JPS58187186A - 固定化酵素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は固定化酵素に関するものである。

従来、酵素反応社臨床化学、生化学、食品化学、及び医
薬品等の分野で広く利用されているが、その殆んどが酵
素を水溶液に溶解した状態で１質に作用させる方法で行
がわれているのが現状であ゛るＯしかしながら、このよ
う表方法では反応終ｒ後、反応溶液から酵素を回収する
ことは、一般的に酵素が水溶性であるために、技術的に
むずかしく、又反応生成物の分離精製も容易でけない。

更に又、酵素を繰り返して使用することが困難である為
、酵鷹の利用効率が低く不経済さを免れない。

このような欠点を解消させるために、酵素を固定化する
方法が行なわれている。　　“リシルエンドペプチダー
ゼは、土壌より分離されたアクロモバクタ−リティカス
Ｍ４９７−１が産生ずる菌体外酵素で、副島、正本らに
より発見され、アグリカルチエラル・アンド・バイオロ
ジカル・ケミストリーの４２巻１４４２頁（１９７８ζ
−）において、アクロモバクタ−プロテアーゼＩと命名
されたものと同一酵素である。

該酵素は至適温度が約４５℃でろ？′ζ・カゼインを基
質にした場合、プロテアーゼ活性の至適ｐ口は８５〜１
０．５、ゲル濾過法による分子量は２７０．００、等電
点ｐ　Ｈ６，９、ジイソプロピルフォスフオクロリド及
びトシル−Ｌ−ＩＪリシンロロメチルケトンにより強く
阻害を受け、トシル−Ｌ−フェニルアラニンクロロメチ
ルケトン、エチレンジアミンテトラアセテート、オルソ
フェナンスロリンおよびＰ−クロロマーキュリ−ベンゾ
エートで阻害されないセリン酵素である。

本ｍ素ｕエステル類の合成基質の中で、トフルーリジン
メチルエステル及ヒドンルーし一アルギニンメチルエス
テルの両方に作用し、氷解を引き起こすが、後者に対す
る作用はきわめてわずかであり、実質的には無視出来る
ものである。又、他のアミノ酸のエステル結合に対して
は作用しない。

アミド類の合成基質の中では、Ｎ−ベンゾイル−リシン
アミド、Ｎ−ベンゾイル−ＤＬ−リンンーＰ−ニトロア
ニリド及びＬ−リンンーＰ−ニトロアニリドのアミド結
合は良く加水分解されるが、対応するアルギニン誘導体
は全く作用訃受けない。

ペプチド類において、グルカゴンでは１２位のリシンと
１３位のチロシンとのアミド結合のみ、イン７ュリンで
はＢ鎖の２９位リシンと３０位のアラニンとのアミド結
合のみ、す７／−パンブレラシンでは、８位のりシンと
９位のグリ７ノとのアミド結合のみ、及びサブスタンス
Ｐでは３位のりシンと４位のブロワ／とのアミド結合の
みを、いずれも水解する。

このように本酵素は、Ｌ−リシンのカルボキシ末端にお
けるエステル結合及びアミド結合を特異的に水解する性
質を有するため、ペグチドや蛋白質のアミノ酸配列を決
定するのに大いに役立つ。

又、本酵素の特筆すべき用途として本酵素がＬ−リシン
のカルボキシ末端に特異的に作用することを利用し、副
島・正本らの特願昭５３−４３５７４、および森原・岡
らのバイオケミカル・ア７・ド・バイオフィジカル・リ
サーチ・コミユニ７１７３７９２巻３６２頁（１９８０
）には豚イン／ニリンからのヒトインシーリンの合成法
が記載されている。

即ち、ブタインシーリンとヒトインシュリンの化学構造
上の相異はカルボキシ末端（３０位）のアミノ酸が前者
においてアラニン、後者ニおいてスレオニンの相異だけ
である。

しかもこれらのアミノ酸に直接結合している２９位のア
ミノ酸祉リシンである。

ブタインシーリンにｐ　Ｈ８，５の条婬で本酵素を作用
させると２９位のりシンと３０位のアラニンの結合が分
解されカルボキシ末端にリシンを有するアミノ酸２９個
からなるデスアラニンインシュリン（ＤＡＩ）が得られ
る。

