JPH0215196B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

この発明はＬ−アスパルチル−Ｌ−フエニルア
ラニンメチルエステル（以下、APMと略す。）の
製造法に関す。 APMは、甘味剤として近年注目されているペ
プチドである。 APMの製造法としては、化学合成法と酵素的
合成法が知られている。 化学的合成法としては、Ｎ−保護のＬ−アスパ
ラギン酸無水物とＬ−フエニルアラニンメチルエ
ステル（以下、PMと略す。）を縮合させてＮ−
保護のAPMとし、その後保護基を除去する方法
があり、酵素合成法としては、Ｎ−保護のＬ−ア
スパラギン酸とPMに蛋白分解酵素を作用させて
Ｎ−保護のAPMあるいはＮ−保護のAPMのPM
付加物とし、その後、保護基を除去してAPMに
する方法が知られているが、両方法とも保護基の
導入、脱離が必要で工程が複雑となる。 また保護基を使用しないAPMの製造方法（特
開昭58−43793、昭和58年日本農芸化学大会要旨
集P42）も知られており、シユードモナス属、ア
ルカリゲネス属、トルロプシス属、ロドトルラ
属、スポロボロミセス属のいずれかを用いる微生
物的合成法であるが収率が非常に低く工業的な
APMの生産には必ずしも適していない。 本発明者らは、このような従来のAPMの製造
法に対し、より効率の良い方法を見い出すべく研
究した結果、微生物を用いる事によつてＬ−アス
パラギン酸とPMからAPMが直接、効率よく生
成する事を見い出した。 即ち、本発明は、アクロモバクター属、コリネ
バクテリウム属、キヤンデイダ属、エシエリヒア
属、フラボバクテリウム属、ジオトリクム属、ミ
クロコツカス属、パキソレン属、ザルチナ属、サ
ツカロミセス属、トリコスポロン属、キサントモ
ナス属、クルイヘロミセス属及びエンドミセス属
に属しＬ−アスパラギン酸とＬ−フエニルアラニ
ンメチルエステルを縮合してＬ−アスパルチル−
Ｌ−フエニルアラニンメチルエステルを生成する
能力を有する微生物をＬ−アスパラギン酸とＬ−
フエニルアラニンメチルエステルに作用せしめて
Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フエニルアラニンメチル
エステルを生成する事を特徴とするAPMの製造
方法である。 Ｌ−アスパラギン酸とPMを縮合してAPMを
生成する能力を有する微生物の作用により、水性
媒体中にてＬ−アスパラギン酸とPMを縮合して
APMに変換せしめる方法は水溶性媒体中にてＬ
−アスパラギン酸とPMと上記微生物の菌体、培
養液あるいは菌体処理物とを接触せしめれば良
い。 本発明において用いるＬ−アスパラギン酸と
PMを縮合してAPMに変換せしめる能力を有す
る微生物としては、例えば、

【表】 リ

【表】 ジエ
これらの微生物の菌体を得るには、通常の培地
を用いて、培養の始めから、あるいは培養の途中
でＬ−アスパラギン酸とPMを添加して培養すれ
ばよい。 本微生物の培養のために用いられる培地はＬ−
アスパラギン酸とPMを含むほかは通常の炭素
源、窒素源、無機イオンを含有する通常の培地で
ある。更にビタミン、アミノ酸等の有機微量栄養
素を添加すると望ましい結果が得られる場合が多
い。 炭素源としては、グルコース、シユクロース等
の炭水化物、酢酸等の有機酸、アルコール類、そ
の他が適宜使用される。窒素源としては、アンモ
ニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩、その
他が用いられる。無機イオンとしては、マグネシ
ウムイオン、燐酸イオン、カリイオン、鉄イオ
ン、その他が必要に応じ適宜使用される。 培養は好気的条件下に、PH４ないし８、温度25
ないし40℃の適当な範囲に制御しつつ１ないし10
日培養を行えば望ましい結果が得られる。 菌体としては、培養終了後の培養液そのまま、
培養液より分離された菌体、洗浄された菌体など
いずれも使用可能である。菌体処理物としては凍
結乾燥菌体、アセトン乾燥菌体、トルエン、界面
活性剤等と接触せしめた菌体、リゾチームで処理
した菌体、超音波にさらした菌体、機械的に摩砕
した菌体等のほか、これら菌体処理物から得られ
たＬ−アスパラギン酸とPMをAPMに変換せし
める酵素活性を有する酵素蛋白区分、更には、こ
れらの菌体の固定化物、菌体処理物の不溶化物、
その他いずれも使用できる。 水溶性媒体としては、水、バツフアーおよびエ
タノール等の有機溶媒を含むものが使用できる。
更に必要に応じて、微生物の生育に必要な栄養
素、抗酸化剤、界面活性剤、補酵素、ヒドロキシ
ルアミンおよび金属イオン等を水性媒体に添加す
ることもできる。 上記微生物の菌体を水溶性媒体中で培養しなが
ら、菌体とＬ−アスパラギン酸とPMを接触せし
めて作用せしめる場合には、Ｌ−アスパラギン酸
とPMを含み、かつ微生物の生育に必要な炭素
源、窒素源、無機イオンなどの栄養素を含む水性
媒体が用いられる。更にビタミン、アミノ酸等の
有機微量栄養素を添加すると望ましい結果が得ら
れる場合が多い。 炭素源としては、グルコース、シユクロース等
の炭水化物、酢酸等の有機酸、アルコール類、そ
の他が適宜使用される。窒素源としては、アンモ
ニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩、その
他が用いられる。無機イオンとしては、マグネシ
ウムイオン、燐酸イオン、カリイオン、鉄イオ
ン、その他が必要に応じ適宜使用される。 培養は好気的条件下に、PH４ないし８、温度25
ないし40℃の適当な範囲に制御しつつ行えば望ま
しい結果が得られる。 かくして１ないし10日間も培養を行えば、Ｌ−
アスパラギン酸とPMはAPMのみに効率よく変
換される。 これに対し、上記微生物の培養液をそのまま、
培養菌体あるいは菌体処理物をＬ−アスパラギン
酸およびPMと接触せしめて作用せしめる場合に
は、Ｌ−アスパラギン酸とPMと培養液、培養菌
体あるいは菌体処理物を溶解または懸濁した水性
媒体を10℃ないし70℃の適当な温度に調節しPHを
４ないし８に保ちつつ、暫時静置または撹拌すれ
ばよい。かくして５ないし100時間も経過すれば
水性媒体中に多量のAPMが生成蓄積される。 生成したAPMは、公知の分離方法により分離
精製する事ができる。生成したAPMはアミノ酸
アナライザーを用いて測定した。 実施例 １ グルコース2.0ｇ／dl、（NH₄）₂SO₄0.5ｇ／dl、
KH₂PO₄0.1ｇ／dl、K₂HPO₄0.1ｇ／dl、
MgSO₄・7H₂O0.05ｇ／dl、FeSO₄・7H₂O1mg／
dl、MnSO₄・4H₂O1mg／dl、酵母エキス1.0ｇ／
dl、マルツエキス0.5ｇ／dl、炭酸カルシウム4.0
ｇ／dl（別殺菌）を含む培地（PH7.0）を500ml容
フラスコに50ml入れ120℃で15分間殺菌した。 これにブイヨン寒天培地で30℃にて、24時間培
養した表３の微生物を１白金耳接種し、30℃で20
時間培養した。この培養液より菌体を遠心分離に
より採取し、培養液と同量の生理食塩水で１回洗
浄し、菌体を集めた。 これらの菌体を表１に示す反応液Ａに５ｇ／dl
になるように添加し（終末PH5.4、５ml）、37℃に
16時間保持反応した。 この時に生成したAPMをアミノ酸アナライザ
ーで測定し、その結果を表２に示した。

【表】

【表】 実施例 ２ 実施例１と同様に培養し、洗浄したフラボバク
テリウム・セワネンス AJ2476 FERM−Ｐ
7052 ５ｇを反応液A100mlに投入し、37℃、24時
間反応した。 この反応液を調製用TLCに帯状にSpotし、ｎ
−ブタノール：酢酸：水＝２：１：１の展開溶媒
で展開し、生成APMの部分をかきとり、蒸留水
で抽出後の反応生成物を結晶化させ560mgの結晶
を得た。この結晶の旋光度、融点、比旋光度を測
定した結果、反応液Ａよりの生成物はAPM標品
と完全に一致した。 実施例 ３ 実施例１と同様の培地を用いて30℃で12時間培
養したエシエリヒア・コリ AJ2606 FERM−Ｐ
7055の培養液中にＬ−アスパラギン酸５ｇと
PM10ｇを含む水溶液10ml（PH5.4に調製）を無菌
的に投入し、無菌的に培養液のPHを5.4に調製後、
更に10時間培養を行つた。培養中は２時間おきに
PHを5.4になるように無菌的に調製した。 この培養液中での生成物をアミノ酸アナライザ
ーで測定した結果、APMが320mg／dl生成してい
た。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ アクロモバクター属、コリネバクテリウム
   属、キヤンデイダ属、エシエリヒア属、フラボバ
   クテリウム属、ジオトリクム属、ミクロコツカス
   属、パキソレン属、ザルチナ属、サツカロミセス
   属、トリコスポロン属、キサントモナス属、クル
   イヘロミセス属及びエンドミセス属に属しＬ−ア
   スパラギン酸とＬ−フエニルアラニンメチルエス
   テルを縮合してＬ−アスパルチル−Ｌ−フエニル
   アラニンメチルエステルを生成する能力を有する
   微生物をＬ−アスパラギン酸とＬ−フエニルアラ
   ニンメチルエステルに作用せしめて、Ｌ−アスパ
   ルチル−Ｌ−フエニルアラニンメチルエステルを
   生成する事を特徴とするＬ−アスパルチル−Ｌ−
   フエニルアラニンメチルエステルの製造方法。