Gegenstand des Hauptpatents ist ein Verfahren zur Herstellung eines zur Fixierung von Aminoverbindungen fähigen, aktivierten Trägers, welches auf einer vernetzenden und aktivierenden Behandlung von hydroxylhaltigen Polymeren durch Cyanid/Hypochlorit beruht; anschliessend kann das erhaltene, vernetzte und aktivierte Polymere mit der zu fixierenden Aminoverbindung umgesetzt werden.
Es wurde nun gefunden, dass es zwar vorteilhaft, aber nicht notwendig ist, die Hypochloritmenge gemäss den Angaben in der Hauptpatentanmeldung zu bemessen. Dort ist nämlich vorgeschlagen worden, soviel Hypochlorit zuzugeben, bis die Prüfung auf unverbrauchtes Hypochlorit im Reaktionsgemisch positiv ausfällt. Aus der zugehöngen Beschrei bung ist ersichtlich, dass diese Prüfung (Blaufärbung von Kaliumjodidstärkepapier durch die alkalische Reaktionslösung) positiv ausfällt, wenn pro Grammol eingesetztes Natriumcyanid 1 Grammatom positives Chlor bzw. 1 Grammmol Natriumhypochlorit zugegeben worden ist.
Arbeitet man mit weniger Hypochlorit, so verbleibt unverändertes Cyanid. Dieser Umstand hat keinen nennenswerten Einfluss auf Vernetzungs- und Aktivierungsreaktion, wenn die pro Grammäquivalent organisch gebundenes Hydroxyl verbrauchte Hypochloritmenge grösser ist als t/4 bis
112 Grammol.
Arbeitet man mit mehr, z. B. 2 Grammol Hypochlorit pro Grammol eingesetztes Natriumcyanid, so richten sich Vernetzungsgrad und Aminfixierungsvermögen nach der eingesetzten Cyanidmenge. Weitere Faktoren sind die Hydroxyl grappendichte auf der eingesetzten Polyhydroxylverbindung und deren Molekulargewicht sowie Reaktivität.
In der Regel kommt man mit 0,2 bis 2 Grammolen Cyanid pro Grammäquivalent vorgelegtes organisches Hydroxyl aus. Grössere als doppelte Überschüsse an Hypo chlorit sind zweckmässig zu vermeiden, weil andernfalls das in einer Nebenreaktion gebildete Cyanat nicht mehr ausreicht, das vernetzte und aktivierte Polymere vor einer Schädigung durch Hypochlorit zu schützen; Cyanat reduziert Hypochlorit nach der Gleichung: 2NCO + 3 ocr + ocr+ --t H2O2HCO3 + 3Cr+ N2 [Lister, Can. J. Chem. 33, 426140 (1955)]. Obige Mengenangaben umschreiben den praktischen Arbeitsbereich, stellen indessen weder eine obere noch eine untere Grenze dar.
Die Zugabe von Hypochlorit zur Polyhydroxylverbin dung kann auch vor der Zugabe des Cyanids erfolgen.
Zweckmässig lässt man hierbei die wässerige Mischung von Hypochlorit und Polyhydroxylverbindung unter Rühren und guter Kühlung bei etwa 0 C in die wässerige Cyanidlösung eintropfen. Wie unten beschrieben, kann man unter bestimmten Voraussetzungen auch die Cyanidlösung auf einmal zur Mischung von Hypochlorit und Polyhydroxylverbindung geben. Die beträchtliche Wärmeentwicklung erfordert im letzteren Fall eine besonders wirksame Kühlung. Hypochlorit und Polyhydroxylverbindung scheinen, wie unten genauer beschrieben wird, aufeinander einzuwirken, indem ein Teil der Hydroxylgruppen durch unterchlorige Säure verestert wird.
Diese Reaktion kann gegebenenfalls durch Einleiten von COz oder Eintragen von Trockeneis begünstigt werden. Bei Verarbeitung derart vorbehandelter Mischungen von Hypochlorit und Polyhydroxylverbindung ist aber gegebenenfalls darauf zu achten, dass die Alkalinität der Cyanidlösung genügt, um den CO2-bedingten Verlust an Alkalinität in der Hypochloritlösung wettzumachen.
Anstelle von Hypochlorit kann man nun auch eine Mischung von Alkalilauge oder Alkalicarbonatlösung und gasförmigem Chlor verwenden, wobei das Alkali mit der Polyhydroxylverbindung und dem Cyanid vorgelegt oder erst während der Zuleitung des Chlors allmählich zum Reaktionsgemisch gegeben werden kann. Auch hier ist die Reihenfolge umkehrbar, indem der Hydroxylverbindung und dem Alkali zuerst Chlor und erst dann das Cyanid zugegeben werden.
Bezüglich der Stöchiometrie gilt dasselbe wie bei Verwendung von Hypochlorit. Wie bei der Bereitung von Hypochloritlösung wird in bezug auf Chlor ein kleiner Überschuss an Alkali empfohlen.
Es wurde weiter gerunden, dass man das Alkalihypochlorit im erfindungsgemässen Verfahren allgemein durch Verbindungen ersetzen kann, die bei der Hydrolyse hypochlorige Säure bilden. Hierzu gehören [Houben-Weyl 5/3 (1962), Seite 760] die Ester der hypochlorigen Säure und Stickstoffverbindungen, deren Chlor an Stickstoff gebunden ist, wie z. B.
Chlorimide, Chloramide, Chlorimine sowie Chloramine. Genannt seien Äthyl-, Propyl- und tert.-Butylhypochlorit (Houben-Weyl 5/3, und 6/3, 491, 492), N-Chlor-succinimid (Houben-Weyl 5/3, 800), N-Chloracetamid (Houben-Weyl 5/3, 799), Chloramin T und Dichloramin T (Houben-Weyl 5/3, 808) sowie Chloramin (Houben-Weyl 5/3, 796).
Eine Angabe, wonach Chloramin mit Kaliumcyanid in Chlorcyan (Beilstein 3 E II, 32) übergehen soll, hat sich als unzutreffend erwiesen: Es entsteht kein Chlorcyan, wohl aber in erheblichen Mengen Kaliumcyanat [Markwald und Wille, Ber. Dtsch. chem. Ges. 56, 1325 (1923)1.
Ebenso wie N-Chlorverbindungen haben sich analoge Bromverbindungen, wie z. B. N-Bromsuccinimid oder N Bromacetamid als mit bestem Erfolg verwendbar erwiesen. Deshalb werden im neuen Verfahren auch die Verwendung der entsprechenden N-Bromverbindungen und nicht zuletzt die Verwendung der Alkalihypobromite und der hypobromigen Säure selbst einbezogen.
Zweckmässig beschränkt man sich in der Wahl der Nhalogenierten Verbindung mit basischer Stickstoffunktion auf Produkte, welche bei der Halogenabgabe direkt oder nach mider Hydrolyse entweder Ammoniak oder ein tertiäres Amin freisetzen. Beispiele sind das Chloramin (NH2Cl) und das Pyridiniumbromid-perbromid [Bull. Soc. Chim. France 1952, 331). Ammoniak lässt erfahrungsgemäss die Anain- fixierenden Gruppen intakt, weil sich seine Einwirkung vermutlich auf eine Austauschreaktion beschränkt; tertiäre Basen werden wegen Fehlens von substituierbarem Wasserstoff nicht fixiert. Die niederen aliphatischen Alkohole aus den Hypochloriten konkurrieren bei der O-Cyanierung mit den Polyhydroxylverbindungen in der Regel nur unwesentlich.
Vernetzung und Aktivierung erfordern ein alkalisches Reaktionsmilieu, vorzugsweise im Bereich von etwa pH 10 bis etwa pH 13. Es stellt sich von selber ein, wenn man beispielsweise zur wässrigen Mischung von Polyhydroxylverbindung und Natriumcyanid eine der unten beschriebenen Lösungen von Natriumhypochlorit (Natronbleichlauge) oder Chloramin oder Chloramin T oder t-Butylhypochlorit in Substanz zusetzt.
Dies gilt auch, wenn man zunächst eine wässrige Mischung von Polyhydroxylverbindung und einem der eben genannten Halogen-Träger bereitet und die Mischung zur wässrigen Lösung von Natriumcyanid gibt In anderen Fällen, wo die vorgelegte oder die einzutragende Komponente des Reaktionsgemisches zu alkalisch, zu wenig alkalisch oder gar sauer ist, und die andere Komponente ungenügende Pufferkapazität besitzt, um das gewünschte pH in der Mischung der Komponenten zu gewährleisten, setzt man einer oder beiden Komponenten in erforderlichem Masse starke oder schwache Säure, starke oder schwache Base oder ein Puffersalz zu, wie etwa Salzsäure oder Kohlendioxyd, Alkalihydroxyd oder Ammoniak, Alkalicarbonat oder Alkalihydrogencarbonat oder Ammoniumchlorid.
Ein Beispiel ist gegeben bei Verwendung von Chlorwasser als Quelle für positives Chlor, ein anderes bei Verwendung von Blausäure als Quelle für Cyanid. Entsprechende puffernde Massnahmen wird man selbstverständlich auch dann treffen, wenn beide Komponenten zu alkalisch, zu wenig alkalisch oder sauer sind.
Unter einer Komponente des Reaktionsgemisches wird allgemein die Mischung der Polyhydroxylverbindung mit Cyanid und/oder Blausäure oder die Mischung der Polyhydroxylverbindung mit dem Reagens, welches positives Halogen enthält, verstanden. Die andere, ergänzende Komponente ist dann das zur erfindungsgemässen Umsetzung noch erforderliche Mittel, nämlich das Reagens, welches positives Chlor oder Brom enthält, oder Cyanid und/oder Blausäure.
Jede der so definierten Komponenten kann zwecks Vornahme der Umsetzung entweder vorgelegt werden, um alsdann mit der fehlenden Gegenkomponente vesetzt zu werden, oder umgekehrt.
Man beachte, dass an der unteren Grenze des angegebenen pH-Bereiches sowohl Blausäure als auch hypochlorige und hypobromige Säure unvollständig neutralisiert sind.
Es ist also nach obigem gegebenenfalls vorteilhaft, hypochlorige oder hypobromige Säure, welche durch hydrolytischen Zerfall von organischen Hypochloriten oder Stickstoffverbindungen, welche positives Chlor oder Brom enthalten, entsteht, ganz oder teilweise zu neutralisieren. Wenn die betreffende Stickstoffverbindung selber basischen Charakter hat, verliert die Neutralisation ihre Bedeutung. Die alkalisierende Funktion von Alkalihydroxyden und -carbonaten kann auch von überschüssigem Alkalicyanid übernommen werden. Wenn die N-Halogenverbindung bereits salzartig ist, wie zum Beispiel das Chloramin T der Formel CH3C6H4 SO2NNaCl, so ist für die Neutralisation der unterhalogenigen Säure gesorgt und zusätzliches Alkali eher schädlich.
Vernetzung und Aktivierung der Polyhydroxylverbindung vollziehen sich im Temperaturbereich zwischen dem Erstarrungspunkt der Lösung und etwa 500 C; zweckmässig arbeitet man zwischen 0 und Raumtemperatur.
Die nachfolgenden Beispiele beziehen sich der besseren Vergleichbarkeit wegen mit einigen Ausnahmen auf käufliche lösliche Stärke als Ausgangsmaterial. Das neue Verfahren lässt sich ebensogut wie jenes gemäss Hauptpatentanmeldung auf Dextrine, Dextrane, vernetzte Dextrane, Stärkekleister, Zellulose, speziell mercerisierte Zellulose, Zellulosefasern, Agarose und dergleichen anwenden.
Der Polymerisationsgrad der als Ausgangsmaterial brauchbaren Polyhydroxylverbindungen aus der I(lasse der Kohlehydrate ist im Rahmen der Löslichkeit oder Quellbarkeit dieser Verbindungen beliebig. Sogar Saccharose gibt erfindungsgemäss ein unlösliches Produkt mit sehr gutem Enzymfixierungsvermögen. Man ist aber nicht auf Kohlehydrate angewiesen. Auch wasserlösliche Polyvinylalkohole werden, beispielsweise im System Cyanid/Hypochlorit, zu unlöslichen hydrophilen Produkten mit befriedigendem Aminfixierungsvermögen vernetzt.
Die aminfixierenden Eigenschaften von Polymeren, welche auf die hier beschriebene Weise hergestellt werden, bewegen sich im Rahmen, der im Hauptpatent bereits beschrieben worden ist. Experimentell erfolgt die Aminfixierung wie dort beschrieben. Die Eigenschaften der fixierten Aminoverbindungen, im speziellen die Eigenschaften fixierter biologisch aktiver Peptide, und Proteine, bewegen sich ebenfalls im Rahmen einschlägiger Angaben der Literatur und Patentliteratur.
Das neue Verfahren und die Verwendung der Verfahrensprodukte ermöglichen die Herstellung von Umsetzungsprodukten einer gegebenenfalls biologisch aktiven, wasserlöslichen, an mindestens einem basischen Stickstoffatom substituierbaren Aminoverbindung und eines aktivierten Trägers.
Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass Blausäure und/oder ein wasserlösliches Cyanid und ein Reagens, welches positives Chlor oder Brom enthält, nämlich hypochlorige oder hypobromige Säure und/oder ein wasserlösliches Salz der hypochlorigen oder hypobromigen Säure oder eine Chloroder Bromverbindung, welche bei der Hydrolyse eine der besagten Säuren liefert, oder eine Mischung solcher Halogenderivate auf eine wasserlösliche oder quellbare, wasserunlösliche Polyhydroxylverbindung in alkalischem Milieu, vorzugsweise in der Kälte, einwirken lässt und die Reaktionsmischung a) im Falle einer Lösung durch Klärung und Dialyse oder Gelfiltration, b) im Falle einer Suspension durch Filtrieren oder Zentrifugieren und Auswaschen, von niedermolekularen Anteilen befreit.
Die Verwendung des so hergestellten aktivierten Trägers zum Fixieren von Aminoverbindungen ist dadurch gekennzeichnet, dass man besagten aktivierten Träger in Gegenwart von Wasser auf eine wasserlösliche, an mindestens einem basischen Stickstoffatom substituierbare Aminoverbindung einwirken lässt.
