JPH046357B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

この発明はＬ−アスパルチル−Ｌ−フエニルア
ラニンの、炭素数２以上のアルコールエステルあ
るいは置換もしくは無置換フエノールエステルの
製造法に関する。 アスパルチルフエニルアラニンのアルコールエ
ステルは、甘味剤として近年注目されているペプ
チドであり、アスパルチルフエニルアラニンメチ
ルエステル（以下APMと略す）が代表的なもの
として知られている。 APMの製造法としては、化学合成法と酵素的
合成法が知られている。 化学的合成法としては、Ｎ−保護のＬ−アスパ
ラギン酸無水物とＬ−フエニルアラニンメチルエ
ステル（以下、PMと略す）を縮合させてＮ−保
護のAPMとし、その後保護基を除去する方法が
あり、酵素合成法としては、Ｎ−保護のＬ−アス
パラギン酸とPMに蛋白分解酵素を作用させてＮ
−保護のAPMあるいはＮ−保護のAPMのPM付
加物とし、その後、保護基を除去してAPMにす
る方法が知られているが、両方法とも保護基の導
入、脱離が必要で工程が複雑となる。 また保護基を使用しないAPMの製造方法（特
開昭58−126796、昭和58年日本農芸化学大会要旨
集P42）も知られており、シユードモナス属、ア
ルカリゲネス属、トルロプシス属、ロドトルラ
属、スポロボロミセス属のいずれかを用いる微生
物的合成法であるが収率が非常に低く工業的な
APMの生産には必ずしも適していない。 また本発明者らは、微生物を用いる事によつて
Ｌ−アスパラギン酸とPMからAPMが直接、効
率よく生成する事を見い出している（特願昭58−
75559）。 しかし、これら保護基を使用しないＬ−アスパ
ラギン酸を用いたアスパルチルフエニルアラニン
アルキルエステルの製造法の難点は、これらの反
応が、平衡反応であるため、基質を収率よくアス
パルチルフエニルアラニンアルキルエステルに変
換できないことであつた。 本発明者らは、このような従来のアスパルチル
フエニルアラニンアルキルエステルの製造法に対
し、フエニルアラニンのエステルとして炭素数２
以上のアルコールエステルあるいは置換もしくは
無置換フエノールエステル（以下PRと略す。）を
用いて、微生物を作用させると、生成されたアス
パルチルフエニルアラニンの、炭素数２以上のア
ルコールエステルあるいは、置換もしくは無置換
フエノールエステル（以下APRと略す。）の溶解
度が低いため反応系外に除かれ、収率良くAPR
が生成されることを見い出し、本研究を完成させ
るに至つた。これら、APRは、このままでも甘
味剤としての用途が期待されるばかりでなく、エ
ステル交換（方法の如何を問わない）等により
APMを、合成するための、原料としても利用で
きる。 即ち、本発明は、アクロモバクター属、コリネ
バクテリウム属、キヤンデイダ属、エシエリヒア
属、フラボバクテリウム属、ジオトリクム属、ミ
クロコツカス属、パキソレン属、ザルチナ属、サ
ツカロミセス属、トリコスポロン属、キサントモ
ナス属、クルイヘロミセス属、及びエンドミセス
属に属しＬ−アスパラギン酸とPRを縮合して
APRを生成する能力を有する微生物をＬ−アス
パラギン酸とPRに作用せしめてAPRを生成する
事を特徴とするAPRの製造方法である。 Ｌ−アスパラギン酸とPRを縮合してPRを生成
する能力を有する微生物の作用により、水性媒体
中にてＬ−アスパラギン酸とPRを縮合してAPR
に変換せしめる方法は水溶性媒体中にてＬ−アス
パラギン酸とPRと上記微生物の菌体、培養液あ
るいは菌体処理物とを接触せしめればよい。 本発明において用いるＬ−アスパラギン酸と
PRを縮合してAPRに変換せしめる能力を有する
