Die Fixierung von Substanzen peptidischer Natur (z. B.
Peptidhonmone, Enzyme, Antikörper) an vorzugsweise unlöslichen Trägern wird wegen ihrer interessanten und vielseitigen Anwendungsmöglichkeiten schon seit längerer Zeit in Betracht gezogen [Grubhofer und Scheith, Z. Physiol. Chem. (Hoppe Seyler) 297, 108 (1954); Micheel und Ewers, Makromol.
Chem., 3, 200 (1949); Levin, Pecht, Goldstein und Katchalski, Biochemistry 3, 1905 (1964); Weetall und Weliky, Nature 204, 896 (1964)]. Nach den ersten Veröffentlichungen erfolgte Bemühungen in dieser Richtung haben sich in einer umfangreichen Patentliteratur niedergeschlagen.
Als besonders erfolgreich erwies sich in der Praxis die Fixierung an Polysachariden und Polysacharidderivaten; dieser Umstand hängt vermutlich mit der Art der Wechselwirkung zwischen fixierter Substanz und Träger zusammen, derart, dass sich z. B. ein fixiertes Enzym auf einer hydratisierten, aus einem Polysacharid bestehenden Unterlage in einer quasi natürlichen Umgebung befindet. Wegen ihrer relativ wohldefinierten Natur werden als Träger vorzugsweise vernetzte Dextrane verwendet, wie man sie z. B. aus der Umsetzung von Dextran mit Epichlorhydrin erhält (z. B. Schweizer Patent Nr. 501 695). Wegen ihrer grossen Quellfähigkeit werden im gleichen Patent auch entsprechend vernetzte Stärkegele und Agarose sowie mercerisierte Zellulose empfohlen.
Zur Fixierung der peptidischen Substanzen müssen die genannten Trägermaterialien durch Einführung funktioneller Gruppen aktiviert werden, derart, dass durch chemische Reaktion zwischen trägergebundener funktioneller Gruppe und peptidischer Substanz pro Peptidmolekel mindestens eine chemische Bindung zum Träger entsteht. Wiederum sind die Vorschläge zahlreich [Zitate u. a. bei Axen et al., Nature (1967) 214, 1302]. Als besonders milde Methode wird an der gleichen Stelle sowie im bereits genannten Schweizer Patent (Nr. 501 695) eine Aktivierung durch Behandlung hydroxyloder aminogruppenhaltiger Polymerer mit einem Halogencyan vorgeschlagen. Dieses Verfahren hat seither ungeachtet der relativ kostspieligen Ausgangsmaterialien (geeignet vernetztes Polymeres einerseits, Bromcyan anderseits) weite Verbreitung gefunden.
Über den chemischen Vorgang beim Aktivierungsprozess, die Natur der aktiven funktionellen Gruppe und ihre Reaktionsweise mit der peptidischen Substanz ist mit Sicherheit nur bekannt, dass die Aktivierung an den Hydroxylgruppen des Trägers und die Fixierung über basischen Stickstoff der peptidischen Substanz erfolgt.
Es wurde nun überraschenderweise gefunden, dass man auf viel direkterem, einfacherem und billigerem Wege zu wertvollen, zur Fixierung von Aminoverbindungen fähigen, aktivierten Trägern gelangt, indem man ein hydroxylgruppenhaltiges Polymeres mit einem Molekulargewicht von mindestens 1000 in wässriger Lösung oder Suspension mit einem wasserlöslichen Cyanid versetzt, dem Reaktionsgemisch bei einem pH von mindestens 8 bis 9 und einer Temperatur unterhalb 50 C unter Rühren so viel wasserlösliches Hypochlorit zugibt, bis die Prüfung auf unverbrauchtes Hypochlorit im Reaktionsgemisch positiv ausfällt, wobei sowohl Vernetzung des hydroxylgruppenhaltigen Polymeren als auch Fähigkeit zur Aminfixierung eintritt, und das Reaktionsgemisch im Falle einer Lösung durch Neutralisation,
im Falle einer Suspension durch Neutralisation oder durch Filtrieren und Auswaschen vom vorhandenen Alkali befreit.
Der erhaltene, vernetzte und aktivierte Träger kann zum Fixieren von Aminoverbindungen verwendet werden, indem man besagten aktivierten Träger in Gegenwart von Wasser auf eine wasserlösliche, an mindestens einem basischen Stickstoffatom substituierbare Aminoverbindung einwirken lässt.
Diese Verwendung wird vorzugsweise so ausgeführt, dass man den aktivierten Träger in Form der erhaltenen Lösung oder Suspension oder des erhaltenen Filterrückstandes einsetzt, bei einer Temperatur unterhalb 50 C arbeitet und hernach dialysierbares oder in gelöster Form verbliebenes Material mit Wasser oder einer wässrigen Salzlösung aus dem Umsetzungsprodukt ausdialysiert oder ausfiltriert oder auswäscht.
Bei der erwähnten Anwendung zur Aminfixierung führt das neue Verfahren zu qualitativ wie quantitativ hochwertigen, gegebenenfalls biologisch aktiven trägerfixierten Aminoverbindungen.
Im folgenden sollen das Verfahren und die erwähnte Anwendung ausführlich beschrieben werden.
