。

固定化は往々沢過残渣をかきまぜることにより促進され
る。

上述の水溶性ポリマーの場合は炭酸水素アルカリ水溶液
中でオキシトシン、バンプレシン、アンギオテンシン、
β１−２４−コルチコトロピンなどが固定される。

反応が終ってから、未反応物質や塩を除去するには、濾
過（セファデックスＧ−２５使用）もしくは透析をする
。

生成物のアミノ酸分析をすると、乾燥物質当り２％乃至
２０％のペプチド性物質を含有することが判る。

上述の水不溶性ポリマーの場合には、濾過残渣の洗浄液
（１％Ｎａ ＨＣｏ ３溶液）に含まれていた炭酸水素
ナトリウムの存在下に、又第２の実験手順ではさらに洗
浄工程で用いたグリセリンの存在下に（洗浄液：１０％
グリセリン、１％ＮａＨＣＯ３１次の酵素を沢過残渣に
添加し攪拌して固定化することができる。

ヘキソキナーゼ リボヌクレアーゼ トリプシン キモトリプシン カルボキシペプチダーゼ アシル−Ｌ−アミノ酸−アシラーゼ 乾燥活性化担体１重量部当り１／４乃至１／２重量部、
時には１重量部の蛋白質を加えるのが有利である。

この担体−蛋白質化合物中の蛋白質分は、乾燥重量で約
３％乃至３０％である（アミノ酸分析による）。

アミロペクチン、澱粉、水溶性澱粉、デキストリン、テ
キストラン、セルロース、セルロース繊維、セファデッ
クスＧ２００、蔗糖及びポリビニルアルコールの乾燥重
量１００ｍｇ当りシアン化ナトリウム５０乃至４００Ｔ
ｎ９を用いて活性化処理すると酵素活性物質が得られ、
これは炭水化物固定製品特有の安定性を備えた製品であ
る。

それ故、酵素は普通フィルターケーキにするのが一番よ
いのであるが、低分子量アミノ化合物、例えばオリゴペ
プチド、脂肪族及び芳香族のアミノカルボン酸またはア
ミノスルホン酸、アミノフェノール、脂肪族及び芳香族
のアミノアルコール、ジアミン及びポリアミン、例えば
脂肪族アミン、脂環式アミン、複素環式アミン、及びこ
れらの置換可能な塩基性窒素含有水溶性誘導体は、多少
とも濃厚水溶液状態で固定化に用いるのが好ましいこと
が判明した。

例えばシアン化物／次亜塩素酸塩処理した「アミロペク
チンフラクション」水性溶液を用いて次のアミノ化合物
を固定化することができる。

非均質分解反応の実施に用いる反復ペプチド「クリシン
−プロリン−アラニン−グリシン−プロリン−アラニン
」、 アフィニティークロマトグラフィーに用いるリボヌクレ
アーゼからのＳ−ペプチド、 アシルアミノ酸アシラーゼの基質類似物質としてのｐ−
ア□ノフェニルーα−Ｎ−アセチルーアフニン、 アシルアミノ酸−アシラーゼの基質類似物質としてのク
リシル−フェニルアラニン、 クロマトグラフの吸着剤を得るためのグルタミン酸及び
スルファニル酸、 光学的活性形成剤を得るためのデヒドロアビエチルアミ
ン、 加水分解触媒を得るためのイミダゾール、ヒドロキシル
アミン、ヒドラジン、フェニルヒドラジン、ｐ−アミノ
フェノール及び還元剤を得るためのｐ−フェニレンジア
ミン。

この固定化アミノ化合物の性質、特に固定された生物学
的活性なペプチド及び蛋白質の特性は、一般に文献や特
許明細書に記載されたものと変りがない。

ポリヒドロキシ化合物の網目構造化の化学反応が何に基
づくのか、また、この網目構造化した生成物のアミノ化
合物を固定する活性又は能力が何に基づくのかは正確に
は判っていない。

同じような条件下のシアン化物／次亜塩素酸塩系でクロ
ルシアンが生成しないことから、クロルシアンの生成が
中間に行われるとの推定は排除される。

実際にまた、ｐＨ９以下では、塩素はシアン化アルカリ
からクロルシアンを作ること、 クロルシアンはアルカリによってシアン酸アルカリに転
化されること、及び 次亜塩素酸塩によるシアン化アルカリの酸化でシアン酸
アルカリを生成する際、クロルシアンを思い出させる臭
気を発生すること などの事実は知られている。

このような文献の記載から、勿論のことであるが、シア
ン化物を次亜塩素酸塩酸化してシアン酸塩を生成する瞬
間にクロルシアンが生成するのではないかということが
考えられる。

それにも拘わらず、本発明によるポリヒドロキシ化合物
の次亜・・ロダン酸塩／シアン化物処理（以下■と表示
）では、公知のポリヒドロキシ化合物のアルカリ／ノ・
ロゲンシアン処理（以下■と表示）による場合の変化が
全然起こらない。

このことは、水溶性ポリヒドロキシ化合物、例えば水溶
性澱粉を用いて■及び■の方法を実施してみると最も簡
単明瞭に上記のことがわかる。

水溶性澱粉は、■及び■に相当する処理に付すと共に網
目構造化して不溶となる。

この網目構造化生成物はモロモロの状態で沈澱し、離別
容易でかつこの生成物にアミン化合物を固定する能力を
備えるに到る。

これは丁度、例えば、スイス特許第５０１６９６号のそ
れのようにハロゲン化シアンによる網目構造化デキスト
ラン（セファデックス）もしくはセルロースの活性化処
理と全（同様である。

澱粉の網目構造化と明かに同時に起こるこのアミン固定
能導入現象は、現在の知識によると、次のような図式で
示される。

網目構造化反応（工程口）は、同じように■及び■に続
いて行われ、同じようにｐＨに依存性をもつ。

Ｏ−シアン化反応（工程イ）は、■の場合においては、
澱粉分子の脱プロトン化した水酸基の存在に大いに関係
しており、かつ、アルカリ系媒体からの水酸基イオンに
よる競合現象がみられる（副産物としてのシアン酸アル
カリの生成）。

又■の場合においては、この工程の最初の段階において
、クロルシアンの瞬間的な生成が事実である〔グメリン
のハンドブーツ・デル・アノルガニツシエン・ヘミ−８
版Ｃ（Ｄｉ ）第１４巻第３５頁と第３７頁（１９７１
年）参照〕とするならば、上記の場合と同様な関係が存
在しなければならない。

ともかく同じような条件下にあるときは、■は常に少な
くとも■と同様の反応速度を持っていなければならない
。

■の場合にハロゲン化シアンの生成があると仮定するな
らば、■では全工程（不溶性網目構造生成物析出）にと
り工程イの段階が速度決定要素になるのであるが、この
段階では、ｐＨ依存性があって、この点工の場合とは全
く趣を異にする。

これは、「参考」中に詳述した実験から明らかである。

以下に述べる実施例は、本発明の網目構造化反応、活性
化反応並びにア□ン固定化を示すものであるが、これら
は本発明を限定するものでない。

以下すべて温度ば℃で表示する。

実験の部 １、網目構造化反応および活性化反応 薬品： ソーダ漂白液二 次の製法を用いた。

即ち、苛性ソーダ８０ｇ、水３７５ｇおよび氷３７５ｇ
に、０℃以下で強く攪拌しながら、系の重量増加が６６
ｇになるまで（５時間）塩素ガスを通じた。

こうして新製した溶液は、次亜塩素酸ナトリウムが約７
．５重量％（よう素法）含まれており、そのｐＨば１１
．５であった。

シアン化ナトリウム： 「実験用」純度の市販品を用い
たが、これはソーダ漂白液で滴定した結果、純度約１０
０％であった。

ポリヒドロキシ化合物： 水溶性澱粉、馬鈴薯澱粉、水
溶性ポリビニルアルコール、糖類（蔗糖） 、粉末セル
ロース「アビセル」（マーセル化処理ずみ）、微粉化セ
ルロース繊維ＭＮ３００（フイルマ・マヘレイ・ラント
・ナーゲル社製）、木綿糸（マーセル化処理ずみ）、ビ
スコース人絹糸（マーセル化処理ずみ）などの市販品を
用いた。