微生物としては、例えば、 アクロモバクター・ブチリ AJ2438 FERM−P7051 コリネバクテリウム・エスピー ATCC21251 コリネバクテリウム・キセロシス ATCC373 キヤンデイダ・インターメデイア AJ4619 （FERM Ｐ−7062、FERM
BP−508） エシエリヒア・コリ AJ2606 （FERM Ｐ−7055、FERM
BP−477 フラボバクテリウム・セワネンス AJ2476（FERM Ｐ−7052、FERM BP
−476） ジオトリクム・キヤンデイダム IFO4599 ミクロコツカス・ルテウス ATCC4698 パキソレン・タンノフイラス IFO1007 ザルチナ・アルビダ AJ1210（FERM Ｐ−7048、FERM BP
−2472） トリコスポロン・カピタータム IFO1197 キサントモナス・カンペストリス AJ2784（FERM Ｐ−7059、FERM BP
−507） クルイヘロミセス・サーモトレランス IFO0662 エンドミセス・オベテンシス IFO1201 サツカロミセス・セレビジエ IFO2003などがある。 上記IEO2003はブリユーワーズイースト
（Brewer's yeast）であり、サツカロミセス・セ
レビジエと同一であつて、サツカロミセス属に属
する微生物である。 上記本発明のエシエリヒア属、フラボバクテリ
ウム属、キサントモナス属、ザルチナ属、キヤン
デイダ属及びアクロモバクター属の微生物の菌学
的性質は下記の通りである。 ［エジエリヒア属］ (a) 形 態 肉汁寒天培地で37℃で生育させた場合 細胞の形状 桿菌 細胞の大きさ 1.0〜1.5×2.0〜5.0μm 胞子の有無 無 グラム染色性 陰性 (b) 生理学的性質 硝酸塩の還元 ＋ オキシダーゼテスト − 無機窒素の利用 ＋ 酸素に対する態度 通性嫌気性 Ｏ−Ｆテスト Ｆ クエン酸の利用 − インドールの生成 ＋ MRテスト ＋ VPテスト − 硫化水素の生成 − ウレアーゼ − カタラーゼ ＋ NTPase ＋ 以上の結果、バージエイズ・マニユアル・オ
ブ・デターミネイテイブ・バクテリオロジー
（Bergey's Manual of Determina−tive
Bacteriology）８版（1971年）並びに「微生物
の分類と同定（下）」（学会出版センター1975年）
より本微生物をエシエリヒア・コリと同定した。 ［フラボバクテリウム属］ (a) 形 態 肉汁寒天培地で30℃で生育させた場合 細胞の形状 桿菌 細胞の大きさ 0.5×2.0〜3.0μm 胞子の有無 無 グラム染色性 陰性 運動性 無 (b) 生理学的性質 硝酸塩の還元 − オキシダーゼテスト ＋ カタラーゼテスト ＋ 酸素に対する態度 偏性好気性 Ｏ−Ｆテスト Ｏ 色素の形成 非水溶性黄色色素形成 以上の結果、バージエイズ・マニユアル・オ
ブ・デターミネイテイブ・バクテリオロジー
（Bergey's Manual of Determinative
Bacteriology）８版（1971年）並びに「微生物
の分類と同定（下）」（学会出版センター1975年）
より本微生物をフラボバクテリウム属に属する微
生物と同定した。 ［キサントモナス属］ (a)形態 肉汁寒天培地で30℃で生育させた場合 細胞の形状 桿菌 細胞の大きさ 0.5〜0.7×1.0〜2.0μm 胞子の有無 無 グラム染色性 陰性 運動性 有（極鞭毛を有する） (b) 生理学的性質 硝酸塩の還元 − オキシダーゼテスト − カタラーゼテスト ＋ 酸素に対する態度 偏性好気性 Ｏ−Ｆテスト Ｏ 色素の形成 黄色色素形成 以上の結果、バージエイズ・マニユアル・オ
ブ・デターミネイテイブ・バクテリオロジー
（Bergey's Manual of Determinative
Bacteriology）８版（1971年）並びに「微生物
の分類と同定（下）」（学会出版センター1975年）
より本微生物をキサントモナス属に属する微生物