Als wasserlösliches Cyanid eignet sich insbesondere ein Alkalicyanid, beispielsweise Natrium- oder Kaliumcyanid. Das Cyanid wird mit Vorteil in einer Menge zugesetzt, die sich ohne scharfe Grenze im Bereich zwischen 0,5 und 6 Gramm äquivalent pro Gramm äquivalent polymergebundenes Hydroxyl bewegt.
Als wasserlösliches Hypochlorit eignet sich insbesondere ein Alkalihypochlorit, beispielsweise Natriumhypochlorit; das Reagens wird mit Vorteil in Form des Javellewassers eingesetzt. Es sind jedoch auch andere wasserlösliche Hypochlorite brauchbar, wie u. a. Chlorkalk.
Die Umsetzung zwischen dem Cyanid/Hypochlorit-vernetzten und -aktivierten hydroxylgruppenhaltigen Polymeren und der Aminoverbindung wird vorzugsweise in schwach alkalischem Bereich, z. B. in Gegenwart von Natriumhydrogencar- bonat, durchgeführt. Es hat sich als vorteilhaft erwiesen, die Aminoverbindung im Überschuss einzusetzen.
Wird als Aminoverbindung ein Enzym eingesetzt, ist es vorteilhaft, der Lösung oder Suspension des Cyanid/Hypochlorit-vernetzten und -aktivierten Polymeren oder dem aus diesem bestehenden Filterrückstand vor der Zugabe des Enzyms einen geeigneten Stabilisator, wie er bei Isolierung oder Reaktionen mit Enzymen üblich ist, beispielsweise Glycerin, zuzusetzen.
Bei der Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens ergibt sich im einzelnen folgendes:
War die eingesetzte Polyhydroxylverbindung wasserlöslich und dialysierbar, so entsteht bei der Fixierung eines relativ niedermolekularen Peptids, z. B. eines dialysierbaren Peptidhormons, eine wasserlösliche, aber nichtdialysierbare Trägerpeptidverbindung, weil die Cyanid/Hypochlorit-Behandlung die Hydroxylverbindung nicht nur aktiviert, sondern gleichzeitig vernetzt und damit ihre Molekulargrösse erhöht.
War die eingesetzte Polyhydroxylverbindung hochgequollen, wie z. B. der nach Warmwasserbehandlung bei etwa 70" C unlöslich verbleibende Anteil von Kartoffelstärke, so entsteht bei der Aktivierung mit Cyanid/Hypochlorit innert Minuten infolge einer Vernetzung ein in dichten Flocken ausfallendes Polymer-Polymerisat, das nicht nur Proteine, wie z. B. hydrolytische Enzyme, in aktiver Form ausgezeichnet bindet, sondern ebenso ausgezeichnet filtrierbar ist und sich wegen seiner hydrodynamischen Eigenschaften auch zur Verwendung in fliessenden Reaktionssystemen (kontinuierlicher Säulenbetrieb) bestens eignet.
In der Kombination von Vernetzung und Aktivierung, welche die Verwendung auch billigster Ausgangspolymerer ermöglicht, in einem einzigen Schritt ein qualitativ hochwertiges aktiviertes Vernetzungsprodukt liefert und hierzu lediglich die Verwendung üblichster Chemikalien erfordert, ist ein erheblicher, unerwarteter und wirtschaftlich bedeutsamer technischer Fortschritt zu erblicken.
War schliesslich die eingesetzte Polyhydroxylverbindung an sich hochmolekular und begrenzt quellbar, so führt die Cyanid/Hypochlorit-Behandlung unter Strukturverdichtung zu einem aktivierten Produkt, das sich vorzüglich zur Fixierung von Aminen, Aminosäuren, Oligopeptiden, Polypeptiden und Proteinen der allgemeinen Formel
NRR'R" eignet, wobei mindestens eines und höchstens zwei der Symbole R, R' und R" Wasserstoff und die übrigen bzw. das übrige Symbol organische Radikale bedeuten, die ihrerseits funktionelle Gruppen tragen können.
Es eröffnet sich also in diesem hohen Bereich der Molekulargewichte ein sehr einfacher Weg zur Gewinnung von Polysachariden mit - im Rahmen der Wasserbeständigkeit be liebigen - funktionellen Zusatzgruppen.
Es ist auch im vorliegenden Fall unklar, welche chemische Reaktionen der Vernetzung und der Aktivierung des hydroxylgruppenhaltigen Polymeren zugrundeliegen. Die Hypothese einer intermediären Bildung von Chlorcyan erscheint im Lichte mannigfacher Diskussionen in der Literatur als wenig wahrscheinlich. Nach anfänglichen widersprüchlichen Auffassungen hat sich nämlich herausgestellt, das Chlorcyan von überschüssigem Cyanid in alkalischer Lösung, d. h. unter den erfindungsgemäss angewandten Bedingungen, zerstört wird, sei es unter Verharzung oder unter Bildung von Cyanat oder von Paracyan (CN)x.
Die folgenden Beispiele sollen die Durchführung des Verfahrens erläutern.
Beispiele
A. Vernetzung und Aktivierung von Polyhydroxyl verbindungen
I. Verwendung von Kartoffelstärke und Kartoffelstärke
Abbauprodukten a) Amylopektinfraktion
1 Gramm Stärke wird in 1 Liter Wasser suspendiert. Man erwärmt unter Rühren auf 70" C, hält eine Stunde auf dieser Temperatur, lässt erkalten und trennt die hochgequollene, aber unlöslich gebliebene Fraktion durch Zentrifugieren ab.