試験手順二 下記の各実施例参照。

操作： 可溶性網目構造生成品を沢過、もしくは遠心分
離（清澄化）により精製し、次いでゲル濾過もしくは透
析により低分子物質を除去する。

不溶性の網目構造化生成物は普通はモロモロ状になり沈
澱して（るが、これは概ね１過容易である。

そこでと過および水洗によりできる限りアルカリその他
の可溶物分を除去する。

このものを直ちにアミン固定化処理に用いない場合には
冷所に貯蔵する。

このアミン固定化能は一般に極めて安定である。

室温多湿状態に永く放置しても殆どの場合異状はない。

実施例 （１）水溶性澱粉／次亜塩素酸塩もしくは次亜塩素酸 水溶性澱粉２ｇを水１００ｍ１Ｋ懸濁し、水浴上で加熱
して溶解し、冷却する。

この溶液の５Ｔｌｌ（１００■の澱粉を含有し、−ＯＨ
価約２ミリＶａｎに対応）に夫々１００１ｎ９（２ミリ
モル）のシアン化ナトリウムを添加し、水で１０．２５
もしくは５０ｍ１に稀釈し、−５°Ｃもしくは０℃もし
くは】０°Ｃに冷却し、よく冷却］しなから、１／２□
リモル、又は１ミリモル、又は２ミリモル、又は４ミリ
モルの次亜塩素酸塩に匹敵する漂白液を滴下する。

次亜塩素酸塩を０．５ミリモル乃至１ミリモル添加した
ときに、反応混合物の温度と容積に無関係にモロモロの
沈澱が生成し始める。

沈澱物の乾燥重量は約１００ＷＩＩ？である。なお、シ
アン化ナトリウウを５０１ｎ９（１ミリモル）を用いた
実験でも殆ど結果は変らなかった。

実験は次のように行った。

全次亜塩素酸塩を、澱粉／シアンｒヒ物混合物に一度に
添加したが、このときシアン化物が過剰に存在するよう
にしたときにのみ確実にモ□モロが生じた。

シアン化物が不十分の場合には、反応は主としてシアン
化物の酸化反応のみになるようにみえる。

このような考え方は、次亜塩素酸塩を先に仕込んでおい
て澱粉／シアン化物混合物を後から添加したときに確か
められる。

この場合、添加を一度に行わす滴々添加してゆくと、シ
アン化物が過剰になるようになってもモロモロした沈澱
は生成して来ない。

これに対して、一度に添加すると、シアン化物を過剰に
存在させればモロモロ生成品かえられる。

これについては、「参考」の所で論する反応機構論を比
較参照するとよい。

上述の反応溶液のｐＨは大体１２位である。

澱粉／シアン化物混合物を水の代りに０． Ｉ Ｎ苛性
ツーダ液で稀釈すると、生成品はモロモロになって析出
して来ない。

ｐＨ１３はほぼ上限値を示す。

水１５ＴＬｌに澱粉１００１１Ｔ９とシアン化ナトリウ
ム１００■を加え（ｐＨｉｉ、２）、０℃乃至５℃で、
５分間内に２ミリモルの次亜塩素酸塩と２ミリモルの炭
酸水素ナトリウムの水溶液を添加するか、もしくは２ミ
リモルの次亜塩素酸ソーダ及び１ｇのドライアイスを１
０ｒＩＬｌの水に入れた反応生成物（ｐＨ７，８）を添
加すると、何れの場合でも、添加し終えるまでにすでに
モロモロの凝集物が生成してくる。

添加が終了したときのｐＨばそれぞれ１１．０と１０．
６であった。

一方これとは別に、上記と同様の澱粉／シアン化物混合
物に２ミリモルの塩酸と２．５ミリモルの炭酸カリウム
を添加（全容積１５ ｒｕｌ、 ｐＨ１０，０）する。

この溶液にｐＨ７，８の次亜塩素酸を作用させても倒れ
の場合もモロモロの凝集物はできてこない。

これら反応混合物の終ｅＨは約１０．０である。

この澱粉／シアン化物混合物は、２ミリモルの塩酸及び
０．１２１７モルの炭酸カリウムの添加によりｐＨ９，
８にするかもしくは、２ミリモルの塩酸の添加によりｐ
Ｈ約７ ［Ｌ、ｐＨ７，８の次亜塩素酸溶液で反応させ
た後のｐＨが９．６と７．５である場合には、モロモロ
の沈澱が析出しない。

従ってこのｐＨは下限値は大体１０位になる。

澱粉／シアン化物混合物のアルカリ度は、アンモニウム
クロライドの添加によって任意の値に抑制することがで
きる。

（２）水溶性澱粉／塩素及び苛性ソーダもしくは炭酸カ
リウム 澱粉１００■を含有する５ｒ／ｌｌの溶液に、１００ｍ
９（２ミリモル）のシアン化ナトリウム、２ｍもしくは
それ以上の１モル炭酸カリウム溶液（（少なくとも２ミ
リモル）および８７７１１の水を添加し、０℃に冷却し
、１０ｇの氷を入れ、よく冷却しながら、反応混合物が
灰塵カリ澱粉紙に対して陽性になるまで塩素ガス（２ミ
リモル）を通す。

モロモロの生成物が析出してくる。５ｍｌの澱粉溶液、
２ｍｌの２規定苛性ソーダ液、３Ｍの水、及び１０ｇの
氷をよく冷却しながら、塩素（約２ミリモル）を通し、
その系のｐＨが９．５から１０の間にあるようにして、
次に５ＴＬｌの水に溶かした少なくとも１００■のシア
ン化ナトリウム溶液をそこへ一度に注入すると、上記と
同様にモロモロの生成物が析出して（る。

このような実験から、シアン化物が過剰に存在すること
が効果のあるものであることがわかる。

（３）澱粉糊／臭素及び苛性ソーダもしくは炭酸水素カ
リウム ３００ｍ９の澱粉を水３５７７１１に入れて７０℃まで
加温し、冷却し、毎分３０００回転の遠心分離器に５分
間かけ、上澄みを傾斜法で除き、乾燥重量約１００■の
残留物に、２Ｍの２規定苛性ソーダと５ｍｌの水に１１
０ｍ９（２，２ミリモル）シアン化ナトリウムを溶かし
た溶液０．５ＴＬｌを加え、０℃乃至５℃に冷却し、こ
のとき同時に残りのシアン化物溶液と３２０７７９の臭
素（２ミリモル）を強く攪拌しながら、沃化カリ澱粉紙
を用いて臭素や次亜臭素酸塩が常に過剰にならないよう
に別々に滴下した。

１過し易い網目構造物が析出した。

このとき苛性ソーダ、シアン化物、および臭素は２倍量
まで使ってもその結果は変わらない。

しかしながらこれらを１／２倍量用いたときは、悪い結
果となる。

またこの澱粉糊に、１１０■のシアン化ナトリウム（２
，２ミリモル）と少なくとも４ｍｌの１モル炭酸水素カ
リウム溶液を加え、次いで冷却下３２０Ｔｎ９の臭素（
２ミリモル）を滴下し、この糊を網目構造化することに
よりと過容易なものとすることもできる。

第３番目の実施態様として、この澱粉糊に３２０７ＴＩ
９の臭素を添加し、よく攪拌冷却しながら少なくとも４
ＴＬｌの１モル炭酸水素カリウム溶液を滴下し、１５分
放置後、５ｒｒＬｌ水にシアン化ナトリウム（２，８ミ
リモル）１４０■を溶かした液を添加した。