と同定した。 ［ザルチナ属］ (a) 形 態 肉汁寒天培地で30℃で生育させた場合 細胞の形状 球菌でクラスター形成 細胞の大きさ 直径0.5〜2.0μm 胞子の有無 無 グラム染色性 陽性 運動性 無 (b) 生理学的性質 オキシダーゼテスト − 酸素に対する態度 偏性好気性 Ｏ−Ｆテスト Ｏ カタラーゼ ＋ 以上の結果、バージエイズ・マニユアル・オ
ブ・デターミネイテイブ・バクテリオロジー
（Bergey's Manual of Determinativa
Bacteriology）８版（1971年）並びに「微生物
の分類と同定（下）」（学会出版センター1975年）
より本微生物をザルチナ属に属する微生物と同定
した。（なお、現分類ではザルチナで好気性の菌
はすべてミクロコツカス属に統合され ［キヤンデイダ属］ (a) 形 態 １ グルコース・酵母エキス・ペプトン寒天培
地、25℃、平板培養 細胞の形状 楕円形（連鎖状） 細胞の大きさ ３〜５×５〜8μm 増殖の形成 多極出芽 子のう胞子の形成 無 射出胞子の形成 無 担子胞子の形成 無 ２ コーンミール寒天培地、25℃ 仮性菌糸、菌糸の形成 有 以上の結果、バージエイズ・マニユアル・オ
ブ・デターミネイテイブ・バクテリオロジー
（Bergey's Manual of Determinative
Bacteriology）８版（1971年）並びに「微生物
の分類と同定（下）」（学会出版センター1975年）
より本微生物をキヤンデイダ属に属する微生物と
同定した。」 ［アルスロバクター属］ (a) 形 態 肉汁寒天培地で30℃で生育させた場合 細胞の形状 桿菌 細胞の大きさ 1.0〜1.5×2.0〜6.0μm 胞子の有無 無 グラム染色性 陰性 運動性 無 (b) 生理学的性質 硝酸塩の還元 − オキシダーゼテスト − 酸素に対する態度 偏性好気性 Ｏ−Ｆテスト Ｏ 色素の形成 無 以上の結果、バージエイズ・マニユアル・オ
ブ・デターミネイテイブ・バクテリオロジー
（Bergey's Manual of Determinative
Bacteriology）８版（1971年）並びに「微生物
の分類と同定（下）」（学会出版センター1975年）
より本微生物をアルスロバクター属に属する微生
物と同定した。 これらの微生物の菌体を得るには、通常の培地
を用いて、必要に応じて培養の始めから、あるい
は培養の途中でＬ−アスパラギン酸とPRを添加
して培養すればよい。 本微生物の培養のために用いられる培地はＬ−
アスパラギン酸とPRを含むほかは通常の炭素源、
窒素源、無機イオンを含有する通常の培地であ
る。更にビタミン、アミノ酸等の有機微量栄養素
を添加すると望ましい結果が得られる場合が多
い。 炭素源としては、グルコース、シエクロース等
の炭水化物、酢酸等の有機酸、アルコール類、そ
の他が適宜使用される。窒素源としては、アンモ
ニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩、その
他が用いられる。無機イオンとしては、マグネシ
ウムイオン、燐酸イオン、カリイオン、鉄イオ
ン、その他が必要に応じ適宜使用される。 培養は好気的条件下に、PH４ないし８、温度25
ないし40℃の適当な範囲に制御しつつ１ないし10
日培養を行えば望ましい結果が得られる。 菌体としては、培養終了後の培養液そのまま、
培養液より分離された菌体、洗浄された菌体など
いずれも使用可能である。菌体処理物としては凍
結乾燥菌体、アセトン乾燥菌体、トルエン、界面
活性剤等と接触せしめた菌体、リゾチームで処理
した菌体、超音波にさらした菌体、機械的に摩砕
した菌体等のほか、これら菌体処理物から得られ
たＬ−アスパラギン酸とPRをAPRに変換せしめ
る酵素活性を有する酵素蛋白区分、更には、これ
らの菌体の固定化物、菌体処理物の不溶化物、そ
の他いずれも使用できる。 水溶性媒体としては、水、バツフアーおよびエ
