JPH0362399B2 - - Google Patents
Info
- Publication number
- JPH0362399B2 JPH0362399B2 JP15668784A JP15668784A JPH0362399B2 JP H0362399 B2 JPH0362399 B2 JP H0362399B2 JP 15668784 A JP15668784 A JP 15668784A JP 15668784 A JP15668784 A JP 15668784A JP H0362399 B2 JPH0362399 B2 JP H0362399B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- phenylalanine
- methyl ester
- apm
- aspartic acid
- phenylalanine methyl
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired
Links
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 32
- VSDUZFOSJDMAFZ-VIFPVBQESA-N methyl L-phenylalaninate Chemical compound COC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 VSDUZFOSJDMAFZ-VIFPVBQESA-N 0.000 claims description 24
- 229960005190 phenylalanine Drugs 0.000 claims description 20
- CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N D-OH-Asp Natural products OC(=O)C(N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 19
- CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N L-Aspartic acid Natural products OC(=O)[C@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N 0.000 claims description 19
- 229960005261 aspartic acid Drugs 0.000 claims description 19
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 18
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 15
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 5
- YZQCXOFQZKCETR-UWVGGRQHSA-N Asp-Phe Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 YZQCXOFQZKCETR-UWVGGRQHSA-N 0.000 claims description 3
- 241000186063 Arthrobacter Species 0.000 claims 1
- 241000186146 Brevibacterium Species 0.000 claims 1
- 241000186321 Cellulomonas Species 0.000 claims 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 claims 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 claims 1
- 150000004702 methyl esters Chemical class 0.000 claims 1
- IAOZJIPTCAWIRG-QWRGUYRKSA-N aspartame Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)OC)CC1=CC=CC=C1 IAOZJIPTCAWIRG-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 28
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 24
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 21