このとき攪拌は十分強（するよう配慮した。

（４）水溶性澱粉／クロルアミンＴ 澱粉溶液（１００ｍ９の澱粉含有）５縦に、１００ｍｇ
のシアン化ナトリウム（２ミリモル）を２０１ｒＬｌの
水に溶かしたものを加え、５℃で、ｌ１分以内に、２縦
のジオキサンに溶かした５６２ｍｇのクロルアミンＴの
トリヒトラード（２ミリモル）溶液を、よくかき混ぜな
がら滴下する。

とのクロルアミンの添加終了前にすでに凝集生成物が生
じる。

この場合２０℃で行うこともでき、および／もしくはク
ロルアミンＴの水溶液を用いることもできる。

（５）水溶性澱粉／Ｎ−ブロムサクシンイ□ド５ＴＬｌ
の澱粉溶液（１００ｒＩＩＩｉＩ（７）澱粉含有）に１
５Ｔｌｌの水に溶かした１００ｍ９のシアン化ナトリウ
ム（２ミリモル）と１７７１１の２Ｎ苛性ソーダとを添
加し、さらにそれに２０℃でジオキサン２ｍｌに３６０
ｍ９のプロムサクシンイミドを溶かした溶液をよく攪拌
しながら滴下する。

添加時間は１５分である。

反応がすすみ約７分間後からばつきりと濁ってくる。

Ｎ−７”ロムサクシンイミドの代りにＮ−フロムアセト
アミド又はＮ−クロルサクシンイミドも使用することが
できる。

（６）水溶性澱粉／クロルアミン ＩＮアンモニアと氷の混合物に苛性ソーダ漂白液（１モ
ルアンモニア／１モン次亜塩素酸ナトリウム）を添加み
、減圧（Ｋ 二３５℃）２０ 蒸留し、十分冷却した受器にクロルアミン水溶液を凝縮
させる。

ヨードメトリで含有量測定をする。

１００■の澱粉を溶かした澱粉溶液５ｍ７Ｋ、１０ｙｄ
の水に２□リモルのシアン化ナトリウムを溶かしたもの
を添加し、２℃乃至４℃に冷却し、よく冷却と攪拌を保
ちながら１０ｍのクロルアミン（２ミリモル）溶液を滴
下する。

１過しやすい網目構造生成物が沈澱してくる。

その乾燥重量は約１００■である。

多少のアンモニアがクロルアミン溶液に残ってモ無害で
ある。

（７）水溶性澱粉／次亜塩素酸第３級ブチルよく攪拌し
ながら、５℃で、５ｍｌの澱粉溶液（１００ｍＩ？の澱
粉含有）と１００■のシアン化ナトリウム（２ミリモル
）を２０ＴＬｌ水に溶かしたもの（ｐＨ１１，１）に、
２１７１ｒ１ｇ（２ミリモル）の新鮮な未蒸留次亜塩素
酸第３級ブチルを滴下する。

黄色のエステル滴が完全に消える前に反応が起り（異光
）、数秒後に網目構造化反応生成物の凝集物が生じる（
ｐＨ１０，８）。

澱粉／シアン化物混合物に１ ｒｒｉｌ乃至２縦の１Ｍ
苛性カリ液を先に混入しておいても結果は同じようにな
る。

次亜塩素酸エタノール、プロパツールモジくは第３級ア
ミルアルコールなどのエステルを用いても上記と同じよ
うな結果が得られる。

（８）アミン固定化能力をもつ水溶性生成物高度稀釈（
５０−１１００ＴＬｌもしくはそれ以上の水に１００Ｔ
ｎＩ？の水溶性澱粉を溶解）を行い、上記（１）項乃至
（２）項及び（４）項乃至（７）項に記述の方法に準じ
、上記のＰＨ範囲内で、強い攪拌下に処理すると、モロ
モロの凝集物は得られ私亦、溶けている物質は明らかに
同様にアミン固定化能を持ち、特に低分子量で透析し得
るアミノ化合物に対して固定化能を有する。

有機水酸基１当量に対し、シアン化物又は次亜塩素酸塩
０．２５当量の如き網目構造化反応用最低限量使用時も
定性的には上記各踏倒と同一性ある効果を確保し得る。

（９）蔗糖／次亜塩素酸塩 １０ｍ＃）水に１００７／ｌＩ？の蔗糖を溶かしく２．
３４■当量有機水酸基）、これに１００ＴｒＩ９のシア
ン化ナトリウム（２ミリモル）を添加し、５℃乃至１０
℃に冷却し、さらに、強く攪拌しながらソーダ漂白液の
形の次亜塩素酸ソーダ２ミリモルを添加する。

次亜塩素酸の半量添加後には既にモロモロに凝集した網
目構造生成物が沈澱してくる。

次亜塩素酸塩添加終了後これを１過し十分よく洗浄する
。

このもののアミン固定化能は優秀である。

これを乾燥して大略１００■を得た。

この化合物はアルカリ性反応媒体中に２〜３時間放置す
ると液化してしまうということは特記に値する。

また蔗糖１００■、水１０ｍ７、シアン化フロム１０６
■（１□リモル）又Ｕ２１２ｒｒｕ？（２ミリモル）、
及びＩＮ苛性ソーダ１ ｍｉｌ又は２１ｒＬｌを用いて
得た生成品も同じ特性を持っている。

これらの蔗糖誘導体は新規化合物である。

たとえばトリサツカライドのラフイノーズやテトラサツ
カライドのスタキオーズのような未還元の少糖類におい
ても、上記の場合と同様な関係が得られる。

これらより得られる網目構造化生成物も新規化合物であ
る。

００） ポリビニルアルコール／次亜塩素酸ポリビ＝
−ルフル−ｚ −／ｌ／ １００ ｍ９ （２，３ｍ
ｇ当量有機水酸基）を沸騰水１０ＴＬｌに溶解し、冷却
したシアン化ナトリウム１００１ｒＩ９の（２ミリモル
）溶液を添加し、０℃乃至５℃、攪拌下において、ソー
ダ漂白液の形で次亜塩素酸ナトリウム２□リモルを添加
する。

網目構造化生成物が大形の若干粘着性あるモロモロ凝集
物として沈澱して来る。

これを前記同様１別し洗浄する。この生成物は、実施ｆ
ｌｊｌ）乃至（９）における生成物のように水と接触さ
せても安定であるが、アルカリ性媒体中では蔗糖誘導体
同様液化してし１う。

αυ 綿糸／次亜塩素酸塩もしくは次亜塩素酸５００７
Ｖの未精練綿糸を、脱脂のため水と煮沸し、アルコール
で２回、四塩化炭素で２回、及びエーテルで２回洗浄処
理を行い、次に風乾した。

そしてさらに、この綿糸を空気を遮断して１７％苛性ソ
ーダ液中に１夜放置し、よく水洗して、ｌＯ′ＩｆＬ／
！の水に溶かした５００■のシアン化ナトリウムを添加
し、さらに０℃乃至５℃の範囲内でソーダ漂白液の形で
１０ミリモルの次亜塩素酸塩を滴下した。

これをよく洗浄し、アミン結合化能を測定した。

このとき、酵素固定化の後数回連続の活性化度測定をし
、その際各試験の間であらためて十分よく洗浄した。

このような配慮は、マーセル化木綿は酵素固定能をもと
もと保持していることが認られており、かつ又、酵素製
剤は酸に敏感であるので弱酸性の緩衝剤を用いるような
慣用の洗浄法の採用はできないなどの理由から、必要で
ある。