Bei der erfindungsgemässen Verwendung kann man mit Vorteil das in der Lösung oder Suspension vorliegende oder als Filter- bzw. Zentrifugenrückstand verbleibende Vernetzungs- und Aktivierungsprodukt in Gegenwart von Wasser und gegebenenfalls eines Puffersystems be. einer Temperatur unterhalb 500 C, vorzugsweise in der Kälte, auf eine gegebenenfalls biologisch aktive, wasserlösliche, an mindestens einem basischen Stickstoffatom substituierbare Aminoverbindung einwirken lassen und dialysierbares oder in gelöster Form verbliebenes Material mit Wasser oder einer wässrigen Salzlösung aus dem Umsetzungsprodukt ausdialysieren oder ausfiltrieren oder auswaschen.
Es ist ungeklärt, welche chemischen Reaktionen der Vernetzung der Polyhydroxylverbindungen zugrunde liegen, und worauf die Aktivität, d. h. die Fähigkeit des vernetzten Produktes zur Fixierung von Aminoverbindungen, beruht. Die Hypothese einer intermediären Bildung von Chlorcyan wurde schon in der Hauptpatentanmeldung als unwahrscheinlich bezeichnet. Sie konnte inzwischen experimentell ausgeschlossen werden, indem unter vergleichbaren Bedingungen Cyanid/ Hypochlorit deutlich anders reagierte als Chlorcyan.
Es ist zwar bekannt, dass - Chlor unterhalb pH 9 aus Alkalicyanid Chlorcyan er zeugt, - Chlorcyan durch Alkalilauge in Alkalicyanat umgewan delt wird, und - bei der Hypochloritoxydation von Alkalicyanid zu Alkali cyanat ein Geruch aufritt, der an Chlorcyan erinnert.
In der Literatur wird deshalb - wenn auch nicht unwidersprochen - die Auffassung vertreten, dass die praktisch momentane Cyanatbildung bei der Hypochloritoxydation von Cyanid über Chlorcyan verlaufe.
Trotzdem stellt die erfindungsgemässe Hypollalogenit/ Cyanid-Behandlung von Polyhydroxylverbindungen (im folgenden mit II bezeichnet) keine Variante der bekannten Alkali/Halogencyan-Behandlung von Polyhydroxylverbindungen (im folgenden mit I bezeichnet) dar. Dies lässt sich besonders einfach und eindrücklich demonstrieren, wenn bei I und II wasserlösliche Polyhydroxylverbindungen, z. B. wasserlösliche Stärke, eingesetzt werden. Die lösliche Stärke wird unter geeigneten Bedingungen sowohl nach 1 als auch nach II infolge von Vernetzung unlöslich.
Die Vernetzungsprodukte fallen in flockiger Form aus, sind leicht isolierbar und besitzen das bekannte Aminfixierungsvermögen von Produkten, wie man sie beispielsweise nach Schweizer Patent Nr. 501 695 durch Halogencyanaktivierung von vernetztem Dextran (Sephadex) oder Cellulose erhält.
Die Vernetzung der Stärke und die offensichtlich gleichzeitige Einführung des Aminfixierungsvermögens lassen sich nach heute diskutierten Vorstellungen schematisch etwa folgendermassen formulieren: Schema
EMI3.1
lösliche unbeständiges unlösliches Stärke Zwischenprodukt Vernetzungsprodukt mit Amin fixierungsvermögen
Die Vernetzungsreaktion (Stufe b) wäre danach bei I und II identisch, hätte also die gleiche pH-Abhängigkeit. Die O-Cyanierung (Stufe a) ist bei I an die Gegenwart von deprotonisierten Hydroxylgruppen der Stärke gebunden und der Konkurrenz durch Hydroxylionen aus dem alkalischen Medium unterworfen (Bildung von Alkalicyanat als Nebenprodukt). Bei II müssten die Verhältnisse ebenso liegen, wenn der erste Schritt im Zuge von II tatsächlich in einer augenblicklichen [vgl. Gmelins Handbuch der Anorganischen Chemie, 8.
Aufl., C (D 1) 14, Seiten 35 und 37 (1971)3 Bildung von Halogencyan bestünde; vor allem müsste unter vergleichbaren Bedingungen immer I mindestens gleich schnell sein wie II. Lässt man dagegen die Hypothese fallen, dass II über Halogencyan verlaufe, so wird bei II dort, wo Stufe a für die Gesamtreaktion (Abscheidung eines unlöslichen Vernetzungsproduktes) geschwindigkeitsbestimmend wird, eine pH-Abhängigkeit möglich, welche anders ist als jene von I. Genau dieses wird experimentell gefunden, wie im Anhang näher beschrieben wird.
Nachstehende Beispiele zur Vernetzungs- und Aktivierungsreaktion und zur Aminfixierung sollen den Rahmen der Erfindung in keiner Weise einschränken. Die Temperatur wird überall in C angegeben.
Experimenteller Teil
I. Die Vernetzungs- und Aktivierungsreaktion
Reagenzien:
Natronbleichlauge. Es wurden die Präparate verwendet, welche man erhält, wenn 80 g NaOH, 375 g Wasser und 375 g Eis unterhalb 0 C unter kräftigem Rühren mit gasförmigem Chlor bis zu einer Gewichtszunahme von 66 g (5 Stunden) behandelt werden. Solche frisch bereitete Lösungen enthalten etwa 7,5 Gewichtsprozent Natriumhypochlorit (jodometrische Analyse); der pH-Wert liegt um 11,5.
Natriumcyanid. Handelsware der Qualität pract. ergab bei der Titration mit Natronbleichlauge einen Gehalt von nahezu 100 /o.
Polyhydroxylverbindungem: wasserlösliche Stärke, Kartoffelstärke, wasserlöslicher Polyvinylalkohol, Zucker (Saccharose), Zellulosepulver Avicel (mercerisiert), gepulverte Fasercellulose MN 300 (Firma Macherey und Nagel), Baumwollgarn (mercerisiert), Viskoseseide (mercerisiert) waren Handelspräparate.
Versuchsanordnung:
Siehe die einzelnen Beispiele im folgenden.
Aufarbeitung:
Lösliche Vernetzungsprodukte wurden durch Filtrieren oder Zentrifugieren (Klärung) ihrer Lösung vorgereinigt und durch Dialyse oder Gelfiltration von niedermolekularen Substanzen befreit. Unlösliche Vernetzungsprodukte fielen in der Regel flockig an, waren im allgemeinen leicht fitrierbar und wurden dann durch Filtration und Auswaschen mit Wasser möglichst sofort vom Alkali und anderen löslichen Stoffen befreit. Sofern nicht sofort zur Aminfixierung weiterverwendet, wurden sie vorzugsweise in der Kälte gelagert. Das Aminfixierungsvermögen ist allerdings erstaublich stabil.
Mehrtätiges Stehenlassen in feuchtem Zustand bei Raumtemperatur erwies sich in sehr vielen Fällen als zulässig.
Beispiele 1. Wasserlösliche Stärke/Hypochlorit oder hypochlorige Säure
Man suspendiert 2 g wasserlösliche Stärke in 100 ml Wasser, erhitzt auf dem Wasserbad bis zur Lösung und lässt erkalten. Man versetzt je 5 ml dieser Stärkelösung (je 100 mg Stärke, entsprechend etwa 2 mVal-OH) mit je 100 mg (2 mMol) Natriumcyanid, verdünnt mit Wasser auf 10,25 oder 50 mol, kühlt auf 5 oder 0 oder 100 C ab und versetzt bei guter Kühlung tropfenweise mit Bleichlauge entsprechend einer Menge von 1/2 oder 1 oder 2 oder 4 mMol Natriumhypochlorit. Flockung setzt ein nach Zugabe von 0,5 bis 1 mMol Natriumhypochlorit, weitgehend unabhängig von Temperatur und Volumen der Reaktionsmischung. Das Trockengewicht der Ausfällungen liegt um 100 mg.
Dieselbe Versuchsreihe mit nur 50 mg (1 mMol) Natriumcyanid ergibt etwa das gleiche Resultat.
Führt man diese Versuche derart durch, dass die ganze Hypochloritmenge auf einmal zum Stärke/Cyanid-Gemisch gegeben wird, so erfolgt die Ausflockung nur dann mit Sicherheit, wenn das Cyanid im Überschuss vorlag. Im Fall von unterschüssigem Cyanid scheint sich die Reaktion im wesentlichen auf die Oxydation des Cyanids zu beschränken.
Dieser letztere Eindruck bestätigt sich, wenn man das Hypochlorit vorlegt und das Stärke/Cyanid-Gemisch dazugibt. Erfolgt diese Zugabe tropfenweise, so erfolgt auch bei Cyanid-Überschuss keine Produktflockung. Erfolgt sie dagegen auf einmal, so ist im Fall von Cyanidüberschuss Produktflockung zu beobachten. Man vergleiche hierzu die Diskussion über den Reaktionsmechanismus im Anhang.
Der pH-Wert obiger Reaktionslösungen liegt bei etwa 12. Verdünnt man das Stärke/Cyanid-Gemisch mit 0,1-n Natronlauge anstelle von Wasser, so erfolgt keine Produktflockung. Ein pH von 13 stellt also ungefähr die obere Grenze dar. Legt man 100 mg Stärke und 100 mg Natriumcyanid in 15 ml Wasser vor (pH 11,2) und versetzt dann innert 5 Minuten bei 0-50 C mit 2 mMol Natriumhypochlorit und 2 mMol Natriumhydrogencarbonat in 10 ml Wasser (pH 10,8) oder mit dem Reaktionsprodukt von 2 mMol Natriumhypochlorit und 1 g festem COl in 10 ml Wasser (pH 7,8), so erfolgt beide Male Flockung schon vor beendeter Zugabe; die pH-Werte nach beendeter Zugabe sind bei 11,0 und 10,6.
Setzt man dagegen zum selben Stärke/Cyanid-Gemisch 2 mMol HC1 und 2,5 mMol K2CO3 (Totalvolumen 15 ml, pH 10,0), so bewirkt obige Lösung von hypochloriger Säure mit dem pH 7,8 nicht mehr in jedem Fall eine Produktflokkung. Der pH-Endwert solcher Reaktionsmischungen liegt um 10,0. Keine Flockung erfolgt, wenn die Stärke/Cyanid Mischung wegen Zusatz von 2 mMol HC1 und 0,1 mMol K2COs einen pH von 9,8 oder wegen Zusatz von 2 mMol HCI ein pH von ca. 7 besitzt und das pH nach Reaktion mit der Lösung der hypochlorigen Säure vom pH 7,8 bei 9,6 oder 7,5 liegt. Daraus folgt für die untere. pH-Grenze ein Wert von etwa 10. Die Alkalinität von Stärke/Cyanid-Gemisch kann wahlweise auch durch Zusatz von Ammoniumchlorid abgepuffert werden.
2. Wasserlösliche Stärke/Chlor und Natronlauge oder Kaliumcarbonat
Man versetzt 5 ml Stärkelösung (100 mg Stärke) mit 100 mg (2 mMol) Natriumcyanid, 2 ml oder mehr einer l-m Lösung von Kaliumcarbonat (mindestens 2 mMol) und 8 ml Wasser, kühlt auf 0 C, setzt 10 g Eis zu und leitet unter guter Kühlung Chlorgas (2 mMol) ein, bis das Reaktionsgemisch auf Kaliumjodid/Stärke- Papier positiv anspricht.
Das Produkt fällt flockig aus. Dies ist auch der Fall, wenn 5 ml Stärkelösung, 2 ml 2-n Natonlauge, 3 ml Wasser und 10 g Eis unter Kühlung mit Chlor (ca. 2 mMol) behandelt werden, bis der pH-Wert zwischen 9,5 und 10 liegt, und dann aul einmal mit einer Lösung von mindestens 100 mg Natriumcyanid in 5 ml Wasser übergossen werden. Man beachte, dass bei dieser Ausführungsform ein Cyanid-Uberschuss erforderlich ist.
3. Stärkeldeister/Brom und Natronlauge oder
Kaliumhydrogencarbonat
Man erwärmt 300 mg Stärke in 35 ml Wasser auf 700 C, lässt erkalten, zentrifugiert während 5 Minuten bei 3000 Umdrehungen pro Minute, dekantiert den Überstand ab, setzt zum Rückstand, der ein Trockengewicht von etwa 100 mg besitzt, 2 ml 2-n Natronlauge und 0,5 ml einer Lösung von 110 mg (2,2 mMol) Natriumcyanid in 5 ml Wasser, kühlt auf 0-50 C und lässt nun gleichzeitig, aber getrennt, die restliche Cyanidlösung und 320 mg Brom (2 mMol) derart unter kräftigem Rühren eintropfen, dass mit Kaliumjodid/ Stärke-Papier in keinem Moment überschüssiges Brom bzw.
Hyprobromit nachgewiesen werden kann. Es flockt ein gut filtrierbares Vernetzungsprodukt. Das Ergebnis ist ungefähr gleich bei Verwendung der doppelten Menge von Natronlauge, Cyanid und Brom, aber schlechter bei Verwendung der jeweils halben Menge.
Man kann auch den Stärkekleister mit 110 mg Natriumcyanid (2,2 mMol), mindestens 4 ml einer 1-m Lösung von Kaliumhydrogen-carbonat und dann tropfenweise unter Kühlung mit 320 mg Brom (2 mMol) versetzen, worauf der Kleister infolge Veränderung durch Vernetzung filtrierbar wird.
In einer dritten Variante versetzt man den Stärkekleister mit 320 mg Brom, tropft unter gutem Rühren und Kühlen mindestens 4 ml 1-m Kaliumhydrogen-carbonat-Lösung zu, lässt 15 Minuten stehen und versetzt auf einmal mit der Lösung von 140 mg Natriumcyanid (2,8 mMol) in 5 ml Wasser, wobei für intensivstes Rühren zu sorgen ist.
4. Wasserlösliche Stärke/Chloramin T
Man versetzt 5 ml Stärkelösung (100 mg Stärke) mit 100 mg (2 mMol) Natriumcyanid in 20 ml Wasser und tropft innert 11 Minuten bei 50 C eine Lösung von 562 mg (2 mMol) Trihydrat von Chloramin T in 2 ml Dioxan unter gutem Umrühren zu. Die Produktflockung erfolgt schon vor Beendigung der Chloraminzugabe. Man kann mit demselben Erfolg bei 200 C arbeiten und/oder eine wässerige Lösung von Chloramin T benützen.
5. Wasserlösliche Stärke/N-Bromsuccinimid
Man versetzt 5 ml Stärkelösung (100 ml Stärke) mit 100 mg (2 mMol) Natriumcyanid in 15 ml Wasser und 1 ml 2-n Natronlauge und hierauf bei 200 C tropfenweise unter Rühren mit einer Lösung von 360 mg Bromsuccinimid in 2 ml Dioxan. Dauer ca. 15 Minuten. Die Umsetzung wird schon nach etwa 7 Minuten durch Ausbildung einer Trübung sichtbar.
Anstelle von N-Bromsuccinimid kann man auch N Bromacetamid oder N-Chlorsuccinimid verwenden.
6. Wasserlösliche Stärke/Chloramin
Man versetzt eine Mischung von 1-n Ammoniak und Eis mit Natronbleichlauge (1 Mol Natriumhypochlorit pro Mol Ammoniak), destilliert am Vakuum (Kpeo = 350 C) und kondensiert die wässerige Chloramin-Lösung in gut gekühlter Vorlage. Die Gehaltsbestimmung erfolgt jodometrisch.
Man versetzt 5 ml Stärkelösung (100 mg) Stärke mit 100 mg (2 mMol) Natriumcyanid in 10 ml Wasser, kühlt auf 2-40 C und tropft unter gutem Rühren und Kühlen 10 ml Chloraminlösung (2 mMol) zu. Es fällt ein sehr gut filtrierbares Vernetzungsprodukt aus, Trockengewicht ca. 100 mg. Etwas Ammoniak in der Chloraminlösung ist unschädlich.
7. Wasserlösliche Stärke/t-Butylhypochlorit
Man tropft nur 5 ml Stärkelösung (100 mg Stärke) und 100 mg Natriumcyanid (2 mMol) in 20 ml Wasser (pH 11,1) bei 50 C unter gutem Rühren 217 mg (2 mMol) frisch bereitetes, aber nicht destilliertes t-Butylhypochlorit. Noch bevor die gelben Estertropfen völlig verschwunden sind, setzt die Reaktion ein (Opaleszenz), und einige Sekunden später erfolgt die Ausflockung des vernetzten Reaktionsproduktes (pH I 10,8). Das Ergebnis ist ähnlich, wenn das Stärke/Cyanid- Gemisch vorher mit 1 oder mit 2 ml einer 1-m Lösung von Pottasche versetzt wird.
Mit gleichem Erfolg verwendet man die Ester der hypochlorigen Säure mit äthanol, Propanol oder tert. Amylalkohol.
8. Wasserlösliche Produkte mit Aminfixierungsvermögen
Durch Anwendung höherer Verdünnungen (50 ml, 100 ml oder mehr pro 100 mg wasserlösliche Stärke) gelangt man nach den unter 1-2) und W7) beschriebenen Verfahren im vorgeschriebenen pH-Bereich, insbesondere bei kräftigem Umrühren, zu Verhältnissen, wo keine Flockung mehr eintritt, aber an der gelösten Substanz gleichwohl ein Aminfixierungsvermögen nachweisbar ist, insbesondere gegenüber niedermolekularen dialysierbaren Aminoverbindungen. - Einen qualitativ gleichen Effekt erzielt man durch Verringerung der die Vernetzung limitierenden Menge an Cyanid bzw.
Hypochlorit auf etwa 0,25 Val pro Val organisches Hydroxyl.
9. Saccharose/Hypochlorit
Man löst 100 mg Saccharose (Zucker) in 10 ml Wasser (2,34 Milligrammäquivalente organisches Hydroxyl), fügt 100 mg Natriumcyanid (2 mMol) dazu, kühlt auf 5-100 C und versetzt unter starkem Rühren mit 2 mMol Natriumhypochlorit in Form von Natronbleichlauge. Schon nach Zugabe der halben Menge des Hypochlorits fällt ein flockiges Vernetzungsprodukt aus. Es wird nach Beendigung der Hypochloritzugabe abfiltriert und gründlich ausgewaschen. Sein Aminfixierungsvermögen ist tadellos; das Trockengewicht beläuft sich auf rund 100 mg. Es ist bemerkenswert, dass diese Verbindung sich beim Stehen im alkalischen Reaktionsme dium nach einigen Stunden verflüssigt. Die gleiche Eigenschaft besitzt ein Produkt, welches man aus 100 mg Saccharose, 10 ml Wasser und 106 (1 mMol) bzw. 212 (2 mMol) Bromcyan und 1 bzw. 2 ml 1-n NaOH erhält.
Diese Saccharosederivate sind neu.
Entsprechend verhalten sich andere nicht reduzierende Oligosaccharide, z. B. das Trisaccarid Raffinose und das Tetrasaccarid Stachyose. Auch deren Vernetzungsprodukte sind neue Verbindungen.
10. Polyvinylalkohol/Hypochlorit
Man löst 100 mg Polyvinylalkohol (2,3 Milligrammäquivalente organisches Hydroxyl) in 10 ml siedendem Wasser, setzt zur erkalteten Lösung 100 mg (2 mMol) Natriumcyanid und dann bei 0-50 C unter Rühren 2 mMol Natriumhypochlorit in Form von Natronbleichlauge. Das Vernetzungsprodukt fällt in groben, etwas schmierigen Flocken aus, lässt sich aber gleichwohl abfiltrieren und auswaschen. Das Produkt ist in Kontakt mit Wasser stabil wie die Produkte aus den Beispielen 1 bis 9, verflüssigt sich aber wie das Saccharosederivat beim Stehen im alkalischen Reaktionsmedium.
11. Baumwollgarn/Hypochlorit oder hypochlorige Säure
500 mg rohes Baumwollgarn werden mit Wasser ausgekocht und zur Entfernung zweimal mit Alkohol, zweimal mit Tetrachlorkohlenstoff und zweimal mit Äther gewaschen und an der Luft getrocknet. Das Garn wird anschliessend über Nacht in 17obiger Natronlauge unter Luftausschluss stehen gelassen, gut ausgewaschen, mit 500 mg Natriumcyanid in 10 ml Wasser und anschliessend bei 0-50 C tropfenweise mit 10 mMol Natriumhypochlorit in Form von Natronbleichlauge versetzt. Man wäscht gründlich aus und bestimmt das Aminbindungsvermögen, indem nach erfolgter Enzymfixierung mehrere aufeinanderfolgende Aktivitätsprüfungen duchgeführt werden, wobei zwischen jeder Prüfung aufs neue gründlich ausgewaschen wird.
Diese Vorsichtsmassnahme ist notwendig, weil auch unspezifische Enzymfixierung auf mercerisierten Fasern beobachtet worden ist, und weil die Säureempfindlichkeit des Enzympräparates den sonst üblichen Waschprozess mit einem schwach sauren Puffer ausschloss.
Eine Variante besteht darin, das gewaschene und mercerisierte Garn mit der oben angegebenen Menge von Natronbleichlauge und überschüssigem festem CO zu behandeln, die Flüssigkeit abzudekantieren und das Garn in die wässrige Lösung von 500 mg Natriumcyanid einzutragen. Nach 5 bis 10 minütigem Stehen wird die Lösung abgegossen und das Garn mit Wasser ausgewaschen.
In einer dritten Variante wird das gewaschene und mercerisierte Garn (500 mg) mit 3 g Natriumcyanid in möglichst wenig Wasser über Nacht inkubiert und nach Verdünnen mit 25 ml Wasser unter starker Kühlung mit 60 mMol Natriumhypochlorit versetzt, wobei starkes Rühren erforderlich ist.
12. Viscosegarn/Hypochlorit
Man suspendiert 250 mg Viscosegarn in 2-n Natronlauge, giesst nach 1 Stunde ab, wäscht mit Wasser aus, übergiesst mit einer Lösung von 500 mg Natriumcyanid in 5 ml Wasser, inkubiert 30 Minuten, kühlt auf 50 C und versetzt innert 30 Minuten mit 10 mMol Natriumhypochlorit in Form von 7 0/0 Natronbleichlauge, wobei kräftig gerührt wird, und wäscht mit Wasser gründlich aus.
13) Anstelle der wasserlöslichen Stärke kann man nach 1-2 und W8 Dextrine oder Mischungen von Destrinen und wasserlöslicher Stärke oder Mischungen von wasserlöslicher Stärke und Polyvinylalkohol verwenden. Ebenso ist Natronbleichlauge durch eine äquivalente Menge von Kalibleichlauge und Natriumcyanid durch Kaliumcyanid ersetzbar; die verwendeten Bleichlaugen wurden in jedem Fall titriert.
14) Arbeitstemperaturen von 25 bis zu 500 C verwendet man, um bei Einsatz konzentrierterer Lösungen Gelierung des Eduktes wie auch des Produktes zu vermeiden. Ein Beispiel bietet die Anwendung des Verfahrens auf die Vernetzung und Aktivierung von Pektinen und von Schleimstoffen, deren Wasserlöslichkeit bei mässiger Vernetzung erhalten bleibt.
15. Kartoffelstärke/Hypochlorit
Man suspendiert 10 g Kartoffelstärke für Speisezwecke in 11 Wasser, erwärmt während einer Stunde auf 600 C unter leichtem Rühren, zentrifugiert, giesst den Üb erstand ab, versetzt den Rückstand, der ein Volumen von ungefähr 450 ml besitzt, mit 14,7 g (0,3 Mol) Natriumcyanid, rührt, kühlt auf 100 C und lässt innert 30 Minuten 130 ml (9,25 Mol Hypochlorit) Natronbleichlauge einlaufen. Der pH-Wert steigt von 11 auf 12,5. Man filtriert auf einer Glasfritte und wäscht mit 1,5 1 Eiswasser. Das Produkt wird sofort verwendet oder im gefrorenen oder lyophilisierten Zustand aufbewahrt.
In einer Variante A suspendiert man 10 g Stärke derselben Qualität in 500 ml Wasser, erhitzt 30 Minuten auf 600 C, lässt erkalten, fügt 24,5 g (0,5 Mol) Natriumcyanid zu, kühlt auf 50 C und versetzt unter Rühren gleichzeitig mit 200 ml (0,38 Mol Hypochlorit) Natronbleichlauge, 2-n Salzsäure derart, dass der pH-Wert in der Reaktionsmischung im Bereich von 11 bis 11,5 bleibt. Die Operation dauert 30 bis 40 Minuten.
In einer Variante B versetzt man das Gel nach Variante A mit 19,5 g Natriumcyanid (0,4 Mol). Hierauf wird unter Rühren bei 50 C Chlor eingeleitet und der pH-Wert durch gleichzeitiges Zugeben von 2-n Natronlauge bei 11 bis 11,5 gehalten. Die Operation wird nach Zugabe von 200 ml Lauge (0,8 Mol) abgebrochen.
In einer Variante C löst man im Stärkegel nach Variante A 2,45 g Natriumcyanid (0,05 Mol). Man kühlt auf 50 C und leitet unter Rühren langsam (blasenweise) Chlor ein, wobei der pH-Wert durch kontinuierliche Zugabe einer Lösung von 22 g (0,45 Mol) Natriumcyanid in 300 ml 2-n Natronlauge auf ungefähr 11 gehalten wird. Die eingeleitete Chlormenge entspricht ungefähr 0,3 Mol Natriumhypochlorit.
In einer Variante D suspendiert man 20 g Kartoffelstärke derselben Qualität in 800 ml Wasser von 30 bis 400 C, erwärmt während 30 Minuten auf 600 C, kühlt die transparente gelatinöse Masse auf 50 C, setzt 25 ml einer Lösung von 25,5 g (0,52 Mol) Natriumcyanid in Wasser (Totalvolumen 245 ml) zu, rührt langsam und gibt während ungefähr einer Stunde gleichzeitig ein: 220 ml (0,44 Mol Natriumhypochlorit) Natronbleichlauge, und die restlichen 220 ml obiger Lösung von Natriumcyanid.
Nach Beendigung der Reaktion liegt der pH-Wert zwischen 13 und 14. Man filtriert bei 150 C, wäscht mit Wasser chlorfrei (2 1) und erhält einen Filterkuchen von 157 g. Sein Trockengewicht beträgt 22,6 g, der Stickstoffgehalt 6,4 O/o, bezogen auf das Trockengewicht.
In einer Variante E verfährt man genau wie in Variante D, arbeitet aber mit einer Lösung von 49 g (1 Mol) Natriumcyanid (Totalvolumen 245 ml). Das Resultat ist praktisch identisch mit dem Resultat von Variante D (Gewicht des Filterkuchens, Trockengewicht, Stickstoffgehalt) mit Ausnahme des Umstandes, dass Filtrat und Waschwasser in diesem Fall 0,54 Mol unverändertes Cyanid enthalten. Der Cyanidverbrauch entspricht also der Menge des eingesetzten Hypochlorits.
In einem völlig identischen Parallelversuch ist laufend geprüft worden, wie sich eine kleine Probe des Reaktionsge misches in essigsaurem Milieu gegen Kaliumjodidstärke- papier verhielt. Es trat regelmässig eine blaue Färbung auf, wenn das Molverhältnis von zugesetztem Cyanid den Wert 0,46 überschritt. In alkalischem Milieu tritt die blaue Färbung bekanntlich erst ein, wenn das besagte Verhältnis den Wert 1 überschreitet. Die Bedeutung dieses Unterschiedes bleibt vorläufig unklar. Möglicherweise ist die blaue Färbung in essigsaurem Milieu ein Hinweis auf ein Zwischenprodukt, welches bei Unterschreitung vom Molverhältnis 0,46 jeweils wieder verschwindet. Um Chlorcyan kann es sich nicht handeln, denn Chlorcyan färbt das I(aliumjodid-Stärkerea- gens nicht.
Ebensowenig handelt es sich um unverbrauchtes Hypochlorit, denn dieses färbt das Reagens schon in alkalischem Milieu.
Eine Probe des lyophilisierten Produktes absorbierte in Kaliumbromid zwischen 3200 und 3600 cm - 1 (OH-Bande) etwas schwächer als die als Ausgangsmaterial benützte Stärke, ferner schwach, aber deutlich bei 2150 cm - 1 (Zuordnung unsicher: Cyanat ? ,C=NH ?) und stark bei 1720 cm-1 ( ,C =N-Bande).
16. Bemerkung zur Stärkequalität
Nicht jede industrielle Stärke ist als solche zur erfindungsgemässen Vernetzung und Aktivierung zwecks Aminfixierung geeignet. Es ist in der Tat nicht überraschend, dass das Ausgangsmaterial einerseits, die Extraktions- und die Aufschlussmethode andererseits die Zugänglichkeit und die Re aktionsfähigkeit der erfindungsgemäss involvierten Hydroxylgruppen beeinflussen. Die Verhältnisse sind hier also ähnlich wie bei Zellulosepulver und Zellulosefasern.
II. Die Aminfixierungsreaktion
Repräsentative Beispiele bieten - die Fixierung einer Acylase, welche von der Firma Ama no Pharmaceutical Co. Ltd., Nagoya (Japan) zur indu striellen Racematspaltung von N-acetylierten a-Amino säuren angeboten wird, - die Fixierung von kristallisiertem Chymotrypsin, und - die Fixierung von Valin und von Glutaminsäure.
In ausgedehnten Vorversuchen mit der genannten Acylase ist festgestellt worden, dass es vorteilhaft ist, die aktivierten Produkte bei 4 oder - 150 C aufzubewahren; Aktivitätsverluste bei Raumtemperatur innert 48 Stunden in feuchtem Zustand sind indessen unerheblich. Im lyophilisierten Zustand spielt die Aufbewahrungstemperatur keine grosse Rolle. Ihre Fixierung erfolgt in Wasser oder 0,1-n Hydrogencarbonatlösung unter Zusatz von 10-4-m I(obaltchloridlösung etwas effektiver als in 0,1-n Hydrogencarbonatlösung. Erhöht man die Ionenstärke durch Zusatz von Kochsalz (0,1-n oder 0,5-n), so nimmt die Fixierung etwas zu.
Von grösseerer Bedeutung ist die Verdünnung: in Mischungen von je 1 g lyophilisiertem ak tivem Träger und je 0,1 g Acylase in 5, 20 oder 50 ml Wasser betrug die Fixierung 84, 79 und 68 o/o der eingesetzten Aktivität. Eine wichtige Rolle spielt auch das Verhältnis von Träger zu Enzym:
Je 10 g feuchter Träger wurden mit 0,02, 0,05, 0,1 und 0,2 g Enzym in 10 ml 0,1-n Hydrogencarbonatlösung und 10-4-m Kobaltchloridlösung während 72 Stunden bei 40 C inkubiert. Nach Auswaschen mit je einem Liter desselben Puffers ergab die Aktivitätsbestimmung im Filtrat Fixierung von 100, 100, 77,3 und 83,5 /o.
Die Fixierung erfolgt verhältnismässig langsam:
Je 5 g feuchter Träger, 0,1 g Acylase und 5 ml Wasser wurden bei 40 C während 1, 2, 12 und 24 Stunden inkubiert.
Nach Filtration und Auswaschen fanden sich im Filtrat 46, 47, 39, 27 und 13 o/o der eingesetzten Aktivität.
Am wirkungsvollsten erscheint die schon in der Hauptanmeldung vorgeschlagene Methode, das lyophilisierte oder anderweitig nach Möglichkeit entwässerte Enzym in den bei der Filtration des aktivierten Trägers erhaltenen feuchten Filterkuchen einzurühren, wobei es von Vorteil sein kann, den Filterkuchen vorgängig in Puffer zu suspendieren, den überschüssigen Puffer durch Filtration zu entfernen und den nunmehr gepufferten Filterkuchen zu verwenden.
17. Acylase, Fixierungstest
Man vermischt die feuchten Filterkuchen aus je 100 mg wasserlöslicher Stärke der Beispiele 1, 2, 4, 5, 6 und 7, aus 100 mg Saccharose nach Beispiel 9 und aus 100 mg Polyvinylalkohol nach Beispiel 10 mit 25 mg eines Enzympräparates, das durch Dialysieren der Amano -Acylase und Lyophilisieren des nicht-dialysierbaren Anteils erhalten wurde, lässt über Nacht in der Kälte stehen, wäscht mit 200 ml des oben genannten Hydrogencarbonat/Cobaltchloridpuffers aus und versetzt zur Aktivitätsprüfung mit einer Standardlösung des Natriumsalzes von Acetyl-DL-phenylalanin.
Eine Vorbehandlung des Filterkuchens mit dem Puffergemisch erwies sich in den meisten Fällen als überflüssig.
In entsprechender Weise behandelt man die Filterkuchen nach Beispiel 3 und die Fasern nach Beispiel 11 und 12.
18. Acylase, Anwendungstest
Man suspendiert einen nach 15 Variante D, aus 10 g Kartoffelstärke erhaltenen Filterkuchen in 300 ml Natrium hydrogencarbonat/lobaltchlorid (0,1-n und 10 - 4-m), rührt langsam während 30 Minuten bei Raumtemperatur, filtriert und rührt 3 g Acylase in den Filterkuchen ein. Man lässt über Nacht in der Kälte stehen, wäscht sehr sorgfälrig mit 2 1 Wasser aus und inkubiert mit 24 g Acetyl-DL-phenylalanin Natrium in 300 ml 10-4-m Cobaltchlorid unter langsamem Rühren bei 400 C in Gegenwart von etwas Thymol, filtriert nach 48 Stunden ab und setzt einen zweiten Abbauzyklus an, wie in der Hauptanmeldung beschrieben. Auch die Isolierung von L-Phenylalanin erfolgt wie beschrieben.
In einem Fall sind 60 solche Abbauzylden durchgeführt worden, mit einem Unterbruch von einem Monat, währenddessen das Enzympräparat bei 0 C in Gegensart einer Substratlösung aufbewahrt wurde. In einem anderen Fall sind 130 Zyklen durchgeführt worden, bevor ein Aktivitätsverlust den Abbruch der Versuchsreihe erforderte.
19. Chymotrypsin
Man löst eine Mischung von 25 mg Chymotrypsin und 25 mg Natriumsulfat in 2 ml Wasser, lyophilisiert und verreibt den Rückstand unter Zusatz von 2 ml 0,1-n Natriumhydrogencarbonatlösung mit einem nach Beispiel 1 bei 0 bis 50 C erhaltenen Filterkuchen aas 200 mg löslicher Stärke, 200 mg Natriumcyanid, 20 ml Wasser und 4 mMol Natriumhypochlorit (Bleichlauge), lässt 30 Stunden bei Zimmertemperatur stehen, wäscht gründlichst mit 1,5 1 Wasser und lyophilisiert den Rückstand: Trockengewicht ca. 220 mg mit einem Wassergehalt von 11,5 o/o (Karl Fischer-Titration). Eine Probe wurde 36 Stunden bei 1100 C in 20 /Oiger Salzsäure hydrolysiert, und das Hydrolysat nach Stein und Moor auf Aminosäuren analysiert.
Es wurden die erwarteten Aminosäuren im erwarteten Mengenverhältnis gefunden; ihre Gesamtmenge entsprach einer Fixierung von 16,5 mg Chymotrypsin.
20. Valin auf löslichem Träger
Man fügt zu den dialysierten Lösungen nach Beispiel 8 und Beispiel 14 1 o/o vom Gewicht der Lösung Valin, puffert mit etwas Hydrogencarbonat auf pH 9, lässt über Nacht bei 0 C stehen, dialysiert bei 0 C bis zur völligen Entfernung der Natriumionen und lyophilisiert. Im Hydrolysat der lyophilisierten Produkte findet sich Valin.
21. Glutaminsäure auf unlöslichem Träger
Je ein nach der Hauptvorschrift in Beispiel 15 bereiteter Filterkuchen wurde in verschiedener Verdünnung bei verschiedener Temperatur während verschiedenen Zeiten mit 8 g Glutaminsäure (54 mMol) und 5,6 g Natriumcarbonat (54 mMol) behandelt. Die erzielte Beladung nimmt im Konzentrationsbereich von 0,01 bis 0,1 g Glutaminsäure pro ml um einen Faktor 6,5 zu, von 0 auf 200 C um einen Faktor 1,3, von 20 auf 400 C um einen Faktor 1,16 zu, und von 2,5 auf 5 Stunden um einen Faktor 1,17, von 5 auf 50 Stunden nochmals um denselben Faktor zu. Bei konstantem Volumen nimmt sie bei Verfünffachung der Glutaminsäuremenge um das dreieinhalbfache zu.
Bei Verdünnung mit 20 ml Wasser, Raumtemperatur und 15stündiger Reaktionsdauer resultierte eine Fixierung von durchschnittlich 10 mMol Glutaminsäure (Bestimmung acidimetrisch und durch Aminosäureanalyse nach Stein und Moore). Die fixierte Glutaminsäure verbraucht pro Mol 1 Mol Lauge; ihre Titrationskurve (pK 9,5) erinnert an jene von Mononatriumglutamat in Gegenwart von sehr viel Formaldehyd (pK 9,75).
III. Analytischer Nachweis von fixierter Enzymaktivität
22. Fixierte Acylase
Ein Filterkuchen oder eine Fasermenge, welche 100 mg ursprünglich eingesetzter Polyhydroxylverbindung entspricht, wird in 4 ml 10-4-m Cobaltchloridlösung aufgenommen, auf 400 C erwärmt und mit 4 ml einer auf 400 C erwärmten Lö sung versetzt, welche DL-Acetylphenylalanin (4.5 10 10-3-m), Natriumhydrogencarbonat (6.6 10- 10-3-m) und Kobaltchlorid (10-4-m) enthält. Man inkubiert 30 Minuten bei 400 C unter Rühren, filtriert und trägt 5 lul des Filtrates auf eine Dünnschicht aus Kieselgel, und daneben 5 yl von Vergleichslösungen, welche gerade so viel Phenylalanin enthalten, dass auf dem Chromatogramm Flecken entstehen, welche einem enzymatischen Abbau von 5, 10, 20 und 40 0/0 entsprechen.
Fliessmittel ist Chloroform/Methanol/Eisessig/Pyridin (70/ 25/5/5). Das dermassen geschätzte Ausmass des enzymatischen Abbaus lag bei allen in den Beispielen beschriebenen Ausführungsformen zwischen 5 und 40 0/o.
23. Fixiertes Chymotrypsin
Man gibt die Lösung von 20 mg Acetyl-L-tyrosinäthylester in 3 ml Äthanol zu 9 ml 0,1-n Phosphatpuffer (pH 7,8), setzt das Enzympräparat zu, schliesst den pH-Stat an und verfolgt die Reaktion durch den Verbrauch von 0,2-n Natronlauge bei 27-280 C. Die Aktivität des Präparates aus 19 war etwa halb so gross wie es die fixierte Chymotrypsinmenge erwarten liess.
Anhang
1. Experimenteller Vergleich der Reaktionswege I und II
Zur Diskussion stehen die Reaktionswege I und II nach dem vorstehenden Schema.
Im Zuge von I wird wegen der Reaktion:
XCN + bROH + (1- < 3) HOH BROCN + (1-
HOCN + HX eine gewisse Menge Säure frei. Im Zuge von II dagegen wird unabhängig vom Mechanismus wegen der Reaktion:
NaOCl + NaCN + aROH + (1-6) HOH o BROWN + (1-6) NaOCN + 6NaOH + NaCl eine gewisse Menge Alkalihydroxyd frei. Ausserdem enthält Hypochlorit etwas freie Alkalilauge.
Säure wie Lauge lassen sich im vorliegenden Fall durch die Gegenwart von starkem Carbonatpuffer somit auffangen, dass sich die pH-Verschiebungen im Rahmen von nur 0,3-0,4 pH-Einheiten bewegen. Eine pH-Regulierung mittels pH-Stat musste wegen der hohen Reaktionsgeschwindigkeiten ausser Betracht fallen.
Die pufferbedingte hohe Salzkonzentration verlangsamt I sowohl wie II. Ebenso wirkt die Erniedrigung der Reaktionstemperatur von 20 auf 0 C. Durch Kumulierung dieser Effekte werden I und II bequem vergleichbar. Nachstehende Vergleichsversuche sind typisch mit Hinsicht auf Reaktionsbedingungen und Resultate:
:
Eine Stammlösung aus 5 ml 20/obige Stärkelösung (Gew./ Gew.), 10 ml 2-m K2CO3 versetzt man mit entweder 10 ml Wasser 1,17 g NaCl (20 mMol), 5 ml 1-m KHCO3, 138 mg NaCl (2,34 mMol), und erhält so Lösung A, pH 10,55 oder 10 ml 2-m K2CO3, 5 ml 1-m KHCO3, 138 mg NaCl (2,34 mMol) und erhält so Lösung B, pH 11,1 oder 10 ml Wasser, 1,17 g NaCl (20 mMol), 5 ml 1-m KHCOB, 128 mg NaCN (2,6 mMol) und erhält so Lösung C, pH 10,6 oder 5 ml Wasser, 293 mg NaCl (5 mMol), 10 ml 2-m K2CO3, 138 mg NaCl (2,34 mMol) und erhält so Lösung D, pH 12,0.
Man kühlt die Lösungen A, B, C und D auf - 10 C und lässt unter starkem Rühren innert einer Minute zu A bzw.
B bzw. D je 3 ml (2,6 mMol) einer frisch bereiteten wässrigen Lösung von frisch bereitetem Chlorcyan (Verfahren nach I), und zu C 2,53 g (2,34 mMol NaOCl) Bleichlauge (Verfahren nach II) eintropfen. A und B (Verfahren I) reagieren schwach exotherm; die Temperatur wird durch Kühlung um 0 C gehalten. Nach 13 Minuten ist der Geruch des Chlorcyans noch schwach feststellbar; der pH-Wert liegt bei 10,25 (A) bzw. 10,8 (B). Die Abscheidung eines unlöslichen Vernetzungsproduktes erfolgt nicht. - C (Verfahren II) reagiert stark exotherm; die Temperatur steigt trotz Kühlung vor übergehend auf + 30 C. Noch vor Beendigung der Hypochlorit-Zugabe wird das Reaktionsgemisch milchig, und dann erfolgt innert Sekunden die Abscheidung des Vernetzungsproduktes in flockiger, gut filtrierbarer Form.
Ein scharfer Geruch verschwindet ziemlich schnell. 13 Minuten nach Versuchsbeginn liegt der pH-Wert bei 11,0. - Der Versuch mit Lösung D dient zur Kontrolle der Chlorcyan-Qualität: noch vor Beendigung der Chlorcyan-Zugabe tritt die für Vernetzung typische milchige Trübung auf und innert Sekunden erfolgt dann die Ausflockung des Vernetzungsproduktes. Man hält noch 12 Minuten um 0 C; der pH-Wert liegt bei 11,2.
Der Chlorcyan-Geruch verschwindet erwartungsgemäss rascher als bei den Versuchen mit den Lösungen A und B. -
Kommentar: Man beachte, dass I sich im Fall B innerhalb des pH-Bereiches von II im Fall C abspielt. Das unterschiedliche Ergebnis führt zur unaufweichlichen Schlussfolgerung, dass die nach II beobachtete Vernetzung nicht auf die Wirkung von intermediär gebildetem Chlorcyan zurückzuführen ist. Ausbeute und Aminfixierungsvermögen des nach II unter Verwendung von Lösung C erhaltenen Produktes bewegen sich in dem für das Verfahren II allgemein üblichen Rahmen.
2. Hinweis auf die Art der chemischen Reaktion, welche erfindungsgemäss zu vernetzten Polyhydroxylverbindungen mit Aminfixierungsvermögen führt
Ein weiterer von obigem Ergebnis unabhängiger Hinweis auf die Verschiedenartigkeit von I und II ergibt sich aus der Beobachtung, dass II sich so verhält, wie es dann zu erwarten wäre, wenn der erste Schritt in einer Veresterung von Hydroxylgruppen der Stärke mit hypochloriger Säure bestünde.
Lässt man nämlich eine Mischung von 20/oiger (Gew./ Gew.) Stärkelösung und 70/obiger (Gew./Gew.) Natriumhypochloritlösung mit dem Mischungsverhältnis 100 mg Stärke: 2 mMol NaOCl bei 0 bis 50 C unter kräftigem Rühren in eine gut gekühlte 10/obige Lösung von Natriumcyanid eintropfen, so erfolgt unabhängig vom stöchiometrischen Verhältnis zwischen ocr und C eine prompte Ausflockung von vernetzter Stärke mit hervorragendem Aminfixierungsvermögen.
Lässt man umgekehrt das Cyanid zur Mischung von Stärke und Hypochlorit zutropfen, so fällt kein Vernetzungsprodukt aus. Offensichtlich wird das Cyanid vom Hypochlorit abge fangen, bevor die Stärke in Reaktion treten kann. t Übergiesst man aber die Särke/Hypochlorit-Mischung auf einmal mit der stöchiometrischen Menge an Cyanid-Lösung, so erfolgt Flokkung von aminfixierungsaktivem Vernetzungsprodukt unter der auffälligen Voraussetzung, dass das Stärke-Hypochloritgemisch vor dem Cyanidzusatz zuerst während kurzer Zeit inkubiert wurde, z. B. während 5-15 Minuten bei 200 C. Ein Teil des Cyanids findet hierbei offenbar Gelegenheit, direkt mit einem vermutlich stärkegebundenen Anteil des Hypochlorits zu reagieren, z.
B. nach dem Schema: ROCl + CN 9 ROCN + cr
Dementsprechend kann man eine in Wasser gequollene, unlösliche Polyhydroxylverbindung (Trockengewicht 100 mg) wie beispielsweise Sephadex G 200 oder mercerisierte Cellulose (Avicel) mit Hypochlorit-Lösung (2 mMol NaOCl) während 15 bis 30 Minuten bei Raumtemperatur, gegebenenfalls unter Zusatz von Trockeneis, inkubieren, nach Zusatz von 100 ml Wasser von der Flüssigkeit abtrennen (Zentrifuge), den Rückstand in 100 ml Wasser aufnehmen, die Flüssigkeit abdekantieren (Zentrifuge), den Rückstand mit 10 ml 10/obiger Natriumcyanidlösung übergiessen und ihn anschliessend auf der Zentrifuge cyanidfrei waschen. Das Produkt besitzt ein Aminfixierungsvermögen, welches von der Dauer der Inkubation mit dem Hypochlorit abhängig ist.
Die unter den Beispielen beschriebene, ganz besonders milde und gleichmässig verlaufende Vernetzungsreaktion durch Einwirkung von t-Butylhypochlorit auf ein Gemisch von löslicher Stärke und Natriumcyanid wäre danach gegebenenfalls als Ergebnis einer primären Umesterungsreaktion zwischen dem organischen Hypochlorit und der Stärke aufzufassen.
PATENTANSPRUCH I
Verfahren zur Herstellung eines zur Fixierung von Aminoverbindung fähigen, aktivierten Trägers, dadurch gekennzeichnet, dass man Blausäure und/oder ein wasserlösliches Cyanid und ein Reagens, welches positives Chlor oder Brom enthält, nämlich hypochlorige oder hypobromige Säure und/oder ein wasserlösliches Salz der hypochlorigen oder hypobromigen Säure oder eine Chlor- oder Bromverbindung, welche bei der Hydrolyse eine der besagten Säuren liefert, oder eine Mischung solcher Halogenderivate auf eine wasserlösliche oder quellbare, wasserunlösliche Polyhydroxylverbindung in alkalischem Milieu einwirken lässt und die Reaktionsmischung a) im Falle einer Lösung durch Klärung und Dialyse oder Gelfiltration, b) im Falle einer Suspension durch Filtrieren oder Zentrifugieren und Auswaschen, von niedermolekularen Anteilen befreit.
UNTERANSPRÜCHE
1. Verfahren nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass man Blausäure und/oder Cyanid in einer Gesamtmenge zusetzt, welche pro Grammäquivalent organisch gebundenes Hydroxyl 0,25 bis 6 Grammäquivalenten Gesamtcyanid entspricht.
2. Verfahren nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass man die hypochlorige oder hypobromige Säure und/oder Salze und/oder die entsprechenden hydrolysierbaren Chlor- oder Bromverbindungen in einer Gesamtmenge zusetzt, welche pro Grammäquivalent organisch gebundenes Hydroxyl 0,25 bis 6 Grammäquivalenten positivem Chlor oder Brom entspricht.
3. Verfahren nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichhnet, dass man als Cyanid ein Alkalicyanid verwendet.
4. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Salz der hypochlorigen oder hypobromigen Säure ein Alkali-hypochlorit oder -hypobromit, vorzugsweise Natronbleichlauge oder Kalibleichlauge, oder Chlor oder Brom und ein Alkali-hydroxyd oder -carbonat oder -hydrogencarbonat verwendet.
5. Verfahren nach Unteranspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass man pro Grammol Chlor oder Brom mindestens 2 Grammole Alkalihydroxyd oder mindestens 1 Grammol Alkalicarbonat oder mindestens 2 Grammole Alkalihydrogencarbonat zusetzt.
6. Verfahren nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass man als zu hypochloriger oder hypobromiger Säure hydrolysierbare Verbindung einen Ester der besagten Säure, vorzugsweise ein Alkylhypochlorit mit 2 bis 5 Kohlenstoffatomen im Alkylrest, verwendet.
7. Verfahren nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass man als zu hypochloriger oder hypobromiger Säure hydrolysierbare Verbindung eine an das Stickstoffatom gebundenes, positives Chlor oder Brom enthaltende Stickstoffverbindung, beispielsweise das Natriumsalz des p Toluolsulfonsäure-chloramids (Chloramin T), N-Chloracetamid, N-Chlorsuccinimid, Chloramin, N-Bromacetamin oder N-Bromsuccinimid, verwendet.
8. Verfahren nach Patentanspruch I oder einem der Unteransprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass man Gesamtcyanid und Polyhydroxylverbindung vorlegt und die entstandene Mischung mit dem Reagens versetzt, welches positives Chlor oder Brom enthält.
9. Verfahren nach Patentanspruch I oder einem der Unteransprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass man das Reagens, welches positives Chlor oder Brom enthält, vorlegt und mit der Mischung von Gesamtcyanid und Polyhydroxylverbindung versetzt.
10. Verfahren nach Patentanspruch I oder einem der Unteransprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass man die Polyhydroxylverbindung zusammen mit dem Reagens, welches positives Chlor oder Brom enthält, vorlegt und die entstandene Mischung mit dem Gesamtcyanid versetzt.
11. Verfahren nach Patentanspruch I oder einem der Unteransprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass man das Gesamtcyanid vorlegt und mit der Mischung von Polyhydroxylverbindung und Reagens, welches positives Chlor oder Brom enthält, versetzt.
12. Verfahren nach Unteranspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass man die Mischung von Polyhydroxylverbindung und Salz der hypochlorigen oder hypobromigen Säure zuvor mit Kohlendioxyd behandelt.
13. Verfahren nach Unteranspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass man eine wasserunlösliche Polyhydroxylverbindung einsetzt, ihre Mischung mit dem Salz der hypochlorigen oder hypobromigen Säure gegebenenfalls mit Kohlendioxyd behandelt, die Mischung filtriert oder zentrifugiert, den unlöslichen Rückstand gegebenenfalls auswäscht, mit einer wässrigen Lösung eines Alkalicyanids versetzt und unverbrauchtes Cyanid durch Auswaschen entfernt.
14. Verfahren nach Patentanspruch I, dadurch gekenn
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The main patent relates to a process for the production of an activated carrier capable of fixing amino compounds, which is based on a crosslinking and activating treatment of hydroxyl-containing polymers by cyanide / hypochlorite; the crosslinked and activated polymer obtained can then be reacted with the amino compound to be fixed.
It has now been found that it is advantageous, but not necessary, to measure the amount of hypochlorite in accordance with the information in the main patent application. It has been proposed there to add enough hypochlorite until the test for unused hypochlorite in the reaction mixture is positive. From the corresponding description it can be seen that this test (blue coloration of potassium iodide starch paper due to the alkaline reaction solution) is positive if 1 gram atom of positive chlorine or 1 gram mole of sodium hypochlorite has been added per gram mole of sodium cyanide used.
If you work with less hypochlorite, the cyanide remains unchanged. This fact has no significant influence on the crosslinking and activation reaction if the amount of hypochlorite consumed per gram equivalent of organically bound hydroxyl is greater than t / 4 to
112 gramol.
If you work with more, e.g. B. 2 grams of hypochlorite per gram of sodium cyanide used, the degree of crosslinking and amine fixing capacity depend on the amount of cyanide used. Further factors are the hydroxyl density on the polyhydroxyl compound used and its molecular weight and reactivity.
As a rule, 0.2 to 2 gram moles of cyanide per gram equivalent of organic hydroxyl introduced is sufficient. Greater than double excesses of hypochlorite should be avoided, because otherwise the cyanate formed in a side reaction is no longer sufficient to protect the crosslinked and activated polymer from damage by hypochlorite; Cyanate reduces hypochlorite according to the equation: 2NCO + 3 ocr + ocr + --t H2O2HCO3 + 3Cr + N2 [Lister, Can. J. Chem. 33, 426140 (1955)]. The above quantities describe the practical working range, but represent neither an upper nor a lower limit.
The addition of hypochlorite to the polyhydroxyl compound can also take place before the addition of the cyanide.
The aqueous mixture of hypochlorite and polyhydroxyl compound is expediently allowed to drip into the aqueous cyanide solution at about 0 ° C. with stirring and good cooling. As described below, under certain conditions, the cyanide solution can also be added all at once to the mixture of hypochlorite and polyhydroxyl compound. In the latter case, the considerable heat development requires particularly effective cooling. Hypochlorite and polyhydroxyl compound appear to interact, as will be described in more detail below, in that some of the hydroxyl groups are esterified by hypochlorous acid.
This reaction can, if appropriate, be promoted by introducing CO2 or introducing dry ice. When processing mixtures of hypochlorite and polyhydroxyl compounds pretreated in this way, it may be necessary to ensure that the alkalinity of the cyanide solution is sufficient to compensate for the loss of alkalinity in the hypochlorite solution caused by CO2.
Instead of hypochlorite, a mixture of alkali lye or alkali carbonate solution and gaseous chlorine can now be used, the alkali being initially introduced with the polyhydroxyl compound and the cyanide or being added gradually to the reaction mixture only while the chlorine is being fed in. Here, too, the sequence can be reversed by adding chlorine first to the hydroxyl compound and the alkali and only then adding the cyanide.
With regard to the stoichiometry, the same applies as when using hypochlorite. As with the preparation of hypochlorite solution, a small excess of alkali is recommended with respect to chlorine.
It was further rounded off that the alkali hypochlorite in the process according to the invention can generally be replaced by compounds which form hypochlorous acid on hydrolysis. These include [Houben-Weyl 5/3 (1962), page 760] the esters of hypochlorous acid and nitrogen compounds whose chlorine is bound to nitrogen, such as. B.
Chlorimides, chloramides, chlorimines and chloramines. Ethyl, propyl and tert-butyl hypochlorite (Houben-Weyl 5/3, and 6/3, 491, 492), N-chloro-succinimide (Houben-Weyl 5/3, 800), N-chloroacetamide ( Houben-Weyl 5/3, 799), chloramine T and dichloramine T (Houben-Weyl 5/3, 808) and chloramine (Houben-Weyl 5/3, 796).
A statement according to which chloramine with potassium cyanide is to be converted into cyanogen chloride (Beilstein 3 E II, 32) has proven to be inaccurate: no cyanogen chloride is produced, but considerable amounts of potassium cyanate [Markwald and Wille, Ber. German chem. Ges. 56, 1325 (1923) 1.
As well as N-chlorine compounds, analogous bromine compounds such. B. N-bromosuccinimide or N-bromoacetamide proved to be useful with the greatest success. Therefore, the use of the corresponding N-bromine compounds and, last but not least, the use of the alkali hypobromites and the hypobromous acid itself are included in the new process.