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 19
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 9
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 8
- 238000000034 method Methods 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 7
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 7
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- -1 N-protected L-aspartic acid anhydride Chemical class 0.000 description 4
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 4
- 229910001410 inorganic ion Inorganic materials 0.000 description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 4
- 241000185996 Arthrobacter citreus Species 0.000 description 3
- 235000012539 Bacterium linens Nutrition 0.000 description 3
- 241000186310 Brevibacterium linens Species 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 3
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 2
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N iron Substances [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 2
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 2
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 2
- 239000011785 micronutrient Substances 0.000 description 2
- 235000013369 micronutrients Nutrition 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 2
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910001414 potassium ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 2
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 2
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 2
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 2
- DEXFNLNNUZKHNO-UHFFFAOYSA-N 6-[3-[4-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]piperidin-1-yl]-3-oxopropyl]-3H-1,3-benzoxazol-2-one Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)C1CCN(CC1)C(CCC1=CC2=C(NC(O2)=O)C=C1)=O DEXFNLNNUZKHNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 241000588986 Alcaligenes Species 0.000 description 1
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 description 1
- 241000186220 Cellulomonas flavigena Species 0.000 description 1
- AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N Hydroxylamine Chemical compound ON AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 125000000570 L-alpha-aspartyl group Chemical group [H]OC(=O)C([H])([H])[C@]([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 241000223252 Rhodotorula Species 0.000 description 1
- 241000222068 Sporobolomyces <Sporidiobolaceae> Species 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000005515 coenzyme Substances 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012746 preparative thin layer chromatography Methods 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 1
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
この発明はＬ−アスパルチル−Ｌ−フエニルア
ラニン（以下、APと略す。）及びＬ−アスパルチ
ル−Ｌ−フエニルアラニンメチルエステル（以
下、APMと略す。）の製造法に関する。 APMは、甘味剤として近年注目されているペ
プチドである。 APMの製造法としては、化学合成法と酵素的
合成法が知られている。 化学的合成法としては、Ｎ−保護のＬ−アスパ
ラギン酸無水物とＬ−フエニルアラニンメチルエ
ステルを縮合させてＮ−保護のAPMとし、その
後保護基を除去する方法があり、酵素合成法とし
ては、Ｎ−保護のＬ−アスパラギン酸とＬ−フエ
ニルアラニンメチルエステルに蛋白分解酵素を作
用させてＮ−保護のAPMあるいはＮ−保護の
APMのＬ−フエニルアラニンメチルエステル付
加物とし、その後、保護基を除去してAPMにす
る方法が知られているが、両方法とも保護基の導
入、脱離が必要で工程が複雑となる。 また保護基を使用しないAPMの製造方法（特
開昭58−43793、特開昭58−63394、特開昭58−
126796、昭和58年日本農芸化学大会要旨集P42）
も知られており、シユードモナス属、アルカリゲ
ネス属、トルロプシス属、ロドトルラ層、スポロ
ボロミセス属のいずれかを用いる微生物的合成法
であるが、収率が非常に低く工業的なAPMの生
産には必ずしも適していない。 本発明者らは、このような従来のAPM又はそ
の原料であるAPの製造法に対し、より効率の良
い方法を見い出すべく研究した結果、微生物を用
いる事によつてＬ−アスパラギン酸とＬ−フエニ
ルアラニン又はＬ−フエニルアラニンメチルエス
テルからAP又はAPMが直接、効率よく生成する
事を見い出した。 即ち、本発明は、アルスロバクター属、セルロ
モナス属及びブレビバクテリウム属に属しＬ−ア
スパラギン酸とＬ−−フエニルアラニン又はＬ−
フエニルアラニンメチルエステルを縮合してＬ−
アスパルチル−Ｌ−フエニルアラニン又はＬ−ア
スパルチル−Ｌ−フエニルアラニンメチルエステ
ルを生成する能力を有する微生物を、Ｌ−アスパ
ラギン酸とＬ−フエニルアラニン又はＬ−フエニ
ルアラニンメチルエステルに作用せしめて、Ｌ−
アスパルチル−Ｌ−フエニルアラニン又はＬ−ア
スパルチル−Ｌ−フエニルアラニンメチルエステ
ルを生成する事を特徴とするAP又はAPMの製造
方法である。 Ｌ−アスパラギン酸とＬ−フエニルアラニン又
はＬ−フエニルアラニンメチルエステルを縮合し
てAP又はAPMを生成する能力を有する微生物の
作用により、水性媒体中にてＬ−アスパラギン酸
とＬ−フエニルアラニン又はＬ−フエニルアラニ
ンメチルエステルを縮合してAP又はAPMに変換
せしめる方法は、水溶性媒体中にてＬ−アスパラ
ギン酸とＬ−フエニルアラニン又はＬ−フエニル
アラニンメチルエステルと上記微生物の菌体、培
養液あるいは菌体処理物とを接触せしめれば良
い。 本発明において用いるＬ−アスパラギン酸とＬ
−フエニルアラニン又はＬ−フエニルアラニンメ
チルエステルを縮合してAP又はAPMに変換せし
める能力を有する微生物としては、例えば、 アルスロバクター・シトレウス ATCC11624 セルロモナス・フラビゲナ ATCC8183 ブレビバクテリウム・リネンス ATCC8377 が挙げられる。 これらの微生物の菌体を得るには、通常の培地