次に本酵素の存在下Ｄ　Ａ　Ｉ　Ｋ　ｐ　Ｈ６，５の条
件でスレ芽二ンーＯｎｕｔを反応させるとりシンとスレ
オニンの間に新にベグチド結合が合成されヒトインシュ
リン−ＯＢｕ　　が得られる。

これを加水分解してヒトインシーリンを酵素化学的に合
成することが出来る。

しかし、これらに記載された方法はいずれも水溶性酵素
を使用する液相反応である企め得られたヒトインシーリ
ンと異質の蛋白でろ一本酵素を分離精製する必要があり
、もし精製が不十分である場合は、医薬品として人体に
投与した場合に異種蛋白による抗体の生成という免疫学
的な副作用を伴い、殊に長期間に連続的に投与する場合
は極めて重大な結果を惹起する恐れがある。

更に当然の如く分離精製には多大の労力と時間を要し、
又分離後の酵素は失活の為再使用に耐えないので高価な
酵素を製造バッチ毎に使い捨てることになりその経済的
損失は大なるものがある。

それ数本酵素を水不溶性の固定化酵素として使用すれば
、上に記した分離精製も必要でなく、又経済面からも優
位性を保ち得ることは明らかである。

酵素を固定化する方法としては、数多くの方法があるが
、次の５種に大別される。

（１）酵素を担体に共有結合させる方法、（２）酵素を
担体にイオン結合させる方法、（３）酵素を担体に吸着
させる方法、（４）酵素を架橋剤で架橋する方法、（５
）担体を重合させる際に酵素を包括させる方法がある。

この内、（１）酵素を担体に共有結合させる方法の場合
、酵素は共有結合によって担体と結合しているため、結
合力が強く、簡単に酵素が担体がら脱離するようなこと
はない。しかし反面、結合力が強いために、酵素タンパ
クの構造変化をもたらし、高活性の固定化酵素が得られ
ない事もある。

イオン結合法（２）及び吸着法（３）の場合、操作は簡
単であるが、酵素と担体との結合が十分でないので、酵
素が使用中に担体から脱離しやすい欠点がある。

架橋法（４）の場合、酵素と架橋剤との結合形成には、
比較的反応条件が激しくなるため、酵素の失活が１バ、
かつ固定化力か弱い場合が多い。

（５）の包括法の場合、水溶性物質に架橋剤や重合促進
剤を添加し、重合開始剤により又は光あるいは放射線等
の照射によりポリマーを形成させる時に、酵素を包括す
る方法であるが、操作が煩緒であり、かつ包括時の酵素
の失活が著しい。

酵素はポリマーの格子内に包括されているため、格子の
間隔が大きくなると酵素゛タン舅りが漏出する。

逆に格子間隔が小さすぎると基質の透過性が悪くなるた
め、酵素活性が低下する等の欠点を有する。

以上のようにいずれの固定化法も完全であるとはいえな
い。

しかしながら、先に述べたように、それぞれの酵素に適
した酵素の固定化が必要とされている。

リシルエンドペプチダーゼは、現在１で固定化素固定化
法の中にりフルエンドペプチダーゼの酵素活性を減する
ことなくこれを担体に固定化させ得る方法があることを
見出だし本発明を完成するに至った。

即ち、本発明は、アクロモバクタ−リティカスから産生
されるりフルエンドペプチダーゼ（）′クロモバクター
　グロテアーゼ１）を水イ＼溶性用体に結合させた固定
化酵素及び固定化されていない同酵素を架橋剤で架橋さ
せて水に俸溶な酵素１合体となした固定化酵素である。