タノール等の有機溶媒を含むものが使用できる。
更に必要に応じて、微生物の生育に必要な栄養
素、抗酸化剤、界面活性剤、補酵素、ヒドロキシ
ルアミンおよび金属イオン等を水性媒体に添加す
ることもできる。 上記微生物の菌体を水溶性媒体中で培養しなが
ら、菌体とＬ−アスパラギン酸とPRを接触せし
めて作用せしめる場合には、Ｌ−アスパラギン酸
とPRを含み、かつ微生物の生育に必要な炭素源、
窒素類、無機イオンなどの栄養素を含む水性媒体
が用いられる。更にビタミン、アミノ酸等の有無
微量栄養素を添加すると望ましい結果が得られる
場合が多い。 炭素源としては、グルコース、シユクロース等
の炭水化物、酢酸等の有無酸、アルコール類、そ
の他が適宜使用される。窒素源としては、アンモ
ニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩、その
他が用いられる。無機イオンとしては、マグネシ
ウムイオン、燐酸イオン、カリイオン、鉄イオ
ン、その他が必要に応じ適宜使用される。 培養は好気的条件下に、PH４ないし８、温度25
ないし40℃の適当な範囲に制御しつつ行えば望ま
しい結果が得られる。 かくして１ないし10日間も培養を行えば、Ｌ−
アスパラギン酸とPRはAPRのみに効率がよく変
換される。 これに対し、上記微生物の培養液をそのまま、
培養菌体あるいは菌体処理物をＬ−アスパラギン
酸およびPRと接触せしめて作用せしめる場合に
は、Ｌ−アスパラギン酸とPRと培養液、培養菌
体あるいは菌体処理物を溶解または懸濁した水性
媒体を10℃ないし70℃の適当な温度に調節しPHを
４ないし８に保ちつつ、暫時静置または撹拌すれ
ばよい。かくして５ないし100時間も経過すれば
水性媒体中に多量のAPRが生成蓄積される。 生成したAPRは、公知の分離方法により分離
精製する事ができる。生成したAPRはアミノ酸
アナライザーを用いて測定した。 実施例 １ グルコース2.0ｇ／dl、（NH₄）₂SO₄0.5ｇ／dl、
KH₂PO₄0.1ｇ／dl、K₂HPO₄0.1ｇ／dl、
MgSO₄・7H₂O0.05ｇ／dl、FeSO₄・7H₂O1mg／
dl、MnSO₄・4H₂O1mg／dl、酵母エキス1.0ｇ／
dl、マルツエキス0.5ｇ／dl、炭酸カルシウム4.0
ｇ／dl（別殺菌）を含む培地（PH7.0）を500ml容
フラスコに50ml入れ120℃で15分間殺菌した。 これにブイヨン寒天培地で30℃にて、24時間培
養したフラボバクテリウム セワネンスAJ2476
（FERM Ｐ−7052、FERM BP−476）を１白金
耳接種し、30℃で20時間培養した。この培養液よ
り菌体を遠心分離により採取し、培養液と同量の
生理食塩水で１回洗浄し、菌体を集めた。 これらの菌体を表１に示す反応液Ａに５ｇ／dl
になるよう添加し（終末PH5.4、５ml）、37℃に16
時間保持反応した。 この時に生成したAPRをアミノ酸アナライザ
ーで測定し、その結果を表２に示した。

【表】

【表】 実施例 ２ 実施例１と同様に培養し洗浄した、表４に示す
微生物を表３に示す反応液Ｂに５ｇ／dlになるよ
うに添加し（終末PH5.4、５ml）、37℃に16時間保
持した。この時生成したアスパルチルフエニルア
ラニン イソプロピルエステルをアミノ酸アナラ
イザーで測定し、その結果を表４に示した。

【表】

【表】

【表】 実施例 ３ 実施例１と同様に培養し、洗浄したフラボバク
テリウム・セワネンス AJ2476（FERM Ｐ−
7052、FERM BP−476）５ｇを反応液B100mlに
投入し、37℃、24時間反応した。 この反応液を調製用TLCに帯状にSpotし、ｎ
−ブタノール：酢酸：水＝２：１：１の展開溶媒
で展開し、生成アスパルチルフエニルアラニンイ
ソプロピルエステルの部分をかきとり、蒸留水で