を用いて、培養の始めから、あるいは培養の途中
でＬ−アスパラギン酸とＬ−フエニルアラニン又
はＬ−フエニルアラニンメチルエステルを添加し
て培養すればよい。 本微生物の培養のために用いられる培地は、Ｌ
−アスパラギン酸とＬ−フエニルアラニン又はＬ
−フエニルアラニンメチルエステルを含むほかは
通常の炭素源、窒素源、無機イオンを含有する通
常の培地である。更にビタミン、アミノ酸等の有
機微量栄養素を添加すると望ましい結果が得られ
る場合が多い。 炭素源としては、グルコース、シユクロース等
の炭水化物、酢酸等の有機酸、アルコール類、そ
の他が適宜使用される。窒素源としては、アンモ
ニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩、その
他が用いられる。無機イオンとしては、マグネシ
ウムイオン、燐酸イオン、カリイオン、鉄イオ
ン、その他が必要に応じ適宜使用される。 培養は好気的条件下に、PH４ないし８、温度25
ないし40℃の適当な範囲に制御しつつ１ないし10
日培養を行えば望ましい結果が得られる。 菌体としては、培養終了後の培養液そのまま、
培養液より分離された菌体、洗浄された菌体など
いずれも使用可能である。菌体処理物としては凍
結乾燥菌体、アセトン乾燥菌体、トルエン、界面
活性剤等の接触せしめた菌体、リゾチームで処理
した菌体、超音波にさらした菌体、機械的に摩砕
した菌体等のほか、これら菌体処理物から得られ
たＬ−アスパラギン酸とＬ−フエニルアラニン又
はＬ−フエニルアラニンメチルエステルをAP又
はAPMに変換せしめる酵素活性を有する酵素蛋
白区分、更には、これらの菌体の固定化物、菌体
処理物の不溶化物、その他いずれも使用できる。 水溶液媒体としては、水、バツフアーおよびエ
タノール等の有機溶媒を含むものが使用できる。
更に必要に応じて、微生物の生育に必要な栄養
素、抗酸化剤、界面活性剤、補酵素、ヒドロキシ
ルアミンおよび金属イオン等を水性媒体に添加す
ることもできる。 上記微生物の菌体を水溶性媒体中で培養しなが
ら、菌体とＬ−アスパラギン酸とＬ−フエニルア
ラニン又はＬ−フエニルアラニンメチルエステル
を接触せしめて作用せしめる場合には、Ｌ−アス
パラギン酸とＬ−フエニルアラニン又はＬ−フエ
ニルアラニンメチルエステルを含み、かつ微生物
の生育に必要な炭素源、窒素源、無機イオンなど
の栄養素を含む水性媒体が用いられる。更にビタ
ミン、アミノ酸等の有機微量栄養素を添加すると
望ましい結果が得られる場合が多い。 炭素源としては、グルコース、シユクロース等
の炭水化物、酢酸等の有機酸、アルコール類、そ
の他が適宜使用される。窒素源としては、アンモ
ニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩、その
他が用いられる。無機イオンとしては、マグネシ
ウムイオン、燐酸イオン、カリイオン、鉄イオ
ン、その他が必要に応じ適宜使用される。 培養は好気的条件下に、PH４ないし８、温度25
ないし40℃の適当な範囲に制御しつつ行えば望ま
しい結果が得られる。 かくして１ないし10日間も培養を行えば、Ｌ−
アスパラギン酸とＬ−フエニルアラニン又はＬ−
フエニルアラニンメチルエステルはAP又はAPM
のみに効率がよく変換される。 これに対し、上記微生物の培養液をそのまま、
培養菌体あるいは菌体処理物を、Ｌ−アスパラギ
ン酸およびＬ−フエニルアラニン又はＬ−フエニ
ルアラニンメチルエステルと接触せしめて作用せ
しめる場合には、Ｌ−アスパラギン酸とＬ−フエ
ニルアラニン又はＬ−フエニルアラニンメチルエ
ステルと培養液、培養菌体あるいは菌体処理物を
溶解または懸濁した水性媒体を10℃ないし70℃の
適当な温度に調節しPHを４ないし８に保ちつつ、
暫時静置または攪拌すればよい。かくして５ない
し100時間も経過すれば水性媒体中に多量のAP又
はAPMが生成蓄積される。 生成したAP又はAPMは、公知の分離方法によ
り分離精製することができる。生成したAP又は
APMはアミノ酸アナライザーを用いて測定した。 実施例 １ グルコース2.0ｇ／dl、（NH4）2SO40.5ｇ／dl、
KH2PO40.1ｇ／dl、MgSO4・7H2O0.05ｇ／dl、
FeSO4・7H2O1mg／dl、MnSO4・4H2O1mg／dl、
酵母エキス1.0ｇ／dl、マルツエキス0.5ｇ／dl、
炭酸カルシウム4.0ｇ／dl（別殺菌）を含む培地
（PH7.0）を500ml容フラスコに50ml入れ120℃で15
分間殺菌した。 これにブイヨン寒天培地で30℃にて、24時間培
養した表３の微生物を１白金耳接種し、30℃で20
時間培養した。この培養液より菌体を遠心分離に
より採取し、培養液と同量の生理食塩水で１回洗
浄し、菌体を集めた。 これらの菌体を表１に示す反応液Ａに５ｇ／dl