以下に本発明について詳細に述べる。本発明に使用され
るリシルエンドベプチターゼの酵素水溶液の酵素濃度は
通常０．０１〜３０重量％に調整することが望ましい。

酵素濃度が少なすぎると、得られた固定化酵素の酵素活
性能が低く実用化に乏しくなる。

これに対し酵素濃度が多すぎると、酵素活性能は飽和し
経済性が劣りかつ反応中酵素の漏出が起こる。

一方、本発明に使用される担体としてはセルロース、ア
ガロース、デキストラン、カードラン等の多糖類が挙げ
られる。

これらの担体の活性化は、ブロムンア／を用いて次のよ
うにして行う。

担体を水に懸濁して充分にＩＩｌ潤させた後、プロムン
アン水溶液を添加し苛性ンーダるるいは苛性カリを用い
て、アルカリ性にｐＨを保ちながら、４０℃以下で反応
を行なわせるのが好ましい。

酵素と担体との結合に要する反応時間は、反応戴 温度に影響さ番る。が通常約１〜３０時間が選ばれる。

反応終了後、反応生成物をν取し、不要の付Ｘｉ物を除
去するため、ｐＨ緩衝液又は塩含有ｐ　１１緩術液にて
適宜洗滌する。

次に本固定化酵素は、酵素な担体にイオン結合させる方
法及び酵素を架橋剤で架橋する方法に１つでも得られる
ことが判った。

イオン結合法は、酵素のイオン的性質を利用してイオン
交換体に酵素をイオノ的に結合させるｈ法である。

担体としてはイオン交換セルロースやイオノ交換樹脂等
があるが、種々検討した結果、陽イオン交換体脂、陽イ
オン交換セルロースを用いル事ニよって本固定化酵素が
得られることがわがった。

陽イオン交換体を、稀アルカリ水溶液、水、及び稀塩酸
の順序で、それぞれ約１５倍量を用いて洗浄し、更に十
分量の水で洗′浄後、戸取する。

このようにして活性化された閘イオン交換体を、適当な
緩衝液に懸濁し、酵素溶液を加えイオン結合させる。

反応は短時間で速やかに進行するが、固定化収率を良く
するためには、長時間反応させた方がよく、一般には数
分から１５時間までが選ばれる。

イオン結合時の反応温間は４０℃以下が好ましい。

反応終了後、酵素担体生成物をテ取し、不要物を除去す
るため、適宜緩衝液等で洗浄する。

架橋法を用いる事によっても、本酵素を固定化すること
が出来た。

架橋剤としては、シッフ塩基を形成するグルタ＾アルデ
Ｌドの他に分子内に、二官能基を有する固定゛化剤、即
ちトルエンジイソノアナート、ヘキサメチレジジインシ
アナート、ヘキサメチレンジインチオノアナートなどの
イン／アン酸誘導体、ビスジアゾベノジジンやＮ、Ｎ’
−ポリメチレンビスマレイミドなどが本発明の目的にが
なっている事を見出し′た。

即ち、酵素溶液と数％のグルタルアルデヒド溶液とを混
合し、攪拌下反応させる。　−架橋剤の濃度は通常１〜
５％の水溶液として用高濃度の架橋剤を使用すると、急
激に反応が進み、酵素タンパクの立体構造が変化し酵素
が失活する原因になる。

又、架橋剤の濃度が低すぎる場合、反応が非常に遅くな
る欠点がある。

反応条件として、一般的に温度は３０℃す１で、反応時
間は１〜３０時間が好んで選ばれる。

反応終了後、沈澱物を遠心分離あるいはｐ過を行い、適
当な緩衝液などを用いて不要物を除去する。

こうして得られた固定化リシルエンドペプチダーゼは、
直ちに酵素反応に使用することも出来るし、又３０℃以
下で適当なｐＨ緩衝液中に保存することにより、適宜必
要に応じて使用することも出来る。

本発明により得られた固定化リシルエノドペフチダーゼ
は非常に高い活性を有し、かつ広範囲のｐＨ域あるいは
各種媒体中においても高い安定性を示した。

又、人畜に無害であることから食品化学、医薬品、臨床
化学及び生化学等の分野に利用することが出来る。

バッチ法で使用する場合、本固定化酵素と基質溶液とを
混合し、最適条件下で反応させた後、ｐ過あるいは遠心
分離により本固定化酵素を回収する。

このようにして回収された本固定化酵素は高い活性を保
持し、かつ反応中酵素が漏出する事が殆んど認められな
いため、何回でも繰り返し使用することが出来る。

一力、カラム等の容器に本固定化酵素を充填し、基質溶
液を通過させる方法により連続的に利用することも出来
る。

本固定化酵素はりアンのカルボキ／ル基側のペプチド結
合のみ特異的に作用し、これを加水分解するという特徴
ある基質特異性を有しているため、具体的にはアミノ酸
配列決定の際のペプチドの酵素分解、並びにリシルペプ
チドの分解および合成の目的に利用出来る。