抽出後の反応生成物を結晶化させ1023mgの結晶を
得た。この結晶の旋光度、融点、比旋光度を測定
した結果、反応液Ｂよりの生成物はアスパルチル
フエニルアラニンイソプロピルエステル標品と完
全に一致した。 実施例 ４ 実施例１と同様の培地を用いて30℃で12時間培
養したエシエリヒア・コリ AJ2606（FERM Ｐ
−7055、FERM BP−477）の培養液中にＬ−ア
スパラギン酸５ｇ／dlとＬ−フエニルアラニンイ
ソプロピルエステル10ｇ／dlを含む水溶液10ml
（PH5.4に調製）を無菌的に投入し、無菌的に培養
液のPHを5.4に調製後、更に10時間培養を行つた。
培養中は２時間おきにPHを5.4になるように無菌
的に調製した。 この培養液中での生成物をアミノ酸アナライザ
ーで測定した結果、アスパルチルフエニルアラニ
ンイソプロピルエステルが489mg／dl生成してい
た。 実施例 ５ 実施例１と同様に培養し、洗浄したフラボバク
テリウム セワネンス AJ2476（FERM Ｐ−
7052、FERM BP−476）を反応液Ａ（フエニル
アラニンエステルとして、フエニルアラニンｎ−
ブチルエステルを使用）に５ｇ／dlになるように
添加し（終末PH5.4、５ml）、37℃に16時間保持反
応させた。 得られた酵素反応液１を０℃で一昼夜放置後
析出した結晶３ｇを濾別した。一部をとり高速液
体クロマトグラフイー（カラム、シリコンODS
溶離剤、メタノール−水）にて定量したところα
−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フエニルアラニンｎ−
ブチルエステル1.67ｇを含有していた。この結晶
を35％塩酸3.8ｇ、メタノール1.0ｇ、水2.0ｇの組
成よりなる混合溶液に加え15℃において７日間か
きまぜ続けた。生成した白色結晶を濾別後乾燥し
0.42ｇの乾燥品を得た。アミノ酸アナライザー、
赤外スペクトル、酸滴定、塩酸根滴定によりα−
Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フエニルアラニンメチル
エステル塩酸塩0.38ｇを含有する事を認めた。 α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フエニルアラニン
ブチルエステルに対する収率23％。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ アクロモバクター属、コリネバクテリウム
   属、キヤンデイダ属、エシエリヒア属、フラボバ
   クテリウム属、ジオトリクム属、ミクロコツカス
   属、パキソレン属、ザルチナ属、サツカロミセス
   属、トリコスポロン属、キサントモナス属、クル
   イヘロミセス属及びエンドミセス属に属しＬ−ア
   スパラギン酸とＬ−フエニルアラニンの、炭素数
   ２以上のアルコールエステルあるいは置換もしく
   は無置換フエノールエステルを縮合してＬ−アス
   パルチル−Ｌ−フエニルアラニンの、炭素数２以
   上のアルコールエステルあるいは置換もしくは無
   置換フエノールエステルを生成する能力を有する
   微生物をＬ−アスパラギン酸とＬ−フエニルアラ
   ニンの、炭素数２以上のアルコールエステルある
   いは置換もしくは無置換フエノールエステルに作
   用せしめて、Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フエニルア
   ラニンの、炭素数２以上のアルコールエステルあ
   るいは置換もしくは無置換フエノールエステルを
   生成することを特徴とするＬ−アスパルチル−Ｌ
   −フエニルアラニンの、炭素数２以上のアルコー
   ルエステルあるいは置換もしくは無置換フエノー
   ルエステルの製造方法。