になるように添加し（終末PH5.4、５ml）、37℃に
16時間保持反応した。この時に生成したAPMを
アミノ酸アナライザーで測定し、その結果を表２
に示した。
ラニン（以下、APと略す。）及びＬ−アスパルチ
ル−Ｌ−フエニルアラニンメチルエステル（以
下、APMと略す。）の製造法に関する。 APMは、甘味剤として近年注目されているペ
プチドである。 APMの製造法としては、化学合成法と酵素的
合成法が知られている。 化学的合成法としては、Ｎ−保護のＬ−アスパ
ラギン酸無水物とＬ−フエニルアラニンメチルエ
ステルを縮合させてＮ−保護のAPMとし、その
後保護基を除去する方法があり、酵素合成法とし
ては、Ｎ−保護のＬ−アスパラギン酸とＬ−フエ
ニルアラニンメチルエステルに蛋白分解酵素を作
用させてＮ−保護のAPMあるいはＮ−保護の
APMのＬ−フエニルアラニンメチルエステル付
加物とし、その後、保護基を除去してAPMにす
る方法が知られているが、両方法とも保護基の導
入、脱離が必要で工程が複雑となる。 また保護基を使用しないAPMの製造方法（特
開昭58−43793、特開昭58−63394、特開昭58−
126796、昭和58年日本農芸化学大会要旨集P42）
も知られており、シユードモナス属、アルカリゲ
ネス属、トルロプシス属、ロドトルラ層、スポロ
ボロミセス属のいずれかを用いる微生物的合成法
であるが、収率が非常に低く工業的なAPMの生
産には必ずしも適していない。 本発明者らは、このような従来のAPM又はそ
の原料であるAPの製造法に対し、より効率の良
い方法を見い出すべく研究した結果、微生物を用
いる事によつてＬ−アスパラギン酸とＬ−フエニ
ルアラニン又はＬ−フエニルアラニンメチルエス
テルからAP又はAPMが直接、効率よく生成する
事を見い出した。 即ち、本発明は、アルスロバクター属、セルロ
モナス属及びブレビバクテリウム属に属しＬ−ア
スパラギン酸とＬ−−フエニルアラニン又はＬ−
フエニルアラニンメチルエステルを縮合してＬ−
アスパルチル−Ｌ−フエニルアラニン又はＬ−ア
スパルチル−Ｌ−フエニルアラニンメチルエステ
ルを生成する能力を有する微生物を、Ｌ−アスパ
ラギン酸とＬ−フエニルアラニン又はＬ−フエニ
ルアラニンメチルエステルに作用せしめて、Ｌ−
アスパルチル−Ｌ−フエニルアラニン又はＬ−ア
スパルチル−Ｌ−フエニルアラニンメチルエステ
ルを生成する事を特徴とするAP又はAPMの製造
方法である。 Ｌ−アスパラギン酸とＬ−フエニルアラニン又
はＬ−フエニルアラニンメチルエステルを縮合し
てAP又はAPMを生成する能力を有する微生物の
作用により、水性媒体中にてＬ−アスパラギン酸
とＬ−フエニルアラニン又はＬ−フエニルアラニ
ンメチルエステルを縮合してAP又はAPMに変換
せしめる方法は、水溶性媒体中にてＬ−アスパラ
ギン酸とＬ−フエニルアラニン又はＬ−フエニル
アラニンメチルエステルと上記微生物の菌体、培
養液あるいは菌体処理物とを接触せしめれば良
い。 本発明において用いるＬ−アスパラギン酸とＬ
−フエニルアラニン又はＬ−フエニルアラニンメ
チルエステルを縮合してAP又はAPMに変換せし
める能力を有する微生物としては、例えば、 アルスロバクター・シトレウス ATCC11624 セルロモナス・フラビゲナ ATCC8183 ブレビバクテリウム・リネンス ATCC8377 が挙げられる。 これらの微生物の菌体を得るには、通常の培地
を用いて、培養の始めから、あるいは培養の途中
でＬ−アスパラギン酸とＬ−フエニルアラニン又
はＬ−フエニルアラニンメチルエステルを添加し
て培養すればよい。 本微生物の培養のために用いられる培地は、Ｌ
−アスパラギン酸とＬ−フエニルアラニン又はＬ
−フエニルアラニンメチルエステルを含むほかは
通常の炭素源、窒素源、無機イオンを含有する通
常の培地である。更にビタミン、アミノ酸等の有
機微量栄養素を添加すると望ましい結果が得られ
る場合が多い。 炭素源としては、グルコース、シユクロース等
の炭水化物、酢酸等の有機酸、アルコール類、そ
の他が適宜使用される。窒素源としては、アンモ
ニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩、その
他が用いられる。無機イオンとしては、マグネシ
ウムイオン、燐酸イオン、カリイオン、鉄イオ
ン、その他が必要に応じ適宜使用される。 培養は好気的条件下に、PH４ないし８、温度25
ないし40℃の適当な範囲に制御しつつ１ないし10
日培養を行えば望ましい結果が得られる。 菌体としては、培養終了後の培養液そのまま、
培養液より分離された菌体、洗浄された菌体など
いずれも使用可能である。菌体処理物としては凍
結乾燥菌体、アセトン乾燥菌体、トルエン、界面
活性剤等の接触せしめた菌体、リゾチームで処理
した菌体、超音波にさらした菌体、機械的に摩砕