次のようにして別の実施態様も行なうことができる。

即ち、この洗浄ずみのマーセル化綿糸を上述した量のソ
ーダ漂白液と過剰のドライアイスで処理し、液を傾斜に
より除き、この綿糸をシアン化ナトリウム５００１ｒＩ
９の水溶液に入れる。

５分乃至１０分間放置後、溶液部分を捨て、次いでこれ
を水でよく洗浄する。

更にもう一つ別の実施態様でも作りうる。

即ち、この洗浄しマーセル化した綿糸５００■を、シア
ン化ナトリウム３ｇと、できるだけ少量の水とに浸漬し
て１夜放置し、これを十分冷却した状態下に２５ｍ１の
水で稀釈し、次いで、６０扉モルの次亜塩素酸ソーダを
、十分強い攪拌下で添加する方法により製造し得る。

（１２１ビスコース繊維系／次亜塩素酸塩２５０■のビ
スコース繊維糸を２Ｎの苛性ソーダ液中に懸濁し、１時
間後に、嵌体を注ぎ出し、水洗し、５１ｒＬｌの水に溶
かした５００■のシアン化ナトリウムの溶液を性別し、
３０分間浸漬し、５℃に冷却し、３０分以内で７％ソー
ダ漂白液の形で１０ミリモルの次亜塩素酸ソーダを添加
する。

このとき十分強い攪拌をする。次に水で十分洗浄する。

（１３）水溶性澱粉の代りに１−２や４−８に示した方
法でデモストリン又はデキストリンと水溶性澱粉の混合
物又は水溶性澱粉とポリビニルアルコールの混合物を用
いることが出来る。

又同様にしてソーダ漂白液と等しい化学等量のカリ漂白
液、又はシアン化ナトリウムの代りにシアン化カリウム
を用いることが出来る。

但し倒れにしても用いる漂白液は滴定して濃度を決定し
ておく。

０４）濃厚溶液を使用するとき、その中の析出物や反応
生成物がゲル化することをさけるため操作温度としては
２５℃から５０℃を用いるのがよい。

実施例としてペクチンや膠状物質の網目化や活性化処理
の応用の例を示すが、これ等の物質の水溶性はかなりの
網目化においても残存している事がわかる。

（Ｍω 「アミロペクチン部」／次亜塩素酸塩１ｇの馬
れいしよ澱粉を１７の水に懸濁し、攪拌しながら７０℃
に加温し、１時間この温度に保ってから冷却し、次に、
大きく膨潤しているがとけないで残っている部分を遠心
分離によって分ける。

温水処理をくり返し又遠心分離を再度行って後、乾燥量
が使用澱粉の約３分１の「アミロペクチン」部を得る。

「アドバンシズ・イン・カーボハイドレート・ケミスト
リー（Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａ
ｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ）第１巻第２６２頁（１９
４５年）アカデミ−・フ：レス（Ａｃａｄｅｍｙ Ｐｒ
ｅｓｓ ）参照〕各約１ｏｏｍｐ（乾燥重量）づつの漂
白澱粉及び「アミロペクチン部」をそれぞれ３５−の水
に懸濁し、これにシアン化ナトリウムをそれぞれ２５■
、５０■、１００■、２００■、４００■づつ加えた１
連の実験を行なう。

１つの実験では水冷下に、２つ目の実験では室温で、は
げしく攪拌しながら更に３％（重量／重量）濃度のジャ
ベル（Ｊａｖｅｌｌｅ ）水（ＮａαＨ含有）を滴下し
て行く。

その際滴下混合はヨードカリ澱粉法でしらべて丁度次亜
塩素酸塩が過剰になるまで行なうものとする。

このとき次亜塩素酸塩消費量は１モルのシアン化ナトリ
ウムに対し１モルとなる。

、ＭＨ値は初めの値の約１０．５（シアン化物溶液）か
ら、実験継続５〜２０分の間に１２に迄上昇してくる。

更に実験結果は明らかに網目の形成を示すものである。

即ち、澱粉の場合はシアン化ナトリウム２５■以下でも
すでによし濾過し得るようになり、「アミロペクチン部
」の場合はシアン化ナトリウム添加５０１ｒＩ９におい
てすでによく集合し濾過し易くなってくる。

６％（重量／重量）のジャベル水を使用したときの結果
もほとんど全く同様である。

即ち、「アミロペクチン部」にシアン化ナトリウム５０
■を加えた場合の結果についても、もし６％ジャベル水
のｐＨ値が使用前に６に保たれていれば、変りがない。

これを上記「アミロペクチン部」−シアン化ナトリウム
液に添加して行くと液は初めｐＨＨＩＯ２５であったも
のが１１にまで上昇して行き、同時に反応生成物は明か
に素状にかたまり、濾過可能となり、明瞭な活性化度を
示す。

又シアン化ナトリウム添加後のｐＨ値を６ないし８に止
めるようにして、そのｐＨ値をも保持しながら（ｐＨ−
安定器）次亜塩素酸塩を添加して行っても何れも素状の
かたまりを生ぜしめることが出来る。

しかしこのときは１モルのシアン化物に対する次亜塩素
酸塩の消費量はどのような場合も増加してくる。

多分次亜塩素酸塩の部分的不均化による塩素酸塩、食塩
又は酸化によるシアン酸塩の生成等が起っているものと
考えられる。

（１４ｂ） セルロース／次亜塩素酸塩各３００■の
微結晶性粉末セルロースアビセル（ＡＶＩＣＥＬ）及び
微粉化セルロース繊維ＭＮ３００（フイルマ・マヘレイ
・ラント・ナーゲル社製）の２試料を２時間水に懸濁し
ておく。

第３試料として、上記セルロース繊維ＭＮ３００を空気
遮断下に１７．５％苛性ソーダ水溶液中に１夜浸漬して
マーセル化したものを用意する。

次にこれ等３種の試料に１で記述したように各５０１ｎ
９のシアン化ナトリウム及びジャベル水を作用させる。

すべての場合においてセルロースは粒状であり且つ高密
度であって、濾過容易なものである。

このとき１モルのシアン化物に対する次亜塩素酸塩の消
費量は丁度１モルである。

マーセル化アルカリ液の存在はアルカリ度の上昇により
反応の進行をおさえる。

それ故、前述のように苛性ソーダの中和または分離を行
なう。

（１４ｃ） セファデックス（５ｅｐｈａｄｅｘ ）
Ｇ ２００ ／次亜塩素酸塩 各１ｏｏｒｖづつのセファデックスＧ２００〔ファルマ
シア・ファイン・ケミカルス・ニービー°アップサラ（
Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉ−ｃａｌｒ
ＡＢ 、 Ｕｐｐｓａｌａ ） 、ＩＫ、 （１４ａ
）でのべた手順でシアン化ナトリウム２５■から４００
１ｎ９に至る５種類の量とジャベル水を作用させる。

但し次亜塩素酸塩消費量及びｐＨ値変化を所望の範囲に
おさめるよう調節するものとする。

セファデックスは重い物質であるので例えばカラム充填
による高速液体クロマトグラフィの充填物として使用出
来る。

（１つ 馬れいしよ澱粉７７次亜塩素酸塩食用馬れい
しよ澱粉１０ｇをｌｌの水に懸濁し、しずかに攪拌しな
がら１時間６０℃に加温し、遠心分離機にかけ、上ずみ
をそＳぎ出し、沈澱分を分取する。

これは容積にして約４５０−あり、シアン化ナトリウム
（１４，７ｇ（０，３モル）をまぜて混合し、１０℃迄
冷却してから１３０ｍＡ！（０，２５モルの次亜塩素酸
塩に当る）のソーダ漂白液を３０分かかつて滴下する。