The choice of the N-halogenated compound with a basic nitrogen function is expediently restricted to products which release either ammonia or a tertiary amine when the halogen is released, either directly or after moderate hydrolysis. Examples are chloramine (NH2Cl) and pyridinium bromide perbromide [Bull. Soc. Chim. France 1952, 331). Experience has shown that ammonia leaves the anain-fixing groups intact because its action is probably limited to an exchange reaction; tertiary bases are not fixed due to the lack of substitutable hydrogen. The lower aliphatic alcohols from the hypochlorites usually only compete insignificantly with the polyhydroxyl compounds in the O-cyanation.
Crosslinking and activation require an alkaline reaction medium, preferably in the range from about pH 10 to about pH 13. It occurs automatically if, for example, one of the solutions of sodium hypochlorite (sodium hypochlorite) or chloramine or one of the solutions described below is added to the aqueous mixture of polyhydroxyl compound and sodium cyanide Chloramine T or t-butyl hypochlorite added in substance.
This also applies if you first prepare an aqueous mixture of polyhydroxyl compound and one of the halogen carriers just mentioned and add the mixture to the aqueous solution of sodium cyanide. In other cases, where the initially introduced or the component to be entered in the reaction mixture is too alkaline, too little alkaline or is even acidic, and the other component has insufficient buffering capacity to ensure the desired pH in the mixture of components, one or both components are added to the required amount of strong or weak acid, strong or weak base or a buffer salt, such as hydrochloric acid or carbon dioxide, alkali hydroxide or ammonia, alkali carbonate or alkali hydrogen carbonate or ammonium chloride.
One example is given when using chlorinated water as the source of positive chlorine, another when using hydrogen cyanide as the source of cyanide. Appropriate buffering measures will of course also be taken if both components are too alkaline, too little alkaline or acidic.
A component of the reaction mixture is generally understood to mean the mixture of the polyhydroxyl compound with cyanide and / or hydrocyanic acid or the mixture of the polyhydroxyl compound with the reagent which contains positive halogen. The other, supplementary component is then the agent still required for the reaction according to the invention, namely the reagent which contains positive chlorine or bromine, or cyanide and / or hydrocyanic acid.
Each of the components defined in this way can either be presented for the purpose of implementation, in order then to be crosslinked with the missing counter component, or vice versa.
Note that at the lower limit of the specified pH range, hydrogen cyanide as well as hypochlorous and hypobromous acid are incompletely neutralized.
According to the above, it may therefore be advantageous to wholly or partially neutralize hypochlorous or hypobromous acid which is formed by the hydrolytic decomposition of organic hypochlorites or nitrogen compounds which contain positive chlorine or bromine. If the nitrogen compound in question itself has a basic character, neutralization loses its significance. The alkalizing function of alkali hydroxides and carbonates can also be taken over by excess alkali cyanide. If the N-halogen compound is already salt-like, such as the chloramine T of the formula CH3C6H4 SO2NNaCl, the neutralization of the hypohalous acid is ensured and additional alkali is more harmful.
Crosslinking and activation of the polyhydroxyl compound take place in the temperature range between the solidification point of the solution and about 500 C; it is advisable to work between 0 and room temperature.
For the sake of better comparability, the following examples relate, with a few exceptions, to commercially available soluble starch as the starting material. The new method can be applied just as well as that according to the main patent application to dextrins, dextrans, crosslinked dextrans, starch paste, cellulose, especially mercerized cellulose, cellulose fibers, agarose and the like.
The degree of polymerization of the polyhydroxyl compounds which can be used as starting material from the carbohydrates is arbitrary within the framework of the solubility or swellability of these compounds. Even sucrose according to the invention gives an insoluble product with very good enzyme-fixing capacity. However, one is not dependent on carbohydrates. Water-soluble polyvinyl alcohols are for example in the cyanide / hypochlorite system, crosslinked to form insoluble hydrophilic products with a satisfactory amine fixing capacity.
The amine-fixing properties of polymers which are produced in the manner described here are within the framework that has already been described in the main patent. The amine is fixed experimentally as described there. The properties of the fixed amino compounds, in particular the properties of fixed biologically active peptides and proteins, are also within the scope of the relevant information in the literature and patent literature.
The new process and the use of the process products enable the production of reaction products of an optionally biologically active, water-soluble amino compound that can be substituted on at least one basic nitrogen atom and an activated carrier.
The method is characterized in that hydrogen cyanide and / or a water-soluble cyanide and a reagent which contains positive chlorine or bromine, namely hypochlorous or hypobromous acid and / or a water-soluble salt of hypochlorous or hypobromous acid or a chlorine or bromine compound, which in the hydrolysis one of said acids provides, or a mixture of such halogen derivatives on a water-soluble or swellable, water-insoluble polyhydroxyl compound in an alkaline medium, preferably in the cold, and the reaction mixture a) in the case of a solution by clarification and dialysis or gel filtration, b) in the case a suspension by filtration or centrifugation and washing, freed from low molecular weight components.
The use of the activated carrier prepared in this way for fixing amino compounds is characterized in that said activated carrier is allowed to act in the presence of water on a water-soluble amino compound which can be substituted on at least one basic nitrogen atom.
In the use according to the invention, the crosslinking and activation product present in the solution or suspension or remaining as filter or centrifuge residue can advantageously be used in the presence of water and, if appropriate, a buffer system. at a temperature below 500 C, preferably in the cold, on an optionally biologically active, water-soluble amino compound that can be substituted on at least one basic nitrogen atom and dialyze or filter or wash out dialyzable material or material remaining in dissolved form with water or an aqueous salt solution from the reaction product .
It is unclear what chemical reactions the crosslinking of the polyhydroxyl compounds is based on and what the activity, i. H. the ability of the crosslinked product to fix amino compounds. The hypothesis of an intermediate formation of cyanogen chloride was already described as unlikely in the main patent application. In the meantime, it has been experimentally ruled out that under comparable conditions cyanide / hypochlorite reacted significantly differently than cyanogen chloride.
It is known that - chlorine below pH 9 from alkali cyanide, cyanogen chloride, - cyanogen chloride is converted into alkali cyanate by alkali lye, and - during the hypochlorite oxidation of alkali cyanide to alkali cyanate, an odor reminiscent of cyanogen chloride arises.
In the literature, therefore, the view is taken - albeit not uncontested - that the practically momentary cyanate formation in the hypochlorite oxidation of cyanide proceeds via cyanogen chloride.
Nevertheless, the inventive hypollalogenite / cyanide treatment of polyhydroxyl compounds (hereinafter referred to as II) does not represent a variant of the known alkali / cyanogen treatment of polyhydroxyl compounds (hereinafter referred to as I). This can be demonstrated particularly easily and impressively if I and II water-soluble polyhydroxyl compounds, e.g. B. water-soluble starch can be used. The soluble starch becomes insoluble under suitable conditions both after 1 and after II due to crosslinking.
The crosslinking products precipitate in flaky form, are easy to isolate and have the well-known amine-fixing capacity of products such as those obtained, for example, according to Swiss Patent No. 501 695 by cyanogen halide activation of crosslinked dextran (Sephadex) or cellulose.
The cross-linking of the starch and the apparently simultaneous introduction of the amine fixing capacity can be formulated schematically as follows according to the ideas discussed today: Scheme
EMI3.1
soluble unstable insoluble starch intermediate product crosslinking product with amine fixing ability
The crosslinking reaction (stage b) would then be identical for I and II, i.e. it would have the same pH dependency. The O-cyanation (stage a) in I is linked to the presence of deprotonated hydroxyl groups of the starch and is subject to competition from hydroxyl ions from the alkaline medium (formation of alkali metal cyanate as a by-product). In the case of II, the situation would have to be the same if the first step in the course of II actually takes place in an instantaneous [cf. Gmelin's Handbook of Inorganic Chemistry, 8.
Aufl., C (D 1) 14, pages 35 and 37 (1971) 3 formation of cyanogen halide would exist; above all, under comparable conditions, I would always have to be at least as fast as II.If, on the other hand, the hypothesis is dropped that II runs through cyanogen halide, then with II, where stage a for the overall reaction (separation of an insoluble crosslinking product) becomes rate-determining, a pH dependence possible, which is different from that of I. Exactly this is found experimentally, as is described in more detail in the appendix.
The following examples of the crosslinking and activation reaction and of the amine fixation are not intended to restrict the scope of the invention in any way. The temperature is given in C everywhere.
Experimental part
I. The crosslinking and activation reaction
Reagents:
Soda bleach. The preparations used were those which are obtained when 80 g of NaOH, 375 g of water and 375 g of ice are treated with gaseous chlorine at below 0 ° C. with vigorous stirring up to a weight increase of 66 g (5 hours). Such freshly prepared solutions contain about 7.5 percent by weight sodium hypochlorite (iodometric analysis); the pH is around 11.5.
Sodium cyanide. Merchandise of quality pract. when titrated with sodium hypochlorite, showed a content of almost 100%.
Polyhydroxyl compounds: water-soluble starch, potato starch, water-soluble polyvinyl alcohol, sugar (sucrose), cellulose powder Avicel (mercerized), powdered fiber cellulose MN 300 (Macherey and Nagel), cotton yarn (mercerized), viscose silk (mercerized) were commercial preparations.
Test arrangement:
See the individual examples below.
Processing:
Soluble crosslinking products were pre-purified by filtering or centrifuging (clarification) their solution and freed from low molecular weight substances by dialysis or gel filtration. Insoluble crosslinking products were generally obtained in flaky form, were generally easily filterable and were then freed from alkali and other soluble substances as immediately as possible by filtration and washing with water. If not immediately used for amine fixation, they were preferably stored in the cold. The amine fixing capacity is, however, remarkably stable.
Leaving it to stand for several days in a moist state at room temperature proved to be permissible in very many cases.
Examples 1. Water soluble starch / hypochlorite or hypochlorous acid
2 g of water-soluble starch are suspended in 100 ml of water, heated on the water bath until dissolved and allowed to cool. 5 ml of this starch solution (100 mg starch, corresponding to about 2 mVal-OH) are mixed with 100 mg (2 mmol) sodium cyanide each, diluted with water to 10.25 or 50 mol, and cooled to 5 or 0 or 100 ° C and, with good cooling, added dropwise bleaching liquor corresponding to an amount of 1/2 or 1 or 2 or 4 mmol of sodium hypochlorite. Flocculation begins after the addition of 0.5 to 1 mmol of sodium hypochlorite, largely independent of the temperature and volume of the reaction mixture. The dry weight of the precipitates is around 100 mg.
The same test series with only 50 mg (1 mmol) sodium cyanide gives roughly the same result.
If these tests are carried out in such a way that the entire amount of hypochlorite is added to the starch / cyanide mixture at once, flocculation only takes place with certainty if the cyanide was present in excess. In the case of insufficient cyanide, the reaction appears to be essentially limited to the oxidation of the cyanide.
This latter impression is confirmed when the hypochlorite is presented and the starch / cyanide mixture is added. If this is added dropwise, there is no product flocculation, even if there is an excess of cyanide. If, on the other hand, it occurs all at once, then product flocculation can be observed in the case of excess cyanide. Compare the discussion of the reaction mechanism in the appendix.
The pH of the above reaction solutions is around 12. If the starch / cyanide mixture is diluted with 0.1 N sodium hydroxide solution instead of water, there is no product flocculation. A pH of 13 is roughly the upper limit. If 100 mg of starch and 100 mg of sodium cyanide are placed in 15 ml of water (pH 11.2) and then added within 5 minutes at 0-50 ° C. with 2 mmol of sodium hypochlorite and 2 mmol Sodium hydrogen carbonate in 10 ml of water (pH 10.8) or with the reaction product of 2 mmol of sodium hypochlorite and 1 g of solid COl in 10 ml of water (pH 7.8), flocculation takes place both times before the addition is complete; the pH values after the addition is complete are 11.0 and 10.6.
If, on the other hand, 2 mmol HCl and 2.5 mmol K2CO3 (total volume 15 ml, pH 10.0) are added to the same starch / cyanide mixture, the above solution of hypochlorous acid with a pH of 7.8 no longer causes flocculation in every case . The final pH of such reaction mixtures is around 10.0. No flocculation takes place if the starch / cyanide mixture has a pH of 9.8 due to the addition of 2 mmol HCl and 0.1 mmol K2COs or a pH of approx. 7 due to the addition of 2 mmol HCl and the pH after reaction with the solution of the hypochlorous acid with a pH of 7.8 is 9.6 or 7.5. It follows for the lower. The pH limit is about 10. The alkalinity of the starch / cyanide mixture can optionally also be buffered by adding ammonium chloride.
2. Water-soluble starch / chlorine and sodium hydroxide solution or potassium carbonate
100 mg (2 mmol) of sodium cyanide, 2 ml or more of a 1 m solution of potassium carbonate (at least 2 mmol) and 8 ml of water are added to 5 ml of starch solution (100 mg of starch), the mixture is cooled to 0 C, 10 g of ice are added and the mixture is passed chlorine gas (2 mmol) with good cooling until the reaction mixture responds positively to potassium iodide / starch paper.
The product turns out flaky. This is also the case when 5 ml of starch solution, 2 ml of 2N sodium hydroxide solution, 3 ml of water and 10 g of ice are treated with chlorine (approx. 2 mmol) while cooling until the pH is between 9.5 and 10 , and then doused once with a solution of at least 100 mg sodium cyanide in 5 ml water. Note that in this embodiment, an excess of cyanide is required.
3. Starch deister / bromine and caustic soda or
Potassium hydrogen carbonate
300 mg of starch is heated in 35 ml of water to 700 ° C., allowed to cool, centrifuged for 5 minutes at 3000 revolutions per minute, the supernatant is decanted off, and 2 ml of 2N sodium hydroxide solution are added to the residue, which has a dry weight of about 100 mg and 0.5 ml of a solution of 110 mg (2.2 mmol) of sodium cyanide in 5 ml of water, cools to 0-50 C and now simultaneously, but separately, the remaining cyanide solution and 320 mg of bromine (2 mmol) under vigorous Stir in drops so that the potassium iodide / starch paper does not contain excess bromine or
Hyprobromite can be detected. An easily filterable crosslinking product flocculates. The result is roughly the same when using twice the amount of caustic soda, cyanide and bromine, but worse when using half the amount each.
You can also add 110 mg of sodium cyanide (2.2 mmol), at least 4 ml of a 1 M solution of potassium hydrogen carbonate and then dropwise with cooling with 320 mg of bromine (2 mmol) to the starch paste, whereupon the paste changes due to crosslinking becomes filterable.