Nach Wiederholung der Warmwasserbehandlung und abermaliger Abtrennung auf der Zentrifuge verbleibt eine Amylopektin -Fraktion mit einem Trockengewicht von etwa einem Drittel der eingesetzten Stärke.
b) Amylosefraktion
Dies ist der bei der Warmwasserbehandlung nach a) in Lösung gegangene Anteil. Er wird durch Lyophilisation getrocknet. Bezüglich der Amylopektin- bzw. Amylosefraktion der Stärke, siehe Advances in Carbohydrate Chemistry, Vol. 1, Seite 262, Academie Press Inc. Publishers, New York 1945.
c) Amylose-Partialhydrolysat
Man verzuckert die Hälfte der Amylosefraktion partiell mit Salzsäure in bekannter Weise, fraktioniert anschliessend durch Gel-Filtration über Sephadex G 25 und isoliert das rasch auslaufende Material durch Lyophilisation (Gefriertrocknung).
Cyanid/Hypochlorit-Behandlung
Je ungefähr 100 mg (Trockengewicht) eingeweichte Stärke, Amylopektinfraktion , Amylosefraktion und Amylose-Partialhydrolysat werden in 35 ml Wasser suspendiert, mit 25 oder 50 oder 100 oder 200 oder 400 mg Natriumcyanid und anschliessend, in einer Versuchsreihe unter Eiskühlung, in einer zweiten Versuchsreihe bei Raumtemperatur, tropfenweise unter starkem Rühren mit 3proz. (Gew./ Gew.) Javellewasser versetzt, bis die Prüfung mit KI-Stärke eben einen bleibenden Überschuss an Hypochlorit anzeigt.
Hypochloritverbrauch: 1 Mol pro Mol Natriumcyanid. Der pH-Wert steigt von etwa 10,5 (Cyanid-Lösung) auf etwa 12 an. Versuchsdauer 5-20 Min. Resultat hinsichtlich Vernetzung:
Stärke zeigt schon ab 25 mg Cyanid gute Filtrierbarkeit; Amylopektinfraktion wird bereits bei 50 mg Cyanid flockig und sehr gut filtrierbar; Amylosefraktion und Amylosepartialhydrolysat flokken kaum oder gar nicht aus.
Das Resultat bleibt praktisch gleich bei Verwendung von
6proz. (Gew./Gew.) Javellewasser.
Das Resultat eines Amylopektinfraktion -Ansatzes mit 50 mg Cyanid ändert sich auch nicht, wenn das 6proz. Javellewasser vor seiner Verwendung auf pH 6 eingestellt wird: der pH-Wert steigt auch hier von anfänglich 10,5 immerhin gegen 11, und das Produkt ist hinsichtlich Flockung, Filtrierbarkeit und Aktivierungsgrad einwandfrei. Wird der pH indessen nach der Cyanidzugabe auf pH 6 oder 8 eingestellt und erfolgt dann die Hypochloritzugabe beim selben pH (pH Stat), so bleibt jede Ausflockung aus; der Hypochloritverbrauch pro Mol Cyanid nimmt in allen diesen Fällen zu, vermutlich wegen teilweiser Disproportionierung des Hypochlorits unter Bildung von Chlorat und Kochsalz.
II. Verwendung von Cellulose
Je 100 mg mikrokristallines Cellulosepulver (AVICEL) und gepulverte Fasercellulose MN 300 (Firma Macherey und Nagel) werden während 2 Stunden in Wasser suspendiert.
Eine dritte Probe, ebenfalls aus Fasercellulose MN 300, wird über Nacht in 17,5proz. Natronlauge unter Luftausschluss mercerisiert. Anschliessend werden die drei Proben wie unter I beschrieben mit je 50 mg Natriumcyanid und Javellewasser aktiviert. In allen Fällen wird die Cellulose körniger und dichter; sie lässt sich gut filtrieren.
Der Hypochloritverbrauch beträgt auch hier 1 Mol pro Mol Cyanid. Die Gegenwart der Mercerisierlauge stört trotz erhöhter Alkalinität den Reaktionsverlauf nicht. Trotzdem empfiehlt sich zur Erhöhung der Lebensdauer der aktiven Gruppen ein vorhergehendes Abtrennen oder Neutralisieren der Natronlauge.
III. Verwendung von Sephadex G 200
Je 100 mg Sephadex G 200 (Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala) werden wie unter I beschrieben mit Mengen von 25 bis 400 mg Natriumcyanid und Javellewasser aktiviert, wobei Hypochlorit-Verbrauch und pH-Veränderung sich im angegebenen Rahmen bewegen. Das Sephadex wird hierbei ebenfalls dichter, so dass es nun beispielsweise in der schnellen Flüssigkeitschromatographie als Säulenfüllung benützbar ist.
Zwecks Umsetzung der aktivierten Polymeren mit wasserlöslichen Aminoverbindungen werden die beschriebenen wasserlöslichen Produkte nach Neutralisation ihrer Lösung sofort weiter verwendet. Die wasserunlöslichen Produkte können in Suspension verbleiben und nach erfolgter Abstumpfung des Alkalis ebenfalls direkt mit der Aminoverbindung weiter umgesetzt werden. Vorteilhafter aber ist es in manchen Fällen, das unlösliche Material auf einem Filter zu sammeln, es auszuwaschen, wozu Wasser, Salzlösungen und Puffer, mit oder ohne Zusatz von Proteinstabilisatoren (z. B. Glycerin), verwendet werden können, und dann den feuchten Filterrückstand, wiederum ohne Verzug wegen begrenzter Lebensdauer der aktiven funktionellen Gruppen, mit einer wasserlöslichen Aminoverbindung umzusetzen.