この時ｐＨ値ば１１から１２，５に上昇する。

これをガラスフィルターで１過し、更に１．５１の氷水
で洗浄する。

こうして得た製品はそのまますぐ次の目的に使用するが
、冷凍するか又は凍結乾燥した状態で保存する。

別法Ａとしては、上記のような澱粉１０．９を５０ｍＡ
’の水に懸濁し、３０分間６０℃に加熱してから冷却し
、これに４．５ｇ（０，５モル）のシアン化ナトリウム
を加え、５℃に迄冷却してから、攪拌下に２００ｍ７（
０，３８モルの次亜塩素酸ソーダ）のソーダ漂白液及び
２Ｎ塩酸水を同時に加える。

こうして、反応混合液のｐＨ値は１１から１１．５の範
囲に調整されているようにする。

この操作に３０〜４０分の時間が必要である。

又更に別法Ｂとしては、別法人で調整したゲル状物に対
し１９．５ｇのシアン化ナトリウム（０，４モル）を混
合してから、攪拌しながら５℃に保って塩素ガスを導入
する。

このとき同時に２ＮＮａＯＨを加えて液のｐＨを１１〜
１１．５に保持するようにする。

この操作は更に２００ｎｌの苛性ソーダ溶液（０，８モ
ル）を追加してやれば終了する。

又更に別法Ｃとして、別法人と同様にして澱粉ゲル状物
と調製し、これにシアン化ナトリウム２．４５ｇ（０，
０５モル）を加える。

これを５℃に冷却し、攪拌しなからしずかに塩素ガスを
泡状に吹きこむ。

このとき同時に、２ＮＮａＯＨ水溶液３００１ｒｌｌ中
にシアン化ナトリウム２２ｇ（０，４５モル）をとかし
た液を連続的に加えることによって反応液のｐＨ値は約
１１に保持されている。

又このとき導入される塩素ガス量は次亜塩素酸ソーダ約
０．３モルに該当するようにする。

更に又別法りとしては、上述のような品質の馬れいしよ
澱粉２０ｇを温度３０〜４０℃の水８００−に懸濁し、
３０分間６０℃に加熱する。

これを冷却して５℃とし透明ゼラチン状物を得、これに
シアン化ナトリウム２５．１（０，５２モル）を水にと
かした溶液（溶液全容積２４５１ｒＬｌ）の２５７ｄを
加え、しずかに攪拌しながら更に約１時間かかつて、ソ
ーダ漂白液２２０ｙｄ（０，４４モルの次亜塩素酸ソー
ダに当る）と上記シアン化ナトリウムの残液２２０Ｍを
同時に加える。

反応が終結すると液ＯｐＨ値は１３〜１４の間にある。

１５℃で濾過を行ない、塩素を含まない水で洗浄し、１
５７ｇの濾過ケーキをうる。

これを乾燥すれば重量２２．６ｇ、その窒素含量は乾燥
重量に対して６．４％となる。

更に又別法Ｅとしては、別法りと同様に操作する。

但し、シアン化ナトリウムとしては４９ｇを溶解した溶
液を使用する（このとき全容積２４５ＴＩｌｌ）。

その結果は別法りと実際上同様となる（即ち、濾過ケー
キ重量、乾燥重量、窒素含量において）。

但し、このときは０．５４モルの未反応シアン化ナトリ
ウムが残っているから、濾液及び洗浄水量を異にしてい
る。

又シアン化物消費量は用いた次亜塩素酸塩に対応してい
る。

これと全く同様な実験を並行しておこない、少量の試料
をとり、これを酢酸酸性としたときヨードカリ澱粉紙に
対して反応混合物は常に陽性に反応することが証明され
ている。

即ち、使用したシアン化物に対する次亜塩素酸塩のモル
比が０．４６以上であるときは正しく青色が出現したの
である。

アルカリ性媒体の中では上記モル比が１以上であったと
きのみ初めに青色をみとめることが出来た。

この酸性〜アルカリ性媒体における呈色反応の相違の意
味する所のものは未だ明かではない。

おそらくは酢酸酸性媒体における青色呈色は上記モル比
が０．４６以下であるときはその都度消失してしまうよ
うな何等かの中間体の存在にもとづくものであろう。

クロルシアンはヨードカリ澱粉による呈色反応を示さな
いから、その存否を論することができない。

次亜塩素酸塩はこの試薬に対してアルカリ性において呈
色反応を示すから、上の試験において未反応次亜塩素酸
塩の存在はわずかでも問題となるはずである。

凍結乾燥した反応生成物の１試料は臭化カリを使って赤
外スペクトルを測定すると、反応出発物質である澱粉よ
りは幾らか弱い吸収であったけれども波数３２００ｃＩ
ｒＬ ’と３６００ｃＩｒＬ ’の間（−ＯＨ吸収バン
ド）に吸収がみとめられた。

又更に弱いけれどもはっきりと波数２１５０ｃｒＩＬ−
１（帰属は明かではないが、シアン酸基或は二Ｃ＝ＮＨ
にもとづくものではないか）及び波数１７２０ｃＩｎ−
” （二Ｃ＝Ｎ −ハ：／ ）”） ニ強い吸収を示し
た。

（１６）澱粉の品質についての注意 工業用澱粉はどのようなものでも本発明の目的とする網
目化やアミン固定を目的とする活性化用として適さない
。

反応出発原料が、一方においては抽出法や溶解法に影響
を持つとともに他方において浸透し易さ及びヒドロキシ
基の反応しやすさに大きい影響を持つことは当然のこと
である。

これは澱粉についてのみではなく、粉末セルロースやセ
ルロース繊維を原料とする場合も同様である。

■ アミン固定反応 ここに代表的な実施例となるものは、 （イ）名古屋の天野薬品工業株式会社によって工業的に
行われているＮ−アセチル−α−アミノ酸のラセミ分割
に使われるアシラーゼの固定化、 （ロ）結晶状キモトリプシンの固定化及び、←う バリ
ン及びグルタミン酸の固定 等をあげる事が出来る。

アシラーゼと言われる酵素に関するこれ迄の広範囲の研
究から、この酵素で活性化された製品は４〜−１５℃に
保持しておくことが得策である事、 又活性そのものは湿った状態でおけば室温でも４８時間
以内にはそう大きく失なわれない等のことがわかってい
る。

凍結乾燥状態であれば保存温度は犬きち・影響を与えな
い。

この酵素固定は０．１−Ｎの重炭酸塩溶液で行なうより
も、水又は０．１−Ｎ重炭酸塩溶液に１０’Ｍ程度の塩
化コバルトを共存せしめた液中で行なう方が効果的であ
る。

又食塩（０，１Ｎ〜０．５Ｎ）を共存させイオン強度を
増大させてやっても固定効果を増大させる事が出来る。

更に大きい影響を与えるのは液の稀釈である。

例えば、１ｇの凍結乾燥活性担体に対して０．１ｇのア
シラーゼを混合する場合に水を５１１Ｌｌ、２０−或は
５０縦とその量をかえて使用した場合、固定化された酵
素活性はそれぞれ８４％、７９％、及び６８％の如くで
あった。

更に又大きい影響をもつものは担体そのものの酵素に対
する量的関係である。

例をあげると、湿潤した１０ｇの担体に対して、それぞ
れ０．０２ｇ、０．０５ｇ、０．１９及び０．２ｇの酵
素を０．ＩＮの重炭酸塩及び１０−’Ｍの塩化コバルト
を含んだ溶液１Ｏ１ｒＬｌを使って４℃で７２時間イン
キュベートした。

固定化後同じ緩衝液１ａで洗浄して、その濾液の活性を
測定して固定化度を求めるとそれぞれ１００゜１００．
７７．３及び８３．５％であった。

又固定はその操作時間に影響される。

例えば、ぬれた担体５ｇ、アシラーゼ０．１ｇ及び水５
ｒＩｔｌを使用して４℃で、それぞれ１，２゜１２及び
２４時間固定を行ない、次に１過、水洗して、そのｐ液
の残存活性度を測定してそれぞれ４６．３９．２７及び
１３％なる値を得た。