In a third variant, 320 mg of bromine are added to the starch paste, at least 4 ml of 1 m potassium hydrogen carbonate solution is added dropwise with thorough stirring and cooling, left to stand for 15 minutes and a solution of 140 mg of sodium cyanide (2, 8 mmol) in 5 ml of water, stirring intensely.
4. Water soluble starch / chloramine T
100 mg (2 mmol) of sodium cyanide in 20 ml of water are added to 5 ml of starch solution (100 mg of starch) and a solution of 562 mg (2 mmol) of trihydrate of chloramine T in 2 ml of dioxane is added dropwise within 11 minutes at 50 ° C. with thorough stirring to. The product flocculation takes place before the end of the chloramine addition. One can work at 200 C and / or use an aqueous solution of chloramine T with the same success.
5. Water soluble starch / N-bromosuccinimide
100 mg (2 mmol) of sodium cyanide in 15 ml of water and 1 ml of 2N sodium hydroxide solution are added to 5 ml of starch solution (100 ml of starch) and a solution of 360 mg of bromosuccinimide in 2 ml of dioxane is added dropwise at 200 ° C. while stirring. Duration approx. 15 minutes. The conversion becomes visible after about 7 minutes through the formation of a cloudiness.
Instead of N-bromosuccinimide, N-bromoacetamide or N-chlorosuccinimide can also be used.
6. Water soluble starch / chloramine
A mixture of 1N ammonia and ice is mixed with sodium bleaching liquor (1 mole of sodium hypochlorite per mole of ammonia), the mixture is distilled in vacuo (Kpeo = 350 ° C.) and the aqueous chloramine solution is condensed in a well-cooled receiver. The content is determined iodometrically.
100 mg (2 mmol) of sodium cyanide in 10 ml of water are added to 5 ml of starch solution (100 mg) of starch, the mixture is cooled to 2-40 ° C. and 10 ml of chloramine solution (2 mmol) are added dropwise with thorough stirring and cooling. A very easily filterable crosslinking product precipitates out, dry weight approx. 100 mg. Some ammonia in the chloramine solution is harmless.
7. Water soluble starch / t-butyl hypochlorite
Only 5 ml of starch solution (100 mg of starch) and 100 mg of sodium cyanide (2 mmol) in 20 ml of water (pH 11.1) are added dropwise at 50 ° C. with good stirring, 217 mg (2 mmol) of freshly prepared but undistilled t-butyl hypochlorite . Even before the yellow ester droplets have completely disappeared, the reaction begins (opalescence), and a few seconds later the crosslinked reaction product flocculates (pH I 10.8). The result is similar if 1 or 2 ml of a 1 m solution of potash is added to the starch / cyanide mixture beforehand.
The esters of hypochlorous acid with ethanol, propanol or tert are used with equal success. Amyl alcohol.
8. Water-soluble products with amine fixing ability
By using higher dilutions (50 ml, 100 ml or more per 100 mg of water-soluble starch), following the procedures described under 1-2) and W7) in the prescribed pH range, especially with vigorous stirring, you get to ratios where there is no more flocculation occurs, but an amine fixation capacity can nonetheless be demonstrated in the dissolved substance, in particular with regard to low molecular weight, dialyzable amino compounds. - The same qualitative effect is achieved by reducing the amount of cyanide or cyanide that limits the crosslinking.
Hypochlorite to about 0.25 eq per eq organic hydroxyl.
9. Sucrose / hypochlorite
100 mg of sucrose (sugar) are dissolved in 10 ml of water (2.34 milligram equivalents of organic hydroxyl), 100 mg of sodium cyanide (2 mmol) are added, the mixture is cooled to 5-100 ° C. and, with vigorous stirring, 2 mmol of sodium hypochlorite in the form of sodium bleaching liquor are added . A flaky crosslinking product precipitates after only half the amount of hypochlorite has been added. When the addition of hypochlorite is complete, it is filtered off and washed thoroughly. Its amine fixation capacity is perfect; the dry weight is around 100 mg. It is noteworthy that this compound liquefies after a few hours on standing in an alkaline reaction medium. A product which is obtained from 100 mg of sucrose, 10 ml of water and 106 (1 mmol) or 212 (2 mmol) of cyanogen bromide and 1 or 2 ml of 1N NaOH has the same property.
These sucrose derivatives are new.
Other non-reducing oligosaccharides, e.g. B. the trisaccaride raffinose and the tetrasaccharide stachyose. Their crosslinking products are also new compounds.
10. Polyvinyl alcohol / hypochlorite
100 mg of polyvinyl alcohol (2.3 milligram equivalents of organic hydroxyl) are dissolved in 10 ml of boiling water, 100 mg (2 mmol) of sodium cyanide are added to the cooled solution and then 2 mmol of sodium hypochlorite in the form of sodium bleaching liquor are added at 0-50 ° C. with stirring. The crosslinking product precipitates in coarse, somewhat greasy flakes, but can nonetheless be filtered off and washed out. The product is stable in contact with water like the products from Examples 1 to 9, but, like the sucrose derivative, liquefies when standing in an alkaline reaction medium.
11. Cotton yarn / hypochlorite or hypochlorous acid
500 mg of raw cotton yarn are boiled with water and washed twice with alcohol, twice with carbon tetrachloride and twice with ether and dried in the air to remove them. The yarn is then left to stand overnight in sodium hydroxide solution with exclusion of air, washed well, treated with 500 mg of sodium cyanide in 10 ml of water and then, at 0-50 ° C., dropwise with 10 mmol of sodium hypochlorite in the form of sodium bleach. It is washed out thoroughly and the amine binding capacity is determined by carrying out several successive activity tests after the enzyme has been fixed, with thorough washing between each test.
This precautionary measure is necessary because unspecific enzyme fixation has also been observed on mercerized fibers and because the acid sensitivity of the enzyme preparation precludes the otherwise usual washing process with a weakly acidic buffer.
One variant consists in treating the washed and mercerized yarn with the above-specified amount of sodium bleaching liquor and excess solid CO, decanting off the liquid and adding the yarn to the aqueous solution of 500 mg sodium cyanide. After standing for 5 to 10 minutes, the solution is poured off and the yarn is washed out with water.
In a third variant, the washed and mercerized yarn (500 mg) is incubated overnight with 3 g of sodium cyanide in as little water as possible and, after dilution with 25 ml of water, 60 mmol of sodium hypochlorite are added with strong cooling, with vigorous stirring being necessary.
12. Viscose yarn / hypochlorite
250 mg of viscose yarn are suspended in 2N sodium hydroxide solution, poured off after 1 hour, washed with water, poured over with a solution of 500 mg of sodium cyanide in 5 ml of water, incubated for 30 minutes, cooled to 50 ° C. and added within 30 minutes with 10 mmol of sodium hypochlorite in the form of 7% sodium bleaching liquor, with vigorous stirring, and washed thoroughly with water.
13) Instead of the water-soluble starch, according to 1-2 and W8, dextrins or mixtures of distrins and water-soluble starch or mixtures of water-soluble starch and polyvinyl alcohol can be used. Likewise, caustic soda can be replaced by an equivalent amount of caustic potash and sodium cyanide can be replaced by potassium cyanide; the bleach liquors used were titrated in each case.
14) Working temperatures of 25 to 500 C are used in order to avoid gelling of the starting material and the product when using more concentrated solutions. One example is the application of the process to the cross-linking and activation of pectins and slimy substances, the water-solubility of which is retained with moderate cross-linking.
15. Potato starch / hypochlorite
10 g of potato starch for food are suspended in 1 liter of water, heated for one hour at 600 ° C. with gentle stirring, centrifuged, the excess is poured off, the residue, which has a volume of approximately 450 ml, is mixed with 14.7 g (0 , 3 mol) sodium cyanide, stir, cool to 100 ° C. and allow 130 ml (9.25 mol hypochlorite) sodium bleach to run in within 30 minutes. The pH increases from 11 to 12.5. It is filtered on a glass frit and washed with 1.5 l of ice water. The product is used immediately or stored in a frozen or lyophilized state.
In variant A, 10 g of starch of the same quality are suspended in 500 ml of water, heated to 600 ° C. for 30 minutes, allowed to cool, 24.5 g (0.5 mol) of sodium cyanide are added, cooled to 50 ° C. and mixed at the same time with stirring 200 ml (0.38 mol hypochlorite) sodium bleach, 2N hydrochloric acid such that the pH value in the reaction mixture remains in the range from 11 to 11.5. The operation takes 30 to 40 minutes.
In variant B, 19.5 g of sodium cyanide (0.4 mol) are added to the gel according to variant A. Chlorine is then passed in at 50 ° C. with stirring and the pH is kept at 11 to 11.5 by the simultaneous addition of 2N sodium hydroxide solution. The operation is stopped after adding 200 ml of lye (0.8 mol).
In variant C, 2.45 g of sodium cyanide (0.05 mol) are dissolved in the starch gel according to variant A. The mixture is cooled to 50 ° C. and slowly (in bubbles) chlorine is introduced with stirring, the pH being kept at approximately 11 by continuously adding a solution of 22 g (0.45 mol) of sodium cyanide in 300 ml of 2N sodium hydroxide solution. The amount of chlorine introduced corresponds to approximately 0.3 mol of sodium hypochlorite.
In a variant D, 20 g of potato starch of the same quality are suspended in 800 ml of water at 30 to 400 ° C., heated to 600 ° C. for 30 minutes, the transparent gelatinous mass is cooled to 50 ° C., 25 ml of a solution of 25.5 g (0 , 52 mol) of sodium cyanide in water (total volume 245 ml), stir slowly and enter at the same time for about an hour: 220 ml (0.44 mol of sodium hypochlorite) sodium bleach, and the remaining 220 ml of the above solution of sodium cyanide.
After the reaction has ended, the pH is between 13 and 14. The mixture is filtered at 150 ° C. and washed with water to remove chlorine (2 liters) and a filter cake of 157 g is obtained. Its dry weight is 22.6 g, the nitrogen content 6.4%, based on the dry weight.
In a variant E one proceeds exactly as in variant D, but works with a solution of 49 g (1 mol) sodium cyanide (total volume 245 ml). The result is practically identical to the result of variant D (weight of the filter cake, dry weight, nitrogen content) with the exception of the fact that the filtrate and wash water in this case contain 0.54 mol of unchanged cyanide. The cyanide consumption corresponds to the amount of hypochlorite used.
In a completely identical parallel experiment, it was continuously checked how a small sample of the reaction mixture behaved in an acetic acid medium against potassium iodide starch paper. A blue color occurred regularly when the molar ratio of added cyanide exceeded 0.46. In an alkaline environment, the blue coloration does not appear until the said ratio exceeds 1. The meaning of this difference remains unclear for the time being. The blue coloration in an acetic acid medium is possibly an indication of an intermediate product, which disappears again when the molar ratio falls below 0.46. It cannot be cyanogen chloride because cyanogen chloride does not color the I (aluminum iodide starch reagent.
Neither is it a question of unused hypochlorite, because this stains the reagent even in an alkaline medium.
A sample of the lyophilized product absorbed in potassium bromide between 3200 and 3600 cm - 1 (OH band) somewhat weaker than the starch used as the starting material, furthermore weakly but clearly at 2150 cm - 1 (assignment uncertain: cyanate?, C = NH? ) and strong at 1720 cm-1 (, C = N band).
16. Comment on starch quality
Not every industrial starch is suitable as such for the inventive crosslinking and activation for the purpose of amine fixation. It is in fact not surprising that the starting material on the one hand and the extraction and digestion method on the other hand influence the accessibility and reactivity of the hydroxyl groups involved according to the invention. The conditions here are therefore similar to those for cellulose powder and cellulose fibers.
II. The amine fixation reaction
Representative examples offer - the fixation of an acylase, which is offered by the company Ama no Pharmaceutical Co. Ltd., Nagoya (Japan) for industrial resolution of N-acetylated a-amino acids, - the fixation of crystallized chymotrypsin, and - the Fixation of valine and glutamic acid.
In extensive preliminary tests with the acylase mentioned, it has been found that it is advantageous to store the activated products at 4 or -150 C .; Loss of activity at room temperature within 48 hours in a moist state, however, is insignificant. In the lyophilized state, the storage temperature does not play a major role. They are fixed in water or 0.1 n hydrogen carbonate solution with the addition of 10-4 m I (obalt chloride solution somewhat more effective than in 0.1 n hydrogen carbonate solution. If the ionic strength is increased by adding sodium chloride (0.1 n or 0 , 5-n), the fixation increases somewhat.
The dilution is of greater importance: in mixtures of 1 g each of lyophilized active carrier and 0.1 g of acylase in 5, 20 or 50 ml of water, the fixation was 84, 79 and 68 o / o of the activity used. The ratio of carrier to enzyme also plays an important role:
10 g of moist carrier each were incubated with 0.02, 0.05, 0.1 and 0.2 g of enzyme in 10 ml of 0.1 N hydrogen carbonate solution and 10-4 M cobalt chloride solution for 72 hours at 40 ° C. After washing with one liter of the same buffer each, the activity determination in the filtrate showed a fixation of 100, 100, 77.3 and 83.5%.
The fixation is relatively slow:
5 g of moist carrier, 0.1 g of acylase and 5 ml of water were incubated at 40 ° C. for 1, 2, 12 and 24 hours.
After filtration and washing, 46, 47, 39, 27 and 13 o / o of the activity used were found in the filtrate.
The method already proposed in the main application of stirring the lyophilized or otherwise dehydrated enzyme into the moist filter cake obtained during the filtration of the activated carrier appears to be most effective, it being possible to suspend the filter cake beforehand in buffer, the excess buffer to be removed by filtration and to use the now buffered filter cake.
17. Acylase, fixation test
The moist filter cakes each from 100 mg of water-soluble starch from Examples 1, 2, 4, 5, 6 and 7, from 100 mg of sucrose from Example 9 and from 100 mg of polyvinyl alcohol according to Example 10 with 25 mg of an enzyme preparation obtained by dialyzing the Amano-acylase and lyophilization of the non-dialyzable portion was obtained, left to stand overnight in the cold, washed out with 200 ml of the above-mentioned hydrogen carbonate / cobalt chloride buffer and treated with a standard solution of the sodium salt of acetyl-DL-phenylalanine to test the activity.
Pretreatment of the filter cake with the buffer mixture turned out to be superfluous in most cases.
The filter cake according to Example 3 and the fibers according to Examples 11 and 12 are treated in a corresponding manner.
18. Acylase, application test
A filter cake obtained according to variant D, from 10 g of potato starch, is suspended in 300 ml of sodium hydrogen carbonate / lobalt chloride (0.1-n and 10-4-m), slowly stirred for 30 minutes at room temperature, filtered and 3 g of acylase in the filter cake. It is left to stand in the cold overnight, washed very carefully with 2 liters of water and incubated with 24 g of acetyl-DL-phenylalanine sodium in 300 ml of 10-4-m cobalt chloride with slow stirring at 400 ° C. in the presence of a little thymol, filtered after 48 hours and starts a second degradation cycle, as described in the main application. L-phenylalanine is also isolated as described.
In one case, 60 such degradation cycles were carried out, with an interruption of one month, during which the enzyme preparation was stored at 0 ° C. in the presence of a substrate solution. In another case, 130 cycles were performed before a loss of activity required the series to be terminated.
19. Chymotrypsin
A mixture of 25 mg of chymotrypsin and 25 mg of sodium sulfate is dissolved in 2 ml of water, lyophilized and the residue is triturated with the addition of 2 ml of 0.1 N sodium hydrogen carbonate solution with a filter cake containing 200 mg of soluble starch obtained according to Example 1 at 0 to 50 C. , 200 mg sodium cyanide, 20 ml water and 4 mmol sodium hypochlorite (bleach), leave to stand for 30 hours at room temperature, wash thoroughly with 1.5 liters of water and lyophilize the residue: dry weight approx. 220 mg with a water content of 11.5 o / o (Karl Fischer titration). A sample was hydrolyzed for 36 hours at 1100 ° C. in 20% hydrochloric acid, and the hydrolyzate was analyzed for amino acids according to Stein and Moor.
The expected amino acids were found in the expected quantitative ratio; their total amount corresponded to a fixation of 16.5 mg chymotrypsin.
20. Valine on a soluble carrier
Add 1 o / o of the weight of the solution valine to the dialyzed solutions according to Example 8 and Example 14, buffer with a little hydrogen carbonate to pH 9, leave to stand overnight at 0 C, dialyze at 0 C until the sodium ions are completely removed and lyophilized . Valine is found in the hydrolyzate of the lyophilized products.
21. Glutamic acid on an insoluble carrier
Each filter cake prepared according to the main instructions in Example 15 was treated in various dilutions at various temperatures for various times with 8 g of glutamic acid (54 mmol) and 5.6 g of sodium carbonate (54 mmol). The loading achieved increases in the concentration range from 0.01 to 0.1 g glutamic acid per ml by a factor of 6.5, from 0 to 200 ° C. by a factor of 1.3, from 20 to 400 ° C. by a factor of 1.16 , and from 2.5 to 5 hours by a factor of 1.17, from 5 to 50 hours again by the same factor. At constant volume, it increases by three and a half times when the amount of glutamic acid is fivefold.
On dilution with 20 ml of water, room temperature and a reaction time of 15 hours, an average of 10 mmol of glutamic acid was fixed (determination acidimetrically and by amino acid analysis according to Stein and Moore). The fixed glutamic acid consumes 1 mole of alkali per mole; its titration curve (pK 9.5) is reminiscent of that of monosodium glutamate in the presence of a great deal of formaldehyde (pK 9.75).
III. Analytical detection of fixed enzyme activity
22. Fixed acylase
A filter cake or an amount of fiber, which corresponds to 100 mg of the originally used polyhydroxyl compound, is taken up in 4 ml of 10-4 M cobalt chloride solution, heated to 400 C and mixed with 4 ml of a solution heated to 400 C, which contains DL-acetylphenylalanine (4.5 10 10-3-m), sodium hydrogen carbonate (6.6 10-10-3-m) and cobalt chloride (10-4-m). It is incubated for 30 minutes at 400 ° C. with stirring, filtered and 5 μl of the filtrate is applied to a thin layer of silica gel, and next to it 5 μl of comparison solutions which contain just enough phenylalanine that spots appear on the chromatogram which indicate an enzymatic degradation of 5 , 10, 20 and 40 0/0.
The eluent is chloroform / methanol / glacial acetic acid / pyridine (70 / 25/5/5). The extent of the enzymatic degradation estimated in this way was between 5 and 40% in all the embodiments described in the examples.
23. Fixed chymotrypsin
The solution of 20 mg of acetyl-L-tyrosine ethyl ester in 3 ml of ethanol is added to 9 ml of 0.1 N phosphate buffer (pH 7.8), the enzyme preparation is added, the pH stat is connected and the reaction is monitored through consumption of 0.2 N sodium hydroxide solution at 27-280 ° C. The activity of the preparation from 19 was about half as great as the fixed amount of chymotrypsin would lead to expect.
attachment
1. Experimental comparison of pathways I and II
The reaction paths I and II according to the above scheme are up for discussion.
In the course of I, because of the reaction:
XCN + bROH + (1- <3) HOH BROCN + (1-
HOCN + HX release a certain amount of acid. In the course of II, however, regardless of the mechanism, because of the reaction:
NaOCl + NaCN + aROH + (1-6) HOH o BROWN + (1-6) NaOCN + 6NaOH + NaCl releases a certain amount of alkali hydroxide. In addition, hypochlorite contains some free alkali.
In the present case, acid and alkali can be absorbed by the presence of a strong carbonate buffer so that the pH shifts are within the range of only 0.3-0.4 pH units. A pH regulation by means of pH stat had to be disregarded because of the high reaction rates.
The high salt concentration caused by the buffer slows I as well as II. The lowering of the reaction temperature from 20 to 0 C also has an effect. By accumulating these effects, I and II can be easily compared. The following comparative tests are typical with regard to reaction conditions and results:
:
A stock solution of 5 ml of the above starch solution (w / w), 10 ml of 2-m K2CO3 is mixed with either 10 ml of water, 1.17 g of NaCl (20 mmol), 5 ml of 1-m KHCO3, 138 mg of NaCl (2.34 mmol), and thus receives solution A, pH 10.55 or 10 ml 2-m K2CO3, 5 ml 1-m KHCO3, 138 mg NaCl (2.34 mmol) and thus receives solution B, pH 11, 1 or 10 ml of water, 1.17 g of NaCl (20 mmol), 5 ml of 1-m KHCOB, 128 mg of NaCN (2.6 mmol) to obtain solution C, pH 10.6 or 5 ml of water, 293 mg of NaCl (5 mmol), 10 ml of 2-m K2CO3, 138 mg of NaCl (2.34 mmol), thus obtaining solution D, pH 12.0.
The solutions A, B, C and D are cooled to -10 C and, while stirring vigorously, allowed to form A or
B and D each add 3 ml (2.6 mmol) of a freshly prepared aqueous solution of freshly prepared cyanogen chloride (method according to I), and 2.53 g (2.34 mmol of NaOCl) bleaching liquor (method according to II) to C. A and B (method I) react slightly exothermically; the temperature is kept around 0 C by cooling. After 13 minutes the odor of the cyanogen chloride is still faintly noticeable; the pH value is 10.25 (A) or 10.8 (B). An insoluble crosslinking product is not deposited. - C (method II) has a strongly exothermic reaction; Despite cooling, the temperature rises temporarily to +30 C. Even before the addition of hypochlorite is complete, the reaction mixture becomes milky and the crosslinking product is then deposited in a flaky, easily filterable form within seconds.
A pungent smell will go away pretty quickly. 13 minutes after the start of the experiment, the pH is 11.0. - The experiment with solution D is used to check the quality of the cyanogen chloride: the milky cloudiness typical of crosslinking occurs even before the addition of the cyanogen chloride is complete, and the crosslinking product flocculates within seconds. It is held at 0 C for a further 12 minutes; the pH is 11.2.
As expected, the cyanogen chloride odor disappears more quickly than in the experiments with solutions A and B. -
Comment: Note that I in case B takes place within the pH range of II in case C. The different results lead to the inescapable conclusion that the crosslinking observed after II is not due to the effect of cyanogen chloride formed as an intermediate. The yield and amine fixability of the product obtained according to II using solution C are within the framework generally customary for process II.
2. Reference to the type of chemical reaction which, according to the invention, leads to crosslinked polyhydroxyl compounds with amine fixing capacity
A further indication of the difference between I and II, which is independent of the above result, results from the observation that II behaves as it would be expected if the first step consisted in an esterification of hydroxyl groups of the starch with hypochlorous acid.
If you let a mixture of 20% (w / w) starch solution and 70% (w / w) sodium hypochlorite solution with a mixing ratio of 100 mg starch: 2 mmol NaOCl at 0 to 50 C with vigorous stirring in a well Drop in cooled 10 / above solution of sodium cyanide, regardless of the stoichiometric ratio between ocr and C, a prompt flocculation of crosslinked starch with excellent amine fixing capacity takes place.
Conversely, if the cyanide is added dropwise to the mixture of starch and hypochlorite, no crosslinking product precipitates. Obviously, the cyanide is captured by the hypochlorite before the starch can react. However, if the starch / hypochlorite mixture is poured over at once with the stoichiometric amount of cyanide solution, the amine-fixing active crosslinking product will flocculate under the conspicuous requirement that the starch-hypochlorite mixture was first incubated for a short time before the cyanide was added, e.g. B. for 5-15 minutes at 200 C. A part of the cyanide is evidently given the opportunity to react directly with a presumably starch-bound part of the hypochlorite, e.g.
B. according to the scheme: ROCl + CN 9 ROCN + cr
Accordingly, an insoluble polyhydroxyl compound swollen in water (dry weight 100 mg) such as Sephadex G 200 or mercerized cellulose (Avicel) can be incubated with hypochlorite solution (2 mmol NaOCl) for 15 to 30 minutes at room temperature, optionally with the addition of dry ice , after adding 100 ml of water, separate from the liquid (centrifuge), take up the residue in 100 ml of water, decant the liquid (centrifuge), pour 10 ml of 10 ml of the above sodium cyanide solution over the residue and then wash it free of cyanide on the centrifuge. The product has an amine fixation capacity, which depends on the duration of the incubation with the hypochlorite.
The particularly mild and uniform crosslinking reaction described in the examples, caused by the action of t-butyl hypochlorite on a mixture of soluble starch and sodium cyanide, would then possibly be regarded as the result of a primary transesterification reaction between the organic hypochlorite and the starch.
PATENT CLAIM I
Process for the production of an activated carrier capable of fixing amino compounds, characterized in that hydrocyanic acid and / or a water-soluble cyanide and a reagent which contains positive chlorine or bromine, namely hypochlorous or hypobromous acid and / or a water-soluble salt of hypochlorous or hypobromous acid or a chlorine or bromine compound, which yields one of the said acids during hydrolysis, or a mixture of such halogen derivatives on a water-soluble or swellable, water-insoluble polyhydroxyl compound in an alkaline medium and the reaction mixture a) in the case of a solution by clarification and dialysis or gel filtration, b) in the case of a suspension, freed from low molecular weight components by filtration or centrifugation and washing out.
SUBCLAIMS
1. The method according to claim I, characterized in that hydrocyanic acid and / or cyanide is added in a total amount which corresponds to 0.25 to 6 gram equivalents of total cyanide per gram equivalent of organically bound hydroxyl.
2. The method according to claim I, characterized in that the hypochlorous or hypobromous acid and / or salts and / or the corresponding hydrolyzable chlorine or bromine compounds are added in a total amount which per gram equivalent of organically bound hydroxyl 0.25 to 6 gram equivalents of positive chlorine or bromine.
3. The method according to claim I, characterized in that the cyanide used is an alkali metal cyanide.
4. The method according to claim 1, characterized in that the salt of hypochlorous or hypobromous acid used is an alkali hypochlorite or hypobromite, preferably sodium bleaching liquor or caustic potash liquor, or chlorine or bromine and an alkali hydroxide or carbonate or bicarbonate.
5. The method according to dependent claim 4, characterized in that at least 2 gram moles of alkali metal hydroxide or at least 1 gram moles of alkali metal carbonate or at least 2 gram moles of alkali hydrogen carbonate are added per gram mole of chlorine or bromine.
6. The method according to claim I, characterized in that the compound hydrolyzable to hypochlorous or hypobromous acid is an ester of said acid, preferably an alkyl hypochlorite having 2 to 5 carbon atoms in the alkyl radical.
7. The method according to claim I, characterized in that the compound hydrolyzable to hypochlorous or hypobromous acid is a nitrogen compound bonded to the nitrogen atom, containing positive chlorine or bromine, for example the sodium salt of p toluenesulfonic acid chloride (chloramine T), N-chloroacetamide, N-chlorosuccinimide, chloramine, N-bromoacetamine or N-bromosuccinimide is used.
8. The method according to claim I or one of the dependent claims 1 to 7, characterized in that the total cyanide and polyhydroxyl compound are initially charged and the resulting mixture is mixed with the reagent which contains positive chlorine or bromine.
9. The method according to claim I or one of the dependent claims 1 to 7, characterized in that the reagent which contains positive chlorine or bromine is initially charged and mixed with the mixture of total cyanide and polyhydroxyl compound.
10. The method according to claim I or one of the dependent claims 1 to 7, characterized in that the polyhydroxyl compound is initially introduced together with the reagent which contains positive chlorine or bromine and the resulting mixture is mixed with the total cyanide.
11. The method according to claim I or one of the dependent claims 1 to 7, characterized in that the total cyanide is initially introduced and mixed with the mixture of polyhydroxyl compound and reagent which contains positive chlorine or bromine.
12. The method according to dependent claim 11, characterized in that the mixture of polyhydroxyl compound and salt of hypochlorous or hypobromous acid is previously treated with carbon dioxide.
13. The method according to dependent claim 10, characterized in that a water-insoluble polyhydroxyl compound is used, its mixture is treated with the salt of hypochlorous or hypobromous acid, optionally with carbon dioxide, the mixture is filtered or centrifuged, the insoluble residue is optionally washed out with an aqueous solution of an alkali metal cyanide added and unused cyanide removed by washing.
14. The method according to claim I, characterized
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