以下に参考例及び実施例を挙げるが、本発明はこれらに
よって何ら制限されるものではない。

参考例１ セファロース４Ｂ　（ファルマシアｊｌＪ　）　　１．
３　ｍｌ（乾燥重量３３ｓ７）を洗滌後、１．３　ｍｌ
の純水に懸濁後、２５Ｗ／、％ブＯムシ７ｙ水溶液１．
４　ｍｌを加え、Ｏ，ＩＮカセイソーダによりｐＨを１
１に維持し、室温で１０分間反応させた。反応後固形物
をＦ取し０、ＩＭ冷重重ソウ水溶液洗浄し、次いでＯｏ
２５Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液ｐ　Ｈ８，５で十分洗浄
後、活性化セファロース４Ｂを得た。

参考例２ カードラフ２％水懸濁液１．７　ｍｌ　（乾燥重量３４
■）に、５ｖｊ／Ｉ％プロムンアン水溶液０．７　ｍｌ
を加え、反応液のｐＨが１１になるまでカセイノーダ水
溶液を、１分間当りｐＨが約０．５ずつ上昇する速度で
添加し、ｐＨが１１になってからｐＨを１１に保ちなが
ら５更に１５分間反応させた。反応後固形物を戸取し純
水で十分洗浄後、活性化カードラフゲルを得た。

実施例１ 参考例１で調整された活性化セファロース４Ｂの０．０
２５　Ｍホウ酸緩衝１８１．４　ｍｌと、リシルエンド
ペプチダーゼ１６８ｒｖ含有２　ｍ　Ｍ　）リス−塩酸
緩衝液０．９１ｊ／とを混合し、ｐ　Ｈ８，５又は１０
．２で攪拌下４℃で１．２．８．２４及び３０時間それ
ぞれ反応を行った。反応後固形物をＦ］ｆ２し、順次ホ
ウ酸ナトリウム緩衝液１０ｍ＋／、１Ｍ塩化ナトリウム
含有０．１Ｍホウ酸ナトリウム緩（ｌｉ液（ｐＨ８，５
）１０厘／Ｓ　１Ｍ塩化ナトリウム含有０．１　Ｍ酢酸
ナトリウム緩衝液（ｐ　Ｈ６，０）　　１０　ｍｌ　、
　　１．５％グリ７ン含肴０、ＩＭ重ノウ溶液１０ｍ／
、２ｍＭ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）２０ｍ／で
洗浄して固定化リンルエンドベブチダーゼを得た。かく
して得られた本固定化酵素のタンパク固定化率および活
性収率を表−１に示す。

１）酵素活性の測定 ０、２　Ｍ　１１−アミノ−２−メチル−１，３−プロ
パンジオール緩衝液（ｐＨＩ　Ｑ、ｓ）１．３：２１Ｌ
ｌに、固定化酵素ゲル０．０３　ｄを加え、３０℃予備
加温後、２０２、５　ｍ　Ｍ　ヘンゾイルリジンーＰ−
二°トロアニリド水溶液０．１５１７を加え、攪拌しな
がら１分間反応させる。反応後４５％酢酸水溶液Ｑ、　
５　ｍｌを加え反応を停止させ、たソちにガラスフィル
ターで吸引濾過し、Ｆ液を４０５ｎｍで測定する。１単
位は３０℃において１分間当り１μｍｏｌ＠　　のＰ−
ニトロアニリンを生成する酵素量である。

ｉｆタンパク固定化率（％） 水洗時のＦ液中のタンパク量の測定から、未吸着のタン
パクを算出し、固定化されたタン・ζり量を逆算した。

１１１）固定化した活性収率（％） ここで比活性とは固定化する前の本酵素の溶液を上記（
１）により測定し、タンパク量で除した値（％）である
。

表−１ 反応時のｐＨが８．５．１０．２のいずれの場合とも、
反応時間が長くなるに従い、タンパクの固定化率は上昇
し、反対に固定化した活性収率は減少している。ｐ　Ｈ
８，５に比べて、ｐ　Ｈ１０，２で反応した場合、タン
パクの固定化率は高かったけれども、固定化した活性収
率は逆Ｋ　ｐ　Ｈ８，５で反応させた場合の方が高かっ
た。このことは酵素が担体に多く結合する事によって、
ゲルの内部が密の状態になり、基質の透過性が悪くなる
ためではないかと考えられる。

実施例２ 参考例２に記載した方法で得られた活性化カードランゲ
ルを含有する０、　０２５　Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液
１．４１１１７とリンルエンドベプチダーゼ２．６８■
含有２ｍＭトリス塩酸緩衝液Ｑ、　９　ｍｌとを混合し
、ｐ　Ｈ８，５又は１０．０で攪拌下４℃で、１１８．
２４、及び３０時間それぞれ反応させた。反応終了後実
施例１に記載した方法と同様な処理を行い、カードラン
固定化リノルエンドペブチダーゼを得た。

かくして得られた本固定化酵素のタンパク固定化率及び
固定化した活性収率を表−２に示す。

表−２ タンパクの固定化率は参考例１に比して低いが、固定化
した活性収率はいずれの場合も高かった。

実施例１１および２で得られた本固定化酵素の至適ｐＨ
はいずれも１０．０〜１０．５付近であった。

アンバー２イトＣＧ−５０，１ｇ（乾燥型ｉｉ）を、０
．５Ｎ力セイソーダ水溶液３０Ｍ１１水３Ｑｒａｌ及び
０．５Ｎ塩酸３０Ｒ１の順序で、１０分間ずつ攪拌洗浄
し、ｐＨ試験紙にて中性になミまで更に水で洗浄後、１
０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝１　ｐ　Ｈ５，０で十分に平
衡化した。このようにして活性化さｔまたアンバーライ
トＣＧ−５０を１０ｍＭ酢酸すｉ・リウム緩衝液（ｐＨ
５，０）１０ｍ／に懸濁し、す／ルエンドベプチダーゼ
１〜含有１０ｍＭ酢酸＋１リウム緩衝液（ｐＨ５，０）
１ｍ／を加え、攪拌しながら４℃で１２時間反応させた
。反応終了後１’ＯｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐ　Ｈ
’５．０）　　２０Ｉ＋Ｉｔを用い５回洗浄し、固定化
リシルエンドベブチターゼｔ８ｇ　（湿重量）（タンパ
ク固定化率９７％、量定化した活性収率４８％）を得た
。

実施例４ リシルエンドペプチダーゼ１０■含有１０　ｍ　Ｍリン
酸緩衝液（ｐＨ７，２）５ｇ＋／と４％グルタルアルデ
ヒド含有１０　ｍ　Ｍ　’）ン酸緩衝液（ｐＨ７，２）
５　ｍ／とを混合し、攪拌下４℃で１５時間反応させた
後、析出した沈澱を遠心分離（８，０００ｒ　Ｐ’ｍ、
２０分）シ、固定化酵素を分離した。固定化酵素に付着
した不要物を１０ｍＭ！Ｊン酸緩衝液ｐ　Ｈ７，２で洗
浄後、固定化リンルエンドペブチダーゼ３　ｍｅ）（タ
ンパク固定化率３０％、固定化した活性収率２３％）を
得た。

３７４

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）アクロモバクタ−′リティカスから産生されるリ
   シルエンドペプチダーゼ（アクロモバクタ−プロテアー
   ゼＩ）を、水不溶性担体に結合させた固定化酵素。 （り水不溶性担体が多糖類である特許請求の範囲第１項
   記載の固定化酵素。 （３）水不溶性担体がイオン交換体である特許請求の範
   囲第１項記載の固定化酵素。 （４）アクロモバクタ−リティカスから産生されるリシ
   ルエンドペプチダーゼ（アクロモバクタ−プロテアーゼ
   ■）を、架橋剤で架橋させた固定化酵素。