はじめにのべた方法、即ち凍結乾燥又は他の方法で出来
るだけ脱水した酵素を活性化担体の湿潤状態にあるｐ過
ケーキの中にまぜこむ方法が最も有効であり、その際濾
過ケーキを予じめ緩衝液の中に懸濁し、過剰の緩衝液ば
ｆ過して除き、緩衝液をもった１過ケーキとして使うの
が有利である。

αＤ アシラーゼの固定試験 実施例（１） 、 （２） 、 （４） 、 （５）
ｔ （６）及び（７）における水溶性澱粉各１００■、
実施例（９）による蔗糖１００■及び実施例（１，０）
によるポリビニルアルコール１００１ｎ９等から得られ
た湿潤したｐ過ケーキ、「天野」アシラーゼを透析し非
透析部を凍結乾燥したものからなっている酵素試料２５
■とまぜ、冷所に１夜放置した後、上述した重炭酸塩／
塩化コバルト緩衝液２００ｙｄで洗浄する。

これをアセチル−ＤＬ−フェニルアラニンのナトリウム
塩標準溶液を使って活性度試験を行なう。

１過ケーキ混合緩衝液の中で前処理する操作はほとんど
の場合無用であった。

実施例（３）と実施例ＯＩ）による繊維も上と同様に処
理した。

０８）アシラーゼの使用試験 洗浄過程（０，ＩＭ−ＮａＨＣＯ３＋１０−’ＭＣｏＣ
１２）からくる僅かの塩基及びｃｏ＋十を含有している
湿潤したｒ過残留物（１０ｇの馬れいしよ澱粉と９ｇの
シアン化ナトリウムを使って得られた活性化「アミロペ
クチン部」）中に、１ｇの透析し凍結乾燥したアシラー
ゼを混合し、４℃で１夜放置してから０．１−ＭＮａＨ
ＣＯ３十１０ ”’−’ ＭＣｏ Ｃ１２の中へ加えて
１過し、更に同じ塩類溶液をｌｌ用いてゆっくりとかつ
充分に洗浄を行なう。

こうして得たアシラーゼ添加１過残留物を、アセチル−
ＤＬ−フェニルアラニンナトリウム塩２４９を−１０’
Ｍ ＣＯＣｌ２溶液３００ｍにとかした溶液中に加え、
チモールを少し加えて４０℃にあたため、ゆっくりとか
きまぜ一様に分散させる。

反応進行状況をポラリーメーターで追跡しながら２日後
、固定化酵素をＰ別し、ｐ過残留物は今度は洗浄せずに
今一度アセチルーＤＬ−フェニルアラニンナトリウム塩
２４．９を１０ ’ＭＣｏ Ｃ’ ２溶液３００献に
とかした溶液中に入れる。

（分割サイクル２回）。

濃縮したＰ液からＬ−フェニルアラニンが収率６０〜７
０％をもって析出し、酸性化した母液からはほぼＤ−型
に属しているアセチル−フェニルアラニンが７０〜８０
％の収率でもって析出する。

物質収支が合わないのばｐ過残渣がかさばっており溶液
がそこに含まれているからである。

その損失分は第２回目のラセミ分割サイクルからの１液
を処理するだけでかなり小さいものにする事が出来る。

酵素活性がおち酵素の取かえを必要とするにいたるまで
には少くとも１００回から１５０回位までのラセミ分割
を容易に行なうことが出来る。

冷所において、特に酢酸ソーダ及びアセチル−Ｄ−フェ
ニルアラニンナトリウム塩の存在下においては、この固
定化アシラーゼは安定であり数ケ月の長きにわたって不
変に保存される。

住９）キモトリプシン キモトリプシン２５■と硫酸ナトリウム２５■の混合物
を２ｍの水にとかし、凍結乾燥した後、実施例（１）に
従って水溶液澱粉２００ｒｎ９．′−／７ン化ナトリウ
ム２００■水２０ｍ１及び次亜塩素酸ナトリウム（漂白
液）４ミリモルからつくられた０〜５℃に保たれている
１過ケーキと共に０． Ｉ ＮのＮ’ ａＨＣＯ３溶液
２１ｒＬ／！と混合し室温におイテ３０時間放置する。

これを１．５１の水を使って充分洗浄し、残留物は凍結
乾燥する。

このものの乾燥重量は約２２０■で、含水量（カールフ
イシャー滴定法）は１１．５％であった。

一部を試料として２０％ＨＣ７中で１１０℃、３６時間
加水分解し、分解生成物はシュタイン・ムーブ（Ｓ ｔ
ｅ ｉｎ −Ｍｏｏｒ ）法によってアミノ酸分析びこ
。

予想通りのアミノ酸が予想通りの量的関係で得られた。

ここに得られたアミノ酸総量は１６．５■のキモトリプ
シンの固定に対応するものであった。

（イ）水溶性担体に固定したバリン 実施例（８）及びα４）ニよって透析された溶液にその
液の１重量％に当るバリンを添加し、重炭酸塩を加えｐ
Ｈ値が９となるように緩衝する。

１夜、０℃に放置し、Ｎａ＋イオンが完全にな（なるま
で０℃で透析し、凍結乾燥する。

この凍結乾燥物の加水分解物中にバリンが認められた。

（２Ｌ）不溶性担体に固定したグルタミン酸実施例（１
５）の主部による方法で調製されたｐ過ケーキにグルタ
ミン酸８ｇ（５４ミリモル）と炭酸ナトリウム５．６ｇ
（５４ミリモル）を加えたものをそれぞれ種々の稀釈度
の液とし、種々の温度で種々の時間処理した。

目的とする附着量は、０．０１−＋０．１９グルタミン
酸／１ｒｌｌの濃度範囲ではファクター６．５で、０℃
から２０℃に至る間ではファクター１．３で、温度２０
℃から４０℃の間ではファクター１．１６で、時間２．
５時間から５時間の間ではファクター１．１７で、同じ
く５時間から５０時間の間では同じファクターでそれぞ
れ増大する。

一定容積ではグルタミン酸量を５倍にすると附着量は元
の３百倍に増加する。

２０ｍＡ’の水で稀釈したとき、室温で１５時間反応し
て附着量は平均してグルタミン酸１０ミリモルとなった
（酸定量測定及びシュタイン・ムーブ法アミノ酸分析に
よる）。

固定されたグルタミン酸１モル当り１モルのアルカリを
消費し、又、このものの滴定曲線はホルムアルデヒドの
存在下におけるグルタミン酸モノナトリウム塩のそれに
よ（似ている。

■ 固定化酵素活性についての分析的知見（２）固定化
アシラーゼ 最初に用いたポリヒドロキシ化合物１００■に該当する
濾過ケーキ又は繊維状物質を１０’Ｍ塩化コバルト溶液
４１ｒＬｌに加え、これを４０℃に加温する。

このものを、ＤＬ−アセチルフェニルアラニン（４，５
Ｘ １０−３Ｍ）、炭酸水素ナトリウム（６，６Ｘ １
０−’、）及び塩化コバルト（１ｏ−’）を含む４ｍＡ
’の溶液を４０°Ｃに加温したものと混合する。

これを４０℃に保ちながら３０分間攪拌下にインキュベ
ートし、沢過する。

この涙液５μｌをシリカゲルのうすい層上に滴下し、又
その近傍に、フェニルアラニンを丁度クロマトグラフの
スポットを観測するのによい程度含む対照溶液を５μ１
滴下する。