した菌体等のほか、これら菌体処理物から得られ
たＬ−アスパラギン酸とＬ−フエニルアラニン又
はＬ−フエニルアラニンメチルエステルをAP又
はAPMに変換せしめる酵素活性を有する酵素蛋
白区分、更には、これらの菌体の固定化物、菌体
処理物の不溶化物、その他いずれも使用できる。 水溶液媒体としては、水、バツフアーおよびエ
タノール等の有機溶媒を含むものが使用できる。
更に必要に応じて、微生物の生育に必要な栄養
素、抗酸化剤、界面活性剤、補酵素、ヒドロキシ
ルアミンおよび金属イオン等を水性媒体に添加す
ることもできる。 上記微生物の菌体を水溶性媒体中で培養しなが
ら、菌体とＬ−アスパラギン酸とＬ−フエニルア
ラニン又はＬ−フエニルアラニンメチルエステル
を接触せしめて作用せしめる場合には、Ｌ−アス
パラギン酸とＬ−フエニルアラニン又はＬ−フエ
ニルアラニンメチルエステルを含み、かつ微生物
の生育に必要な炭素源、窒素源、無機イオンなど
の栄養素を含む水性媒体が用いられる。更にビタ
ミン、アミノ酸等の有機微量栄養素を添加すると
望ましい結果が得られる場合が多い。 炭素源としては、グルコース、シユクロース等
の炭水化物、酢酸等の有機酸、アルコール類、そ
の他が適宜使用される。窒素源としては、アンモ
ニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩、その
他が用いられる。無機イオンとしては、マグネシ
ウムイオン、燐酸イオン、カリイオン、鉄イオ
ン、その他が必要に応じ適宜使用される。 培養は好気的条件下に、PH４ないし８、温度25
ないし40℃の適当な範囲に制御しつつ行えば望ま
しい結果が得られる。 かくして１ないし10日間も培養を行えば、Ｌ−
アスパラギン酸とＬ−フエニルアラニン又はＬ−
フエニルアラニンメチルエステルはAP又はAPM
のみに効率がよく変換される。 これに対し、上記微生物の培養液をそのまま、
培養菌体あるいは菌体処理物を、Ｌ−アスパラギ
ン酸およびＬ−フエニルアラニン又はＬ−フエニ
ルアラニンメチルエステルと接触せしめて作用せ
しめる場合には、Ｌ−アスパラギン酸とＬ−フエ
ニルアラニン又はＬ−フエニルアラニンメチルエ
ステルと培養液、培養菌体あるいは菌体処理物を
溶解または懸濁した水性媒体を10℃ないし70℃の
適当な温度に調節しPHを４ないし８に保ちつつ、
暫時静置または攪拌すればよい。かくして５ない
し100時間も経過すれば水性媒体中に多量のAP又
はAPMが生成蓄積される。 生成したAP又はAPMは、公知の分離方法によ
り分離精製することができる。生成したAP又は
APMはアミノ酸アナライザーを用いて測定した。 実施例 １ グルコース2.0ｇ／dl、（NH4）2SO40.5ｇ／dl、
KH2PO40.1ｇ／dl、MgSO4・7H2O0.05ｇ／dl、
FeSO4・7H2O1mg／dl、MnSO4・4H2O1mg／dl、
酵母エキス1.0ｇ／dl、マルツエキス0.5ｇ／dl、
炭酸カルシウム4.0ｇ／dl（別殺菌）を含む培地
（PH7.0）を500ml容フラスコに50ml入れ120℃で15
分間殺菌した。 これにブイヨン寒天培地で30℃にて、24時間培
養した表３の微生物を１白金耳接種し、30℃で20
時間培養した。この培養液より菌体を遠心分離に
より採取し、培養液と同量の生理食塩水で１回洗
浄し、菌体を集めた。 これらの菌体を表１に示す反応液Ａに５ｇ／dl
になるように添加し（終末PH5.4、５ml）、37℃に
16時間保持反応した。この時に生成したAPMを
アミノ酸アナライザーで測定し、その結果を表２
に示した。
【表】
【表】
実施例 ２
実施例１と同様に培養し、洗浄したアルスロバ
クター・シトレウスATCC11624 ５ｇを反応液
A100mlに投入し、37℃、24時間反応した。 この反応液を調整用TLCに帯状にSpotし、ｎ
−ブタノール：酢酸：水＝２：１：１の展開溶媒
で展開し、生成APMの部分をかきとり、蒸溜水
で抽出後の反応生成物を結晶化させ552mgの結晶
を得た。この結晶の旋光度、融点、比旋光度を測
定した結果、反応液Ａよりの生成物はAPM標品
と完全に一致した。 実施例 ３ 実施例１と同様の培地を用いて30℃で12時間培
養したブレビバクテリウム・リネンスATCC8377
の培養液中にＬ−アスパラギン酸５ｇとＬ−フエ
ニルアラニンメチルエステル10ｇを含む水溶液10
ml（PH5.4に調製）を無菌的に投入し、無菌的に
培養液のPHを5.4に調製後、更に10時間培養を行
つた。培養中は２時間おきにPHを5.4になるよう
に無菌的に調製した。 この培養液中での生成物をアミノ酸アナライザ
ーで測定した結果、APMが315mg／dl生成してい
た。 実施例 ４ 実施例１と同様に培養し、清浄した表４の微生
物の菌体を表３に示す反応液Ｂに５ｇ／dlになる
様に添加し（終末PH5.4、５ml）、37℃に16時間、