B. Umsatz von Cyanid/Hypochlorit-vernetzten und -aktivierten Polyhydroxylverbindungen mit wasserlöslichen N-substituierbaren Aminoverbindungen
Die Fixierung der Aminoverbindungen am Träger erfolgt vorteilhaft in schwach basischem (z. B. Alkalihydrogencarbonat) bis basischem (z. B. Alkalicarbonat) Milieu, wobei es zweckmässig ist, die Konzentration so hoch als möglich zu gestalten. Im Falle eines Filterrückstands genügt oft das eingeschlossene Wasser, um eine trocken, in lyophilisierter Form vorliegende Aminoverbindung aufzulösen. Die Aminoverbindung wird hierzu einfach mit dem Filterrückstand verrührt.
Beim Stehenlassen erfolgt dann die Fixierung; sie kann durch gelegentliche Umwälzung des Filterrückstands beschleunigt werden.
An den oben beschriebenen wasserlöslichen Polymeren wurden in wässeriger Alkalihydrogencarbonatlösung fixiert: Oxytocin, Vasopressin, Angiotensin, ss1-24-Corticotropin.
Nach erfolgter Reaktion wird zur Entfernung von nichtumgesetztem Material und Salzen filtriert (Sephadex G-25) oder dialysiert. Die Produkte enthalten nach Aminosäureanalysen pro Gramm Trockensubstanz zwischen 2 und 20 % an peptidischem Material.
An den oben beschriebenen wasserunlöslichen Polymeren wurden in Gegenwart von Natriumhydrogencarhonat, das aus der Waschflüssigkeit des Filterrückstands stammte (lproz.
NaHCO3-Lösung), und in einer zweiten Versuchsreihe in zusätzlicher Gegenwart von Glycerin, das ebenfalls aus dem Waschprozess stammte (letzte Waschflüssigkeit: 10proz. Glycerin, lproz. NaHCO3), folgende Enzyme durch Einrühren in den Filterrückstand gebracht und fixiert:
Hexokinase
Ribonuclease
Trypsin
Chymotrypsin
Carboxypeptidase
Acyl-L-aminosäure-Acylase
Auf 1 Teil (Trockengewicht) aktivierten Träger wird vorteilhaft t/4 bis t/2, eventuell auch ein ganzer Gewichtsteil Protein eingesetzt. Der Proteinanteil in den Träger-Proteinverbindungen liegt bei etwa 10 bis 30% des Trockengewichtes (Aminosäureanalyse).
Sämtliche Aktivierungsstufen zwischen 50 und 400 mg Na triumcyanid pro 100 mg (Trockengewicht) Amylopektinfraktion , Stärke, und Sephadex G 200 und ebenso die Aktivierungsstufe 50 mg Cyanid pro 100 mg Cellulose liefern enzymatisch aktives Material, das die für kohlehydratfixierte Präparate charakteristische Beständigkeit besitzt.
Im folgenden wird die Fixierung der oben genannten Acylase (Pilzenzym der Firma Amano Pharmaceutical Co.
Ltd., Nagoya, Japan) sowie die Verwendung des Präparates näher beschrieben:
In den feuchten Filterrückstand (aktivierte Amylopektinfraktion aus 10 g Kartoffelstärke und 9 g Natriumcyanid), der aus dem Waschprozess (0,1 m NaHCO3 + 10-4 m Com12) etwas Base und etwas Co++-Ion enthält, wird 1 g durch Dialyse vorgereinigte lyophilisierte Acylase eingerührt. Man lässt über Nacht bei 4" C stehen, nimmt in 0,1 m NaHCO3 + m m CoCl2 auf, filtriert und wäscht mit 1 Liter derselben Salzlösung langsam und gründlich nach. Man gibt den nunmehr acylasebeladenen Filterrückstand zu einer Lösung von 24 g Acetyl-DL-phenylalanin-Natrium in 300 ml 10-4 m CoCl2 und inkubiert unter langsamem Rühren bei 40 C in
Gegenwart von etwas Thymol.
Nach 2 Tagen, während derer man den Fortschritt der Reaktion polarimetrisch verfolgen kann, wird vom fixierten Enzym abfiltriert und der Filterrückstand - ohne ihn auch nur auszuwaschen - in eine weitere Portion von 24 g DL-Phenylalanin-Natrium in 300 ml 10-4 m Com12 eingetragen usw. (2. Abbauzyklus).
Aus dem eingeengten Filtrat kristallisiert L-Phenylalanin in einer Ausbeute von 6070 %, und aus der angesäuerten
Mutterlauge Acetyl-phenylalanin, Ausbeute 70-80%, das vor wiegend aus der D-From besteht. Die Substanzverluste beru hen auf der Flüssigkeitsretention durch den voluminösen Fil terrückstand. Sie verringern sich bereits bei der Aufarbeitung des Filtrates aus dem zweiten Abbauzyklus. Es können leicht mindestens 40 bis 50 Abbauzyklen durchgeführt werden, be vor die Enzyminaktivierung ein Ersetzen des Enzympräpara tes erfordert. In der Kälte ist die fixierte Acylase, besonders in Gegenwart von Natriumacetat und Acetyl-D-phenylalanin Natrium, monatelang unverändert haltbar.