即ちこの対照液の濃度は試験液の酵素分解率５゜１０．
２０及び４０％に該当する。

クロマトグラフ展開剤はクロロホルム／メタノール／酢
酸／ピリジン（７５／ ２５ ／ ５ ／ ５ ）であ
る。

酵素分解によるクロマトグラフスポットのひろがりから
見てここに実施例としてあげた実験条件では５〜４０％
分解の程度であった。

−固定化キモトリプシン メタノール３ＴＬｌ中にアセチル−Ｌ−チロシンエチル
エステル２０１ｒ１９を含有する溶液を０．１Ｍ燐酸塩
緩衝液（ｐｔ−ｉ ７．８ ） ９ｍｌに加え、酵素試
料と混合する。

ｐＨ値安定器を連結して、０．２ＮのＮａＯＨ消費量か
ら２７〜２８℃における反応の進行を追跡する。

実施例α９）による試料の活性度は固定化されたキモト
リプシン量から期待されるそれの約１／２の大きさであ
った。

〔参考〕

１、反応様式■及び■に関する実験的比較。

反応様式■及び■を論するに当り次のような係式をたて
る。

■に対応しては次の反応様式 ％式％） によって酸が一定量遊離する。

これに対し■については、反応機構に関係なく次の反応
様式％式％） として一定量苛性ソーダが遊離する。

その上に次亜塩素酸塩が遊離苛性ソーダを若干含でいる
。

上記の場合、アルカリと同様に酸は強い炭酸塩緩衝剤の
存在によって捕捉され、ｐＨ変動がわずかに０．３〜０
．４ ｐＨ単位の範囲に止まる事になる。

更にｐＨ安定器を使ってｐＨも調節する事は、反応速度
が大きいことにかんがみ、考慮する必要がない。

この緩衝剤によってもたらされる高い塩濃度ば■と同様
に■の反応速度をも低下させる。

反応温度の２０℃から０℃への低下も同様に働らく。

この効果の重なりによって、■及び■はほぼ比較できる
ようになる。

後述の比較試験は反応条件と試験結果から考えて典型的
なものである。

出発溶液：２重量％の澱粉溶液５ｍＡ’及び２Ｍ炭酸カ
リウム溶液１０１ｒＬｌよりなるもの、に 次の各場合のものを添加する。

即ち、１つば： １０ｙｄの水 １．１７ｇのＮａＣ１（２０ミリモル） ５ｍｌの１ＭＫＨＣＯ３ １３８ＷＩ；ｉのＮａＣ１（２，３４ミリモル）これに
よりｐＨ１０，５５の溶液Ａを得る。

１つは：１０ｒＩＬｌの２ＭＫ２ＣＯ３ ５ＴｆＬｌの１ＭＫＨＣＯ３ １３８ＴｎｆＩのＮａＣ１（２−３４ミリモル）これに
よりｐＨ１１，１の溶液Ｂを得る。

１つは： Ｉ ９ｍ７１！の水 １．１７ｇのＮａＣ１（２０ミリモル）または２．８４
ｇ Ｎａ ２ＳＯ４ ５７ｒＬｌの１ＭＫＨＣＯ３ １２８Ｔｎ９のＮａＣＮ（２，６ミリモル）これにより
ｐＨ１０，６の溶液Ｃを得る。

１つは：５１１Ｌｌの水 ２９３ｍｆｌのＮａＣ１（５ミリモル） １０ｍ７１！の２ＭＫ２ＣＯ３ １３８■のＮａＣｌ（２，３４ミリモル）これによりｐ
Ｈ１２，０の容液りを得る。

これら溶液Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤを一１℃に冷却し、溶液を
強く攪拌しなから１分以内に、Ａ及びＢ及びＤにはそれ
ぞれ■方法により製造した新鮮なりロルシアン水溶液（
２，６ミリモル相当）３ｍＡを、又Ｃには２．５３ｇ（
２，３４ミリモルＮａ０Ｃｌ）漂白液（方法■による）
をそれぞれ滴下する。

Ａ及びＢ溶液では（方法■）僅かな発熱反応であった。

これらは冷却して０℃に保った。

１３分後でもなお、クロルシアンの臭いは微弱ながら感
知できた。

ｐＨば、Ａでは１０．２５、Ｂでは１０．８である。

不溶性の網目構造生成物の分離は起らなかった。

Ｃ（方法■）では反応は強い発熱反応であった。

温度は強く冷却したにもかかわらず＋３℃になった。

次亜塩素酸塩添加終了前に既に、反応混合物は乳濁した
。

そして数秒間以内に網目構造生成物がモロモロ状に析出
した。

これはｒ過し易い形態のものであった。

鋭い臭いは可なり早く消失した。実験開始後１３分でｐ
Ｈば１１．０になった。

Ｄ溶液での実験は、クロルシアンの品質を知るための対
照として役立つものである。

この場合クロルシアン添加終了前に、網目構造化のため
の典型的な乳濁がおこり数秒以内に網目構造化生成物の
モロモロができる。

０℃附近に１２分間保つ。ｐＨは１１．２である。

Ａ及びＢ溶液式、験の場合に比較して、クロルシアン臭
は予期していたように早く消える。

上記の実験において、Ｂの場合には、Ｃの場合の■のｐ
神滝囲内で■が使用されたことが判る。

この結果から、■において観察される網目構造化は、中
間にクロルシアンが生成することに帰することはできな
いという結論が得られる。

溶液Ｃを使用して■の方法により得られた生成物の収率
とアミン固定化能は、■の方法の条件範囲内で変動する
。

２、本発明による活性化されたアミン固定化能を有する
ポリヒドロキシ化合物を生成させる反応様式の考察。

方法■及び■の相違は、上記結果とは別に、■が、次亜
塩素酸による澱粉の水酸基のエステル化が起る場合に予
期されるようにふるまうことからも明らかになる。

混合比が１００１１１９澱粉＝２ミリモルＮａ０ＣＪ’
になるような２重量％の澱粉溶液と７重量％の次亜塩素
酸ナトリウム溶液との混合物を、０℃乃至５℃において
、強攪拌下、冷却した１％シアン化ナトリウム溶液に滴
下すると、ＯＣｌとＣＮとの化学量論比とは関係なく、
速かに、顕著なアミン固定能保有の網目構造化澱粉のモ
ロモロが生成する。

ここでシアン化物と澱粉及び次亜塩素酸塩との混合物を
逆にして滴下すると、網目構造化生成物は沈澱してこな
い。

これは澱粉が反応に関与するまでに、シアン「ヒ物が次
亜塩素酸塩により消費されたことを示す。

化学量論的量のシアン化物に澱粉／次亜塩素酸塩を一度
に注加すると、澱粉次亜塩素酸塩混合物がシアン化物添
加前にすでに短時間例えば２０℃で５〜１５分間程度イ
ンキュベートされている場合には、アミン固定化能ある
網目構造生成物が生成した。

シアン化物の１部は澱粉に化学結合していると推察され
る次亜塩素酸塩と、下記様式に従って直接反応する機会
を十分にもつ。

ＲＯＣｌ＋ＣＮ −＋ＲＯＣＮ＋Ｃ１ これと同じように水膨潤性の水不溶性ポリヒドロキシ化
合物（乾燥重量ｉ ｏ ｏｍｐ）、例えばセファデック
スＧ２００又はマーセル化繊維素（アビセル）を、場合
によりドライアイスを添加して室温で１５〜３０分間次
亜塩素酸塩溶液（２ミリモルＮａ０ＣＪ’）とインキュ
ベートし、水ｉｏｏ扉ｌを添加後、液体を遠心分離し、
残渣を水１００ｙｄ中に添加し、液体を傾斜法（又は遠
心分離）で除き、残渣に１０ｍ１の１％シアン化ナトリ
ウム溶液を注加し、遠心分離機上でよく洗ってシアン化
物を除いた。

この生成物は、次亜塩素酸塩とのインキュベーションの
長短に応じてアミン固定化能を有する。

水溶性澱粉とシアン化ナトリウムとの混合物に次亜塩素
酸第３級ブチルを作用させたとき起る、実施例記載の全
く緩和なかつ均一な網目構造化反応は、次亜塩素酸の有
機エステルとの澱粉との間にオコる最初のエステル交換
反応の結果として理解することができる。

本発明の実施態様を列記すれば次のとおりである。

（１） シアン化水素酸および／または水溶性シアン化物と陽性
塩素または臭素を含有する試剤（たとえば次亜塩素酸ま
たは次亜臭素酸、もしくはそれらの水溶性塩あるいは加
水分解により該酸を生成する塩素化合物または臭素化合
物）をアルカリ性条件下好ましくは低温条件において水
溶性又は水膨潤性ポリヒドロキシ化合物に作用させ、必
要に応じ、中和した後、■その反応混合物が溶液の時は
清澄化処理と透析処理またはゲル沢過処理により、また
は■その反応混合物が懸濁液の時ばｐ過または遠心分離
および洗浄により低分子物質を除去して溶液または懸濁
液中に存在するかもしくは沢過残渣ないし遠心分離残渣
中に存在するカルボンイミドイルジオキシ基を有するポ
リヒドロキシ化合物（網目構造物質）を得、これを水お
よび必要に応じ緩衝剤の存在下、５０℃以下好ましくは
低温において。

生物学的活性を有することもある、水溶性にして少（と
も一つの塩基性窒素原子において置換可能なアミノ化合
物と反応させ、その反応混合物から透析可能状態または
溶液状態で存在する物質を水または塩類水溶液を用いて
透析またはｒ別し、必要に応じ洗浄することを特徴とす
る固定化アミノ化合物の製造法。

（２）シアン化水素酸および／または水溶性シアン化物
をポリヒドロキシ化合物の水酸基１ｇ当量あたり０．２
５〜６ｇ当量の割合で使用することを特徴とする上記（
１）記載の方法。

（３）次亜塩素酸または次亜臭素酸、もしくはそれらの
水溶性塩あるいは加水分解により当該酸を生成する塩素
化合物または臭素化合物をポリヒドロキシ化合物の水酸
基１ｇ当量あたり陽性塩素量または陽性臭素量に換算し
て０．２５〜６ｇ当量の割合で使用することを特徴とす
る上記（１）記載の方法。

（４）シアン化物としてシアン化アルカリを使用するこ
とを特徴とする上記（１）または（２）記載の方法。

（５）次亜塩素酸または次亜臭素酸の塩としてそれらの
アルカリ塩（好ましくはソーダ漂白液またはカリ漂白液
、塩素または臭素と水酸化アルカリ、炭酸アルカリまた
は重炭酸アルカリ）を使用することを特徴とする上記（
１）または（３）記載の方法。

（６）塩素または臭素１ｇ当量あたり水酸化アルカリ少
くとも２ｇ当量、炭酸アルカリ少くとも１ｇ当量または
重炭酸アルカリ少くとも２ｇ当量を使用することを特徴
とする上記（５）記載の方法。

（７）加水分解により充亜臭素酸または次亜臭素酸を生
成する化合物として当該酸のエステル（好ましくは炭素
酸２〜５のアルキル基を有する次亜塩素酸アルキルまた
は次亜臭素酸アルキル）を使用することを特徴とする上
記（１）または（３）記載の方法。

（８）加水分解により次亜塩素酸または次亜臭素酸を生
成する化合物として、窒素原子のところで結合した陽性
塩素もしくは陽性臭素を含有する窒素化合物（たとえば
ｐ−）ルエンスルホン酸りロルア□ドナトリウム塩（ク
ロルアミンＴ）。

Ｎ−クロルアセドア□ド、Ｎ−クロルサクシンイミド、
クロルアミン、Ｎ−ブロムアセトアミドもしくはＮ−プ
ロムサクシンイミドを使用することを特徴とする上記（
１）または（３）記載の方法。

（９）全シアン化物とポリヒドロキシ化合物を仕込み、
この混合物に陽性ハロゲン含有試剤を添加することを特
徴とする上記（１）〜（８）記載の方法。

（１０）陽性・・ロゲン含有試剤を仕込み、次いでこれ
に全シアン化物とポリヒドロキシ化合物の混合物を添加
することを特徴とする上記（１）〜（８）記載の方法。

（ＩＩ）ポリヒドロキシ化合物と陽性・・ロゲン含有試
剤を仕込み、この混合物に全シアン化物を添加すること
を特徴とする上記（１）〜（８）記載の方・失。

０２）全シアン化物を仕込み、これにポリヒドロキシ化
合物と陽性ハロゲン含有試剤の混合物を添加することを
特徴とする上記（１）〜（８）記載の方法。

（１３）ポリヒドロキシ化合物と次亜塩素酸もしくは次
亜臭素酸の塩の混合物を予じめ二酸化炭素で処理してお
くことを特徴とする上記（１２）記載の方法。

（１４）ポリヒドロキシ化合物を仕込み、このものと次
亜塩素酸塩もしくは次亜臭素酸塩との混合物を必要に応
じ二酸化炭素で処理し、この混合物を沢過もしくは遠心
分離し、場合によっては不溶性残渣を洗浄し、シアン化
アルカリの水溶液を添加し、不必要なシアン化物を洗浄
除去することを特徴とする上記（１１）記載の方法。

（１５）ポリヒドロキシ化合物と全シアン化物および陽
性・・ロゲン含有試剤の間における反応がｐＨ約１０〜
１３で行われることを特徴とする上記（１）〜αａ記載
の方法。

（Ｌ６）アミノ化合物として、蛋白質、ポリペプチド、
オリゴペプチド、アミノ酸もしくは次の一般式を有する
アミン： ＨＮｃＲ（ｘ） ＲＷ） 〔式中、Ｒ（Ｘ）は水素、又はＸのところに水素もしく
は官能基を有する基、′ＢＩＣＹ）ｕｙ位置に水素もし
くは官能基を有する基を意味する〕を使用することを特
徴とする上記（１）記載の方法。

αＤ 室温もしくは低温においてアミノ化合物を中性又
は弱もしくは中程度アルカリ性条件下、例えば水中又は
炭酸水素ナトリウム又は炭酸ナトリウムの存在下、好ま
しくはその過剰の存在下に作用させることを特徴とする
上記（１）〜α６）記載の方法。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ シアン化水素酸及び水溶性シアン化物の少（とも一
   種と陽性塩素又は臭素を含有する試剤をアルカリ性条件
   下水溶性又は水膨潤性ポリヒドロキシ化合物に作用させ
   、その反応混合物から透析、ゲル沢過、濾過、遠心分離
   又はその他の慣用分離手段により低分子物質を除去して
   、カルボンイミドイルジオキシ基を有するポリヒドロキ
   シ化合物からなる、少くとも一つの塩基性窒素原子にお
   いて置換可能なアミノ化合物固定化用担体を得ることを
   特徴とする、アミノ化合物固定化用担体の製造法。 ２ シアン化水素酸及び水溶性シアン化物の少くとも一
   種と陽性水素又は臭素を含有する試剤をアルカリ性条件
   下水溶液又は水膨潤性ポリヒドロキシ化合物に作用させ
   、その反応混合物から透析、ゲル沢過、濾過、遠心分離
   又はその他の慣用分離手段により低分子物質を除去して
   、カルボンイミドイルジオキシ基を有するポリヒドロキ
   シ化合物からなる担体を得、との担体に、溶液又は懸濁
   液中において、水の存在下に、水溶性にして、少くとも
   一つの塩基性窒素原子において置換可能なアミノ化合物
   を反応させ、その反応混合物から該アミノ化合物が上記
   担体に固定された生成物を得ることを特徴とする、固定
   化アミノ化合物の製造法。