保持反応した。この時に生成したAPをアミノ
酸・アナライザーで測定し、その結果を表４に示
した。
クター・シトレウスATCC11624 ５ｇを反応液
A100mlに投入し、37℃、24時間反応した。 この反応液を調整用TLCに帯状にSpotし、ｎ
−ブタノール：酢酸：水＝２：１：１の展開溶媒
で展開し、生成APMの部分をかきとり、蒸溜水
で抽出後の反応生成物を結晶化させ552mgの結晶
を得た。この結晶の旋光度、融点、比旋光度を測
定した結果、反応液Ａよりの生成物はAPM標品
と完全に一致した。 実施例 ３ 実施例１と同様の培地を用いて30℃で12時間培
養したブレビバクテリウム・リネンスATCC8377
の培養液中にＬ−アスパラギン酸５ｇとＬ−フエ
ニルアラニンメチルエステル10ｇを含む水溶液10
ml（PH5.4に調製）を無菌的に投入し、無菌的に
培養液のPHを5.4に調製後、更に10時間培養を行
つた。培養中は２時間おきにPHを5.4になるよう
に無菌的に調製した。 この培養液中での生成物をアミノ酸アナライザ
ーで測定した結果、APMが315mg／dl生成してい
た。 実施例 ４ 実施例１と同様に培養し、清浄した表４の微生
物の菌体を表３に示す反応液Ｂに５ｇ／dlになる
様に添加し（終末PH5.4、５ml）、37℃に16時間、
保持反応した。この時に生成したAPをアミノ
酸・アナライザーで測定し、その結果を表４に示
した。
【表】
【表】
実施例 ５
実施例１と同様に培養し、洗浄したアルスロバ
クター・シトレウスATCC11624 ５ｇを反応液
B100mlに投入し、37℃、24時間反応した。 この反応液を調製用TLCに帯状にSpotし、ｎ
−ブタノール：酢酸：水＝２：１：１の展開溶媒
で展開し、生成APの部分をかきとり、蒸留水で
抽出後の反応生成物を結晶化させ、243mgの結晶
を得た。この結晶の旋光度、融点、比旋光度を測
定した結果、生成物はAP標品と完全に一致した。 実施例 ６ 実施例１と同様の培地を用いて、30℃で12時間
培養したブレビバクテリウム・リネンス
ATCC8377の培養液中にＬ−アスパラギン酸５
ｇ／dlとＬ−フエニルアラニン７ｇを含む水溶液
10ml（PH5.4に調製）を無菌的に投入し、無菌的
に培養液のPHを5.4に調製後、更に10時間培養を
行つた。培養中は、２時間おきにPHを5.4になる
様に無菌的に調製した。 この培養液中での生成物をアミノ酸アナライザ
ーで測定した結果、APが176mg／dl生成してい
た。
クター・シトレウスATCC11624 ５ｇを反応液
B100mlに投入し、37℃、24時間反応した。 この反応液を調製用TLCに帯状にSpotし、ｎ
−ブタノール：酢酸：水＝２：１：１の展開溶媒
で展開し、生成APの部分をかきとり、蒸留水で
抽出後の反応生成物を結晶化させ、243mgの結晶
を得た。この結晶の旋光度、融点、比旋光度を測
定した結果、生成物はAP標品と完全に一致した。 実施例 ６ 実施例１と同様の培地を用いて、30℃で12時間
培養したブレビバクテリウム・リネンス
ATCC8377の培養液中にＬ−アスパラギン酸５
ｇ／dlとＬ−フエニルアラニン７ｇを含む水溶液
10ml（PH5.4に調製）を無菌的に投入し、無菌的
に培養液のPHを5.4に調製後、更に10時間培養を
行つた。培養中は、２時間おきにPHを5.4になる
様に無菌的に調製した。 この培養液中での生成物をアミノ酸アナライザ
ーで測定した結果、APが176mg／dl生成してい
た。
Claims (1)
- １ アルスロバクター属、セルロモナス属及びブ
レビバクテリウム属に属しＬ−アスパラギン酸と
Ｌ−フエニルアラニン又はＬ−フエニルアラニン
メチルエステルを縮合してＬ−アスパルチル−Ｌ
−フエニルアラニン又はＬ−アスパルチル−Ｌ−
フエニルアラニンメチルエステルを生成する能力
を有する微生物を、Ｌ−アスパラギン酸とＬ−フ
エニルアラニン又はＬ−フエニルアラニンメチル
エステルに作用せしめて、Ｌ−アスパルチル−Ｌ
−フエニルアラニン又はＬ−アスパルチル−Ｌ−
フエニルアラニンメチルエステルを生成させる事
を特徴とするＬ−アスパルチル−Ｌ−フエニルア
ラニン又はそのメチルエステルの製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15668784A JPS6135797A (ja) | 1984-07-27 | 1984-07-27 | Ｌ−アスパルチル−ｌ−フエニルアラニン又はそのメチルエステルの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15668784A JPS6135797A (ja) | 1984-07-27 | 1984-07-27 | Ｌ−アスパルチル−ｌ−フエニルアラニン又はそのメチルエステルの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6135797A JPS6135797A (ja) | 1986-02-20 |
