JPH0427388A - 修飾プロテアーゼ及びその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、多糖類で化学修飾された修飾プロテアーゼ及
びその製造法に関する。

（従来の技術） 一般に、動物、植物、もしくは微生物などを起源とする
プロテアーゼが、洗剤、消化剤や抗炎症側などの医薬品
、化粧品、肉の軟化側５絹の精練またはビールの製造過
程など各種の産業分野に於いて広く有効に利用されてい
る。

しかしながら、プロテアーゼを洗削、化粧品もしくは成
る種の医薬品などへ応用するに際しては、プロテアーゼ
が人体にとって異種起源の蛋白であるため、抗原性や皮
膚感作性を示し、人によっては強い刺激を与えることが
指摘されている。

また、他の問題として、プロテアーゼの安定性が充分で
ないことも挙げられる。特に水分率の高い媒体や、水溶
液などの剤形中では、変性の他に自己消化分解が起り、
室温で保存すると速やかに失活するので、安定な商品を
供給する事は難しいのが現状である。

酵素の抗原性など安全性の問題解決に対しては、例えば
、治療用酵素の体内投与を目的として、抗原性を抑制し
、血中半ｆ！１．期を改善延長するため、ウリカーゼ、
アスパラギナーゼをポリエチレングリコールで修飾する
方法（特公昭６１−４２５５８号公報）、ストレプトキ
ナーゼをポリエチレングリコールで修飾する方法（特開
昭５７１１８７８９号公報）などが提案されている。ま
た、安定性の問題解決に対しては、分子内架橋に寄与す
る修飾が有効であることがキモトリプシンなどの酵素に
ついて示されている。（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａｅｔ　Ｂ
ｉｏｐｈｙｓｉｃａ　Ａｃｔａ、　　５２２．　２７７
〜２８３（１９７８）。同、４８５．１〜１２（１９７
７））更に、マンガン型スーパーオキシドジスムターゼ
に、多Ｉｉ類、ポリエチレングリコール、蛋白質などの
水溶性高分子を結合させたものは抗原性が抑制されると
共に、熱安定性が向上することが示されている（特開昭
５８−１６６８５号公報）。

しかしながら、プロテアーゼに対して、抗原性皮膚感作
性などの抑制と共に安定性を改良し、実用化を計ったも
のは知られていない、なかでも、皮膚感作は鋭敏な反応
であるため、その抑制は極めて難しい、また、プロテア
ーゼは基質が通常高分子量であるため、修飾の方法やそ
の程度によっては、プロテアーゼの活性が殆んど消失し
たり、熱安定性が低下したりしてしまう。

本発明者らは、プロテアーゼを洗剤、化粧品医薬品など
の分野で広く用いるため、高い活性を維持させながら安
全性と共に安定性を獲得するものとして、すでにプロテ
アーゼと多糖類がトリアジン環を介して結合している修
飾プロテアーゼ、並びに、多糖類に塩化シアヌルを反応
させてトリアジン環結合多＊ｉを合成し、次に該トリア
ジン環結合多糖類とプロテアーゼとを反応させる修飾プ
ロテアーゼの製造法を提供している。（特願平しかしな
がら、こうして得られた修飾プロテアーセハ水溶液中で
は高い安定性を有するものの、これを粉末化して保存す
ると経時的に不溶化し、これに伴って活性低下が起るこ
とが判明した。

（発明が解決しようとする課題） 本発明者らは既存の修飾プロテアーゼの有する上述の諸
問題点に鑑み鋭意研究を続けた結果、本発明を完成した
ものであって、その目的とするところは、粉末状態で長
期に亘って保存しても不溶化、酵素活性の低下等を生起
しない修飾プロテアゼを提供するにある。本発明の他の
目的並びに効果は以下の説明から明らかにされよう。

（課題を解決するための手段） 即ち、本発明は、プロテアーゼと多Ｉ！類とがトリアジ
ン環を介して結合しており、且つ、トリアジン環に結合
しているハロゲン原子の含有量が５００ｐｐｍ以下であ
ることを特徴とする修飾プロテアーゼ、並びに、多Ｉ！
頻に塩化シアヌルを反応させてトリアジン環結合多ｖＡ
類を合成した後、該トリアジン環結合多Ｉ！類とプロテ
アーゼとを反応せしめ、引き続いて反応生成物をアミノ
基ををする低分子化合物の水溶液中に於いて加熱し、ト
リアジン環に結合しているハロゲン原子の含有量を５０
０ｐｐｍ以下とすることを特徴とする修飾プロテアーゼ
の製造法により達成される。

次に本発明の詳細な説明する。

本発明に使用されるプロテアーゼとしては、例えば、ト
リプシン、キモトリプシンなどの動物由来のプロテアー
ゼ、微生物由来のプロテアーゼ等が挙げられる。本発明
の修飾プロテアーゼはいずれも抗原性や皮膚感作性が抑
制されており、また安定性も大きく向上する。しかし、
プロテアーゼの違いにより相対的に安定性は異なる。安
定性の点からは、動物由来のプロテアーゼと比較すると
微生物由来のプロテアーゼに優れているものが多い、し
たがって、好ましくは微生物由来のプロテアーゼ、特に
好ましくはバチルス属由来のプロテアーゼを用いると好
結果が得られる。

本発明に用いる多Ｉｉ類の一例としては、アガロース、
グアーガム、イヌリン、デンプン、デキストラン、プル
ラン、ザンタンガム、カラギーナンペクチン、アルギン
酸などの天然多糖類及びその誘導体や、ヒドロキシプロ
ピルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース
、カルボキシメチルセルロースなどが挙げられる。なか
でもデキストラン、プルランは、かなりの高分子量のも
のを用いても溶液粘度が低く、反応操作が容易であり、
また得られる修飾プロテアーゼの性能も均一安定である
点で優れている。

多糖類の分子量は、特に著しく小さいものでなければ、
修飾プロテアーゼの安定性は良好な結果を与えるが、抗
原性、皮膚感作性の抑制などが完全でなくなる場合もあ
るため、その平均分子量は１０．０００以上のものを用
いることが好ましく、また、特に好ましくは４０．００
０以上である。

修飾プロテアーゼに於ける、元のプロテアーゼの抗原性
や皮膚感作性の抑制効果の大きさ、安定化の程度は、用
いた多１１！１の種類１分子量、結合量及びその状態な
どによって変化する。一般に結合量を大きくすると、安
全性と安定性は良好となるがプロテアーゼが失活する傾
向にあり、目的を達する迄の修飾を施して得られる修飾
プロテアーゼの活性は著しく低い場合が多い、しかし、
本発明の修飾プロテアーゼは、かなり修飾率を高めても
非常に高い活性を有する。また、逆に修飾率が低い場合
でも十分高い安定性、安全性を有することも本発明の修
飾プロテアーゼの特長であるが、やはりその程度と修飾
率には相関がある。これらの点より、プロテアーゼの表
面アミノ基の修飾率はＴＮＢＳ法で測定して３０％以上
であることが好ましく、更に好ましくは５０％以上であ
る。

本発明の修飾プロテアーゼは、多ｖａ頻に塩化シアヌル
を反応させてトリアジン環結合多糖類を合成し、次にこ
れをプロテアーゼと反応させることによって得られる。

トリアジン［結合多Ｉ！頻の合成反応はｐＨ８〜１１と
して行うことが好ましく、更に好ましくは、ｐＨ８〜９
である。

又、この合成方法としては、多ｘｉ水溶液に塩化シアヌ
ルをアセトン等の非水系水混合溶媒の溶液として添加す
る方法が好ましく、高活性の活性化体を再現性よく得る
ことができる。得られたトリアジン環結合多Ｉｉ類は、
必要に応じて酸性条件下で貧溶媒を加えて分離、精製し
てもよい。

トリアジン環結合多糖類に導入されたトリアジン環量が
小さいと７ミノ基の修飾率が低下するため、修飾プロテ
アーゼの安定化や抗原性抑制の程度がその分小さくなる
傾向にあるので、トリアジン環結合多糖類中のトリアジ
ン環量は３Ｘ１０−’モル／ｇ以上であることが好まし
い。

プロテアーゼとトリアジン環結合多１１１ｉとの結合反
応に際しては、トリアジン環結合多糖類を重量比にして
プロテアーゼの３倍以上用いて反応させることが好まし
い。３倍未満でもかなり高い安定性をもつ修飾プロテア
ーゼを得ることができるが、抗原性、皮膚感作性の抑制
が完全な修飾プロテアーゼを得られない場合がある。ま
た、過剰に多糖類を加えても得られる修飾プロテアーゼ
の性能は飽和するため、その使用量は２０倍以下にする
ことが好ましい。

次いで、アミノ基を有する低分子化合物の水溶液中に於
いて、好ましくは５０〜７５℃で後処理を行なう。本発
明に用いるアミノ基を有する低分子化合物ｌは、特に限
定されないが、グリシンアラニン、リジン、セリン、グ
ルタミン酸等のアミノ酸類やモノエタノールアミン等の
、安全性の点から感作源となりにりく、修飾プロテアー
ゼの構造に悪影響を与えない物質が好ましい。

修飾酵素中に残存しているトリアジン環結合のハロゲン
原子の数は処理時間と共に減少するが、この速度は温度
が高くなる程、又ｐＨ４ｔＬが高い程大きくなる傾向が
ある。水溶液のｐＨ値は通常５〜１０の範囲で行なうが
、酵素の変性失活を避けると共に、高い処理効率を得る
ための条件として６．５〜９．５とすることが好ましい
。

処理温度は５０〜７５℃であることが好適である。温度
が低すぎると、結合ハロゲン原子の含有量を５００ｐｐ
ｍ以下にするには長時間を必要とする。又、温度が高す
ぎると、必要な処理を行う間に酵素の失活も併行して進
むため、活性が低下する。又、処理制御の容易さの点か
らも５５〜７０℃の範囲で行なうことが最も好ましい。

必要な処理時間は、処理温度やｐ）１条件により異なる
。結合ハロゲン原子の含有量が、５００ｐｐｍより大き
い場合、室温下でも粉末を長時間保存すると部分的にゲ
ル化が起り、水に対する溶解性が低下すると共に活性も
低下するが、結合ハロゲン原子の含有量を５００ｐｐｍ
以下とすることにより、こうした問題を抑制できる。又
、本発明の温度条件を選ぶことにより、処理中の酵素の
失活を殆んど避けることができる。この後処理を施すこ
とにより、粉末状態でも安定した品質の目的物が得られ
る。

得られ、た修飾プロテアーゼは限外堀遇や、ゲル枦遇り
ロマト法などにより精製することができるが、更にこれ
を粉末化する方法としては、減圧溶媒除去、凍結乾燥、
エタノール等による貧溶媒添加による析出等を用いるこ
とができる。

（発明の効果） 本発明の修飾プロテアーゼは、その抗原性、皮膚感作性
が殆んど、もしくは完全に抑制され、かつ熱安定性も著
しく高い、また、修飾に伴う活性低下も小さく、非常に
高い活性を有する。界面活性剤を高濃度に含む系中にお
いても安定なうえ、自己分解失活が抑制されているため
、水系の各種剤型への配合に適する。

更に、粉末などの固体状においても、保存時の不溶化や
活性低下が起らず、又、１０５℃での加熱滅菌にも耐え
るため、広い範囲の剤型への適用が可能であり、洗剤、
化粧品、医薬品等に有効に用いることができる。

尚本発明に於いて、熱安定性、皮膚感作性、プロテアー
ゼの表面アミノ基及びハロゲン原子含有量の測定、評価
は火工に記す方法で行った。

＋１）　　熱安定性の測定（水系） ５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６，８）に修飾プロテアー
ゼを溶解し、０．５　ｍ　ｇ　ρｒｏｔｅ＋ｎ／　ｍ　
１２としたものを検液として用いた。検液を６０ｔで６
時間インキュベーシッンを行った後、検液中の酵素活性
を測定し、処理前の活性と比較して残存率を求めた。

（ｎ　熱安定性の測定（粉末状） 修飾プロテアーゼ粉末を６０’Ｃで７日間乾熱処理した
後、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐ　Ｈ６，８＞に溶解し、
その溶状を観察すると共に、酵素活性を測定し、乾熱処
理前の活性と比較して活性保持率を求めた。完全な溶液
とならない場合は、均一な分散液とし、測定に供した。

（３）　　皮膚感作性の評価 マキシミゼーション（Ｍａｘｉｓｉｚａｔｉｏｎ）法［
ＢｅｒｔｉＬＭ　ａｎｄ　Ａｌｂｅｒｔ、ＭＪ、＋Ｊ、
Ｉｎｖｅｓｔ、Ｄｅｒｍ、＋　　５２（３）、２６８　
（１９６９））に基づき、皮膚怒作性試験行った。

誘導及び惹起濃度は、プロテアーゼ、修飾プロテアーゼ
共、蛋白量として０．０２重量％になるように設定した
。皮膚感作性の程度を以下に示す方法で求めた平均評価
点により評価した。

（４）　　プロテアーゼの表面アミノ基修飾率の測定ハ
インズ（ｌａｙｎｅｓ）らの方法（Ｈａｙｎｅｓ、　Ｒ
，ｅｔａｌ＋Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、工、５４１　
　（１９６７））によりトリニトロベンゼンスルホン酸
（ＴＮＢＳ）の反応量として修飾プロテア−上表面の未
反応のアミノ基量を測定し、未修飾体の表面アミノ基量
との比から表面アミノ基の修飾率を算出した。

（５）　　ハロゲン原子含有量の測定 粉末試料１００ｍｇを成型したディスクを用いて、蛍光
Ｘ線分析法により、ハロゲン原子の含有量を求めた。

以下、本発明を実施例により具体的に説明する。

（実施例１） デキストラン（平均分子量４ｘｌＯ’）１２５ｇを２．
５１の水に溶解した。これに、室温でアセトン６２５ｍ
ｊ！に溶解した１、　３．５−　）リクロロトリアジン
（塩化シアヌル）２５ｇをｐＨ７〜９に調整しながら８
分間で滴下した。ｐＨの調整はｌＮＮａＯＨを用いて行
った。

滴下終了後、０．ＩＮＨＣ＆を加え、ｐＨを３に調整し
た。これをアセトン２０１中に加え、析出した結晶を沖
遇し、アセトン洗浄して活性化デキストラン１４４ｇを
得た。

次に、こうして得られた活性化デキストラン９ｇを水９
０ｍ１に熔解し、これにバチルス・リケニホルミス菌由
来のプロテアーゼくノボ社製、商品名エスペラーゼ〉（
以下エスペラーゼと記す）１ｇを水１０ｍｌ１に溶かし
て加え、更に０．２　Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ９，２）ｌ
　００ｍｆｆを加えて、２５℃で１８時間反応させた。

次に、この修飾プロテアーゼ水溶液にグリシン１、２　
ｇを加え溶解させた後、ｄ　Ｑ　ｍ　ｅずつに分割し、
６０℃で０〜３６時間加熱処理を行ない、続いて各々を
限外浜過操作により４回低分子物質を除去洗浄後濃縮し
、凍結乾燥により褐色粉末を得た。

これらの修飾プロテアーゼ粉末について６０℃。

７日間の乾熱処理を施し、各々処理後粉末の水溶解性、
活性、水系安定性を評価した。又、乾熱処理前の試料に
ついて活性、塩素含有量１表面アミノ基修飾率、皮膚感
作性を測定、評価した０以上第１表から塩素含有量の高
い修飾酵素は乾熱処理によりゲル化（水不溶化）するの
に対し、加熱処理により活性塩素含有量を５００ｐｐｍ
以下とした試料は、乾熱処理によってゲル化が起らず、
活性低下も小さいことが明らかである。

又、この加熱処理による活性収率の低下や感作性の誘起
も見られず、水系での熱安定性の低下等も認められない
。

更に、塩素含有量５００ｐｐｍ以下の試料である２４時
間及び３６時間熱処理品（本発明の修飾酵素）の活性収
率の値から見ても処理による活性低下も非常に小さいこ
とが解る。

これらは、１０５℃、１時間の乾熱滅菌処理を行なって
も活性低下率は１０％以下であり、物性面での変化も全
く見られないことが確認されており、本発明の修飾酵素
の有用性は明らかである。

（実施例２） 実施例１において、多糖類としてデキストランのかわり
にプルラン（平均分子量５Ｘ１０’）を用いてエスペラ
ーゼ（１ｇ）の修飾を行なった。但し、トリアジン環の
活性塩素基の不活化処理はグリシン添加後６３℃で２４
時間行ない、限外枦遇法により精製後、凍結乾燥して修
飾プロテアーゼ９．５ｇを得た。活性収率は６２％、塩
素含有量は１７５ｐｐｍであった。皮膚感作性は認めら
れず、平均評価点はＯであった０本品を４０℃条件下で
６ケ月間の保存試験を行なったところ、リン＃Ｉ緩衝液
（ｐＨ６，８）に対する溶解性は良好であり、活性低下
も認められなかった。

また、試験後粉末の水系熱安定性評価（６０℃。

６時間）の活性保持率も９９％であり、変化は蒐られな
かった。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）プロテアーゼと多糖類とがトリアジン環を介して
   結合しており、且つ、トリアジン環に結合しているハロ
   ゲン原子の含有量が５００ｐｐｍ以下であることを特徴
   とする修飾プロテアーゼ。
2. （２）多糖類に塩化シアヌルを反応させてトリアジン環
   結合多糖類を合成した後、該トリアジン環結合多糖類と
   プロテアーゼとを反応せしめ、引き続いて反応生成物を
   アミノ基を有する低分子化合物の水溶液中に於いて加熱
   し、トリアジン環に結合しているハロゲン原子の含有量
   を５００ｐｐｍ以下とすることを特徴とする修飾プロテ
   アーゼの製造法。