Werden die Filterrückstände unter sonst gleichen Bedingungen mit wässerigen Lösungen der Enzyme behandelt, so tritt ebenfalls Fixierung ein, doch verläuft sie in der Regel verlustreicher.
Dagegen erweist es sich oft als vorteilhaft, niedermolekulare Aminoverbindungen wie Oligopeptide, aliphatische und aromatische Aminocarbon- bzw. -sulfonsäuren, Aminophenole, aliphatische und aromatische Aminoalkohole, Diamine und Polyamine sowie aliphatische, alicyclische und heterozyklische Amine und wasserlösliche Derivate all dieser Substanzen mit noch vorhandenem substituierbarem und basischem Stickstoff in Form mehr oder weniger konzentrierter wässeriger Lösungen zur Fixierung zu bringen.
So sind beispielsweise aus wässeriger Lösung an einer Cyanid/Hypochlorit-behandelten Amylopeptinfraktion folgende Aminoverbindungen mit Erfolg fixiert worden: das Sequenzpeptid Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Ala zur Durchführung von Abbaureaktionen in heterogenem Milieu; das S-Peptid aus Ribonuclease zur Verwendung in der Affinitätschromatographie; das p-Aminophenyl-a-N-acetyl-alanin als Substratanaloges einer Acylaminosäure-Acylase; das Glycyl-phenylalanin als Substratanaloges derselben Acylaminosäure-Acylase;
Glutaminsäure und Sulfanilsäure zur Gewinnung chromatographischer Adsorbentien;
Dehydroabietylamin zur Gewinnung eines optisch aktiven Salzbildners;
Imidazol zur Gewinnung eines Hydrolysekatalysators;
Hydroxylamin, Hydrazin, Phenylhydrazin, p-Aminophenol und p-Phenylendiamin zur Gewinnung von Reduktionsmitteln.
PATENTANSPRUCH 1
Verfahren zur Herstellung eines zur Fixierung von Amino verbindungen fähigen, aktivierten Trägers, dadurch gekennzeichnet, dass man ein hydroxylgruppenhaltiges Polymeres mit einem Molekulargewicht von mindestens 1000 in wässriger Lösung oder Suspension mit einem wasserlöslichen Cyanid versetzt, dem Reaktionsgemisch bei einem pH von mindestens
8 bis 9 und einer Temperatur unterhalb 50 C unter Rühren so viel wasserlösliches Hypochlorit zugibt, bis die Prüfung auf unverbrauchtes Hypochlorit im Reaktionsgemisch positiv aus fällt, wobei sowohl Vernetzung des hydroxylgruppenhaltigen
Polymeren als auch Fähigkeit zur Aminfixierung eintritt, und das Reaktionsgemisch im Falle einer Lösung durch Neutrali sation, im Falle einer Suspension durch Neutralisation oder durch Filtrieren und Auswaschen vom vorhandenen Alkali be freit.
UNTERANSPRÜCHE
1. Verfahren nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass man als wasserlösliches Cyanid ein Alkalicyanid, als wasserlösliches Hypochlorit ein Alkalihypochlorit, vorzugsweise Javellewasser, verwendet,
2. Verfahren nach Patentanspruch I oder Unteranspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man das wasserlösliche Cyanid je nach gewünschtem Vernetzungs- und Aktivierungsgrad in einer Menge zusetzt, welche von 0,5 bis 6 Grammäquivalent
Cyanid pro Grammäquivalent polymergebundenem Hydroxyl beträgt.
PATENTANSPRUCH II
Verwendung eines nach dem Verfahren gemäss Patentan spruch I hergestellten aktivierten Trägers zum Fixieren von
Aminoverbindungen, dadurch gekennzeichnet, dass man be sagten aktivierten Träger in Gegenwart von Wasser auf eine
**WARNUNG** Ende DESC Feld konnte Anfang CLMS uberlappen**.
The fixation of substances of a peptide nature (e.g.
Peptide hones, enzymes, antibodies) on preferably insoluble carriers have been considered for a long time because of their interesting and versatile application possibilities [Grubhofer and Scheith, Z. Physiol. Chem. (Hoppe Seyler) 297, 108 (1954); Micheel and Ewers, Makromol.
Chem., 3, 200 (1949); Levin, Pecht, Goldstein and Katchalski, Biochemistry 3, 1905 (1964); Weetall and Weliky, Nature 204, 896 (1964)]. Efforts in this direction that followed the first publications are reflected in an extensive patent literature.
The fixation on polysaccharides and polysaccharide derivatives has proven to be particularly successful in practice; this fact is presumably related to the type of interaction between the fixed substance and the carrier, such that e.g. B. is a fixed enzyme on a hydrated, consisting of a polysaccharide pad in a quasi-natural environment. Because of their relatively well-defined nature, crosslinked dextrans are preferably used as carriers, as they are e.g. B. obtained from the reaction of dextran with epichlorohydrin (e.g. Swiss patent no. 501 695). Because of their great swelling capacity, the same patent also recommends correspondingly crosslinked starch gels and agarose as well as mercerized cellulose.
To fix the peptidic substances, said carrier materials have to be activated by introducing functional groups in such a way that at least one chemical bond to the carrier is created per peptide molecule through a chemical reaction between carrier-bound functional group and peptidic substance. Again, the suggestions are numerous [quotations " a. in Axen et al., Nature (1967) 214, 1302]. Activation by treating hydroxyl or amino group-containing polymers with a cyanogen halide is proposed as a particularly mild method at the same point and in the aforementioned Swiss patent (No. 501 695). This process has since found widespread use, regardless of the relatively expensive starting materials (suitable crosslinked polymer on the one hand, cyanogen bromide on the other hand).
What is known with certainty about the chemical process during the activation process, the nature of the active functional group and its mode of reaction with the peptidic substance is that the activation on the hydroxyl groups of the carrier and the fixation takes place via basic nitrogen of the peptidic substance.
It has now surprisingly been found that valuable activated carriers capable of fixing amino compounds can be obtained in a much more direct, simpler and cheaper way by adding a water-soluble cyanide to a hydroxyl-containing polymer with a molecular weight of at least 1000 in aqueous solution or suspension , add enough water-soluble hypochlorite to the reaction mixture at a pH of at least 8 to 9 and a temperature below 50 C with stirring until the test for unused hypochlorite in the reaction mixture is positive, with both crosslinking of the hydroxyl-containing polymer and the ability to fix amine, and the reaction mixture in the case of a solution by neutralization,
in the case of a suspension, freed from the alkali present by neutralization or by filtering and washing out.
The crosslinked and activated carrier obtained can be used for fixing amino compounds by allowing said activated carrier to act in the presence of water on a water-soluble amino compound which can be substituted on at least one basic nitrogen atom.
This use is preferably carried out in such a way that the activated carrier is used in the form of the resulting solution or suspension or the resulting filter residue, operating at a temperature below 50 ° C. and then dialyzable or dissolved material with water or an aqueous salt solution from the reaction product dialysed out or filtered out or washes out.
In the above-mentioned application for amine fixation, the new process leads to qualitatively and quantitatively high quality, optionally biologically active, carrier-fixed amino compounds.
In the following, the method and the mentioned application will be described in detail.
An alkali metal cyanide, for example sodium or potassium cyanide, is particularly suitable as the water-soluble cyanide. The cyanide is advantageously added in an amount which, without a sharp limit, ranges between 0.5 and 6 grams equivalent per gram equivalent polymer-bound hydroxyl.
A particularly suitable water-soluble hypochlorite is an alkali hypochlorite, for example sodium hypochlorite; the reagent is advantageously used in the form of Javelle water. However, other water-soluble hypochlorites are also useful, such as u. a. Chlorinated lime.
The reaction between the cyanide / hypochlorite-crosslinked and -activated hydroxyl-containing polymers and the amino compound is preferably carried out in a weakly alkaline range, e.g. B. in the presence of sodium hydrogen carbonate carried out. It has proven advantageous to use the amino compound in excess.
If an enzyme is used as the amino compound, it is advantageous to add a suitable stabilizer to the solution or suspension of the cyanide / hypochlorite-crosslinked and -activated polymer or the filter residue consisting of this prior to the addition of the enzyme, as is customary for isolation or reactions with enzymes , for example glycerin, to be added.
When carrying out the method according to the invention, the following results in detail:
If the polyhydroxyl compound used was water-soluble and dialyzable, the fixation of a relatively low molecular weight peptide, e.g. B. a dialyzable peptide hormone, a water-soluble but nondialysable carrier peptide compound, because the cyanide / hypochlorite treatment not only activates the hydroxyl compound, but also cross-links it at the same time and thus increases its molecular size.
Was the polyhydroxyl compound used highly swollen, such as. B. the portion of potato starch that remains insoluble at about 70 "C after hot water treatment, when activated with cyanide / hypochlorite a polymer polymer precipitates in dense flakes within minutes as a result of crosslinking, which is not only proteins, such as hydrolytic Enzymes, which binds excellently in active form, but is also excellently filterable and, due to its hydrodynamic properties, is also ideally suited for use in flowing reaction systems (continuous column operation).
In the combination of crosslinking and activation, which enables the use of even the cheapest starting polymers, provides a high quality activated crosslinking product in a single step and only requires the use of the most common chemicals, a considerable, unexpected and economically significant technical advance can be seen.
If the polyhydroxyl compound used was ultimately of high molecular weight and swellable to a limited extent, the cyanide / hypochlorite treatment leads to an activated product with structural compression, which is ideal for fixing amines, amino acids, oligopeptides, polypeptides and proteins of the general formula
NRR'R "is suitable, where at least one and at most two of the symbols R, R 'and R" denote hydrogen and the remaining or the remaining symbol denote organic radicals which in turn can carry functional groups.
In this high molecular weight range, a very simple way of obtaining polysaccharides with additional functional groups - within the framework of water resistance - opens up.
In the present case, too, it is unclear which chemical reactions are the basis of the crosslinking and activation of the hydroxyl-containing polymer. The hypothesis of an intermediate formation of cyanogen chloride appears to be unlikely in the light of numerous discussions in the literature. After initial contradicting views it has been found that the cyanogen chloride of excess cyanide in alkaline solution, i.e. H. is destroyed under the conditions used according to the invention, be it with resinification or with the formation of cyanate or of paracyan (CN) x.
The following examples are intended to explain the implementation of the process.
Examples
A. Crosslinking and activation of polyhydroxyl compounds
I. Use of potato starch and potato starch
Degradation products a) amylopectin fraction
1 gram of starch is suspended in 1 liter of water. The mixture is heated to 70 ° C. with stirring, held at this temperature for one hour, allowed to cool and the highly swollen but insoluble fraction is separated off by centrifugation.
After repeating the warm water treatment and again separating it on the centrifuge, an amylopectin fraction remains with a dry weight of about one third of the starch used.
b) amylose fraction
This is the portion that has dissolved during the hot water treatment according to a). It is dried by lyophilization. With regard to the amylopectin or amylose fraction of the starch, see Advances in Carbohydrate Chemistry, Vol. 1, page 262, Academie Press Inc. Publishers, New York 1945.
c) amylose partial hydrolyzate
Half of the amylose fraction is partially saccharified with hydrochloric acid in a known manner, then fractionated by gel filtration through Sephadex G 25 and the rapidly leaking material is isolated by lyophilization (freeze-drying).
Cyanide / hypochlorite treatment
Approximately 100 mg (dry weight) of each soaked starch, amylopectin fraction, amylose fraction and amylose partial hydrolyzate are suspended in 35 ml of water with 25 or 50 or 100 or 200 or 400 mg of sodium cyanide and then, in a series of experiments with ice cooling, in a second series of experiments Room temperature, dropwise with vigorous stirring with 3%. (W / W) Javelle water added until the test with KI starch just shows a permanent excess of hypochlorite.
Hypochlorite consumption: 1 mole per mole of sodium cyanide. The pH increases from about 10.5 (cyanide solution) to about 12. Test duration 5-20 min. Result regarding crosslinking:
Starch shows good filterability from 25 mg cyanide; The amylopectin fraction becomes flaky and very easy to filter at 50 mg of cyanide; The amylose fraction and amylose partial hydrolyzate hardly or not at all flocculate.
The result is practically the same when using
6 percent (W / w) Javelle water.
The result of an amylopectin fraction approach with 50 mg of cyanide does not change even if the 6% Javelle water is adjusted to pH 6 before it is used: the pH value also rises here from an initial 10.5 to 11, and the product is perfect in terms of flocculation, filterability and degree of activation. If, however, the pH is adjusted to pH 6 or 8 after the addition of cyanide and the hypochlorite is then added at the same pH (pH Stat), there is no flocculation; the consumption of hypochlorite per mole of cyanide increases in all these cases, presumably due to partial disproportionation of the hypochlorite with the formation of chlorate and common salt.
II. Use of cellulose
100 mg each of microcrystalline cellulose powder (AVICEL) and powdered fiber cellulose MN 300 (Macherey and Nagel) are suspended in water for 2 hours.
A third sample, also made of fiber cellulose MN 300, is overnight in 17.5%. Sodium hydroxide solution mercerized with exclusion of air. The three samples are then activated as described under I with 50 mg sodium cyanide and Javelle water each. In all cases the cellulose becomes more granular and denser; it can be filtered easily.
Here too, the consumption of hypochlorite is 1 mole per mole of cyanide. The presence of the mercerizing liquor does not disturb the course of the reaction, despite the increased alkalinity. Nevertheless, to increase the service life of the active groups, a previous separation or neutralization of the sodium hydroxide solution is recommended.
III. Use of Sephadex G 200
100 mg of Sephadex G 200 (Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala) are activated as described under I with amounts of 25 to 400 mg of sodium cyanide and Javelle water, the hypochlorite consumption and pH change being within the specified range. The Sephadex also becomes denser in this case, so that it can now be used as a column filling, for example in fast liquid chromatography.
For the purpose of reacting the activated polymers with water-soluble amino compounds, the water-soluble products described are used immediately after their solution has been neutralized. The water-insoluble products can remain in suspension and, after the alkali has been blunted, can also be further reacted directly with the amino compound. In some cases, however, it is more advantageous to collect the insoluble material on a filter, wash it out, for which water, salt solutions and buffers, with or without the addition of protein stabilizers (e.g. glycerine), can be used, and then the moist filter residue , again without delay due to the limited life of the active functional groups, to react with a water-soluble amino compound.
B. Sales of cyanide / hypochlorite-crosslinked and activated polyhydroxyl compounds with water-soluble N-substitutable amino compounds
The amino compounds are advantageously fixed on the carrier in a weakly basic (e.g. alkali hydrogen carbonate) to basic (e.g. alkali metal carbonate) medium, it being expedient to make the concentration as high as possible. In the case of filter residue, the enclosed water is often sufficient to dissolve a dry, lyophilized amino compound. The amino compound is simply mixed with the filter residue.
The fixation then takes place when left standing; it can be accelerated by occasionally circulating the filter residue.
The following were fixed in aqueous alkali hydrogen carbonate solution to the water-soluble polymers described above: oxytocin, vasopressin, angiotensin, ss1-24-corticotropin.
After the reaction has taken place, it is filtered (Sephadex G-25) or dialyzed to remove unreacted material and salts. According to amino acid analyzes, the products contain between 2 and 20% of peptide material per gram of dry matter.
On the water-insoluble polymers described above, in the presence of sodium hydrogen carbonate, which came from the washing liquid of the filter residue (l per cent.
NaHCO3 solution), and in a second series of experiments in the additional presence of glycerine, which also came from the washing process (last washing liquid: 10% glycerine, 1% NaHCO3), the following enzymes were stirred into the filter residue and fixed:
Hexokinase
Ribonuclease
Trypsin
Chymotrypsin
Carboxypeptidase
Acyl-L-amino acid acylase
On 1 part (dry weight) activated carrier, t / 4 to t / 2, possibly also a whole part by weight, of protein is advantageously used. The protein content in the carrier-protein compounds is around 10 to 30% of the dry weight (amino acid analysis).
All activation levels between 50 and 400 mg sodium cyanide per 100 mg (dry weight) amylopectin fraction, starch, and Sephadex G 200 as well as the activation level 50 mg cyanide per 100 mg cellulose provide enzymatically active material that has the resistance characteristic of carbohydrate-fixed preparations.
In the following, the fixation of the above-mentioned acylase (mushroom enzyme from Amano Pharmaceutical Co.
Ltd., Nagoya, Japan) and the use of the preparation are described in more detail:
In the moist filter residue (activated amylopectin fraction from 10 g potato starch and 9 g sodium cyanide), which contains some base and some Co ++ ion from the washing process (0.1 m NaHCO3 + 10-4 m Com12), 1 g lyophilized, pre-cleaned by dialysis Acylase stirred in. It is left to stand overnight at 4 ° C., taken up in 0.1 m NaHCO3 + mm CoCl2, filtered and washed slowly and thoroughly with 1 liter of the same salt solution. The filter residue, which is now loaded with acylase, is added to a solution of 24 g of acetyl-DL -phenylalanine sodium in 300 ml of 10-4 M CoCl2 and incubated with slow stirring at 40 C in
Presence of some thymol.
After 2 days, during which the progress of the reaction can be followed polarimetrically, the fixed enzyme is filtered off and the filter residue - without even washing it out - is added to another portion of 24 g of DL-phenylalanine sodium in 300 ml of 10-4 m Com12 entered etc. (2nd cycle of degradation).
L-phenylalanine crystallizes from the concentrated filtrate in a yield of 6070%, and from the acidified
Mother liquor acetyl-phenylalanine, yield 70-80%, which mainly consists of the D-form. The substance losses are based on the fluid retention due to the voluminous filter residue. They are already reduced when working up the filtrate from the second degradation cycle. At least 40 to 50 degradation cycles can easily be carried out before enzyme inactivation requires replacement of the enzyme preparation. In the cold, the fixed acylase can be kept unchanged for months, especially in the presence of sodium acetate and acetyl-D-phenylalanine sodium.
If the filter residues are treated with aqueous solutions of the enzymes under otherwise identical conditions, fixation also occurs, but it is usually more lossy.
On the other hand, it often proves to be advantageous to use low molecular weight amino compounds such as oligopeptides, aliphatic and aromatic aminocarboxylic or sulfonic acids, aminophenols, aliphatic and aromatic amino alcohols, diamines and polyamines as well as aliphatic, alicyclic and heterocyclic amines and water-soluble derivatives of all these substances with substitutable substances that are still present and basic nitrogen in the form of more or less concentrated aqueous solutions to fix.
For example, the following amino compounds have been successfully fixed to a cyanide / hypochlorite-treated amylopeptin fraction from aqueous solution: the sequence peptide Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Ala for carrying out degradation reactions in a heterogeneous environment; the S-peptide from ribonuclease for use in affinity chromatography; p-aminophenyl-a-N-acetylalanine as a substrate analog of an acylamino acid acylase; glycylphenylalanine as a substrate analog of the same acylamino acid acylase;
Glutamic acid and sulfanilic acid for the recovery of chromatographic adsorbents;
Dehydroabietylamine for obtaining an optically active salt former;
Imidazole for obtaining a hydrolysis catalyst;
Hydroxylamine, hydrazine, phenylhydrazine, p-aminophenol and p-phenylenediamine for the production of reducing agents.
PATENT CLAIM 1
Process for the production of an activated carrier capable of fixing amino compounds, characterized in that a hydroxyl group-containing polymer with a molecular weight of at least 1000 is mixed with a water-soluble cyanide in aqueous solution or suspension, the reaction mixture at a pH of at least
8 to 9 and a temperature below 50 C with stirring so much water-soluble hypochlorite is added until the test for unused hypochlorite in the reaction mixture is positive, with both crosslinking of the hydroxyl-containing
Polymers as well as the ability to fix amine occurs, and the reaction mixture is freed from the alkali present in the case of a solution by neutralization, in the case of a suspension by neutralization or by filtration and washing out.
SUBCLAIMS
1. The method according to claim I, characterized in that an alkali metal cyanide is used as the water-soluble cyanide, an alkali hypochlorite, preferably Javelle water, as the water-soluble hypochlorite,
2. The method according to claim I or dependent claim 1, characterized in that the water-soluble cyanide is added, depending on the desired degree of crosslinking and activation, in an amount which is from 0.5 to 6 gram equivalent
Cyanide per gram equivalent of polymer-bound hydroxyl.
PATENT CLAIM II
Use of an activated carrier produced by the method according to patent claim I for fixing
Amino compounds, characterized in that be said activated carrier in the presence of water on a
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