| JPH0362399B2 true JPH0362399B2 (ja) | 1991-09-25 |
Family
ID=15633130
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP15668784A Granted JPS6135797A (ja) | 1984-07-27 | 1984-07-27 | Ｌ−アスパルチル−ｌ−フエニルアラニン又はそのメチルエステルの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6135797A (ja) |
-
1984
- 1984-07-27 JP JP15668784A patent/JPS6135797A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6135797A (ja) | 1986-02-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4080259A (en) | Process of preparing L and D α-amino acids by enzyme treatment of DL-α-amino acid amide | |
| EP0124313B1 (en) | Process for the production of l-aspartyl-l-phenylalanine methyl ester or l-aspartyl-l-phenylalanine | |
| JPH0559709B2 (ja) | ||
| US4506011A (en) | Process for preparation of aspartylphenylalanine alkyl esters | |
| EP0154472B1 (en) | Process for the production of l-aspartyl-l-phenylalanine ester | |
| US5783428A (en) | Method of producing fumaric acid | |
| JPH0215196B2 (ja) | ||
| JPH0362399B2 (ja) | ||
| KR950005424B1 (ko) | L-아스파르틸-l-페닐알라닌 및 그의 디케토피페라진의 제조 방법 | |
| EP0220028B1 (en) | Process for producing l-aspartyl-l-phenylalanine and its diketopiperazine | |
| EP0102529B1 (en) | Process for preparation of aspartylphenylalanine alkyl esters | |
| JPH0362398B2 (ja) | ||
| JPH0215195B2 (ja) | ||
| EP0269390B1 (en) | Enzymatic l-aspartyl-l-phenylalanine alkyl ester production | |
| JPH046357B2 (ja) | ||
| JPS63185395A (ja) | Ｌ−アスパルチル−ｌ−フエニルアラニンメチルエステルの製法 | |
| US5179009A (en) | Process for producing L-aspartyl-L-phenylalanine and its diketopiperazine | |
| US4877734A (en) | Microbiologically produced α-acetylamino cinnamic acid acylase, method of its production and its use | |
| JPH0424994B2 (ja) | ||
| JPS60156394A (ja) | Ｌ−２−アミノ−４−フエニル酪酸の製法 | |
| JPS58116692A (ja) | スレオニン混合物からのｌ−スレオニン取得方法 | |
| JPH0870878A (ja) | トロポロニルアラニンの製造法 | |
| JPS6062998A (ja) | Ｌ−アスパルチル−ｌ−フエニルアラニンメチルエステルの製造法 | |
| JPS6151879B2 (ja) | ||
| JPS615793A (ja) | Ｄ−アスパラギン酸の製法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |