JPS60186299A - Ｌ−アスパルチル−ｌ−フエニルアラニンの、炭素数２以上のアルコ−ルエステルあるいは置換もしくは無置換フエノ−ルエステルの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 この発明はＬ−アスパルチル−１７−）□ニルアラニン
の、炭素数２以」−のアル：ｌ−ル：Ｉスラルあるいは
ｉ、ｙ；換もしくは無ｉ、ｙ、＋換フ１．ノール：ｉ−
スフルの製造法に関する。

γスバルチルフェニルアシニンのアルーＪ−ルＩスプル
は、１］味剤として近年ｉｌ：　１１され１でいるペゾ
チドであり、アスパルチルフ。ニルアリニ／メヂル、−
１’、　’／、　ｉル（以Ｆ’　Ａ　１１　Ｍと略ず）
が代表的なものとして知られている。

△ｌ’　Ｍの製造法としては、化学合成法と酵素的合成
法が知られている。

化学的合成法としては、Ｎ−保護のＬ−アスバソｔ、ノ
ａ　無水物と１、−ノ。ニルアラニンメチｋ　−Ｔ−ス
テル（以）、ＰＭと略す。）を綜合させてＮ−（！、、
護のＡ　Ｉ’　Ｍとし、その後保護基を除去する方法か
あり、＾ｌ’　＋’（Ｉ合成法としては、Ｎ−保護の１
．−アスパラギン酸とＰ　Ｍに蛋白分解酵素を作用させ
てＮ−保護のＡＩ’　ＭあるいはＮ−保護のＡ　１１　
Ｍの■）Ｍ（・１加物とし、その後、保護基を除去して
Ａ　Ｉ）　Ｍにする方法が知られているが、両ＪＪ法と
も保護基のノΩ人、脱ｎ＋か必要で工程が複雑となる。

また保；ａ基を使用しないＡ　Ｉ”　Ｍの製造方法（特
開昭５８−１２０７００　、昭和５８年に１本農芸化′
ツ大会要旨集１’　４２　）も知られており、シュー１
モリス属、アルノノリゲネス屈、トル「Ｊプシス届、１
＋　トトルラ属、スボＩ＋ボロミセス属のいずれかを用
いる微生物的合成法であるが収率が非常に低く工業的な
Ａ　Ｐ　Ｍの生産には必ずしも適していない。

また本発明者らは、微生物を用いる事によって■、−ア
スパラギ／酸とＰ　ＭからＡＩ”　Ｍか直接、効率よく
生成する”１［を見い出している（特願昭５８’７　５
　５　６　Ｅｌ　）　。

しかし、これら保護基を使用しない１．−アスパラギン
酸を用いたアスバルチルフゴニルアシニ７アルキルエス
デルの製造法の難点は、これらの反応か、市街反応であ
るため、基質を収率、Ｊ、（アスバルヂルフ、ニルアラ
ニンアルキル−Ｉ−ステルに変換できないことてあった
。

本発明者らは、このような従来のアス／（ルチルシソ・
ｒニルアラニンアル；１゛−ルエスゾルの製造ｌ去に対
し、フェニルアラニアの３．スプルとして炭素数２以−
１のアルコールエステルあるいは置換もしくは無置換〕
、ノールエステル（以１−’　ｌ）　Ｒと略ず。）を用
いて、微生物を（′１用させると、生成されたアスバル
チルフェニルアラニ／の、炭素数２辺−１のアル−１−
ルエステルあるいは、置換も［７くは％％　Ｈ，ｖ、“
換フェノールニスプル（以１ζＡ　Ｉ’　Ｒと略す。）
の溶解度が低いため反応系外に除かれ、収率良くＡＩ’
　Ｒか１１成されることを見い出し、本研究を完成さ１
！るに全った。これら、ＡＩ）Ｉぐは、このままでも１
１味剤としての用途か期待されるばかりでなく１．１．
スノル交換（方法の如何を問わない）笠によりＡＩ’Ｍ
を、合成するための、ｌｉｍｐ料としても利用できる。

即ら、本発明は、γりｌＩモバクター届、：１リネパク
ン″リウｌ、ＩｔｌｌｌＡ−ヤンディダ属、クリプト″
ｌノカスｋｌ＋　、工シエリヒγ属、フラボバクデリウ
ノ、届、シＡトリクｌ、届、ミクｌ−，１：、Ｉツヵス
属、バギソレン属、ザルチリ−屈、慢ノカロミセス属、
トリ：Ｉスボ１１７に４、゛１．−リ／トモリス雇、ク
ルイヘ１＋ミセス屈及びｚ「、ントミセスｆｕｌｌに属
しＬ−アスパラギン酸と１’　Ｒを縮合してＡＩ’　Ｒ
を生成する能力をイ１する微生物を！、−アスバシギン
酸とＰ　Ｒに作用せしめてＡＩ’、Ｒを生成するり［を
特徴とするＡ　Ｉ’　Ｒの製造力１人である。

１、−アスパラギン酸と１）１＜を綜合して１１　Ｒを
生成する能力をイ１する微生物の作用により、水性媒体
中にて■、−アスパラギン酸と１１　Ｒを縮合してＡ１
）■りに変換せしめる方法は水溶Ｖ１媒体中にて１．−
アスパラギン酸とＩ）　Ｒと土泥微生物の１￥１体、培
フ：ｔｉ１にあるいは菌体処理物とを接触せしめればに
い。

本発明において用いるｌ、　−７スバ’／”＋、：／　
ａ　トＩ’Ｒを縮合してＡ　Ｉ’　Ｈに変換廿しめる能
力を自゛４る微生物としては、例えば、 アクＩＩモバクター〇ノチリ Ａ　Ｊ　２４　：ｉ　８　’　Ｆ　Ｉ：　ＲＭ　−１”
７　（１５１−ｌリネバクゾリウｌ、・コースピー ＡＴＣＣ２＋２５１ ＝１リネバクブリウム・キセ「Ｊシス ΔＴ　ＣＣ３７３ キーヤンディダ・インターメディア Ａ　Ｊ　／Ｉ　Ｇ　Ｉ≦ｌ　Ｆ　Ｅ　ＩぐＭ　Ｐ　７　
（１（ｉ　２クリプト：Ｊソカス・ネオフォルマンス１
１”　０４２８０ ．１．シ：［リヒア・コリ ΔＪ　２０　（１０Ｆ　Ｉ；　ＲＭ〜ｌ’　７’（ｌ　
Ｆ）　Ｆｉソシ、１″バク・ｉリウノ、・セワネンス△
Ｊ　２　／ｌ　７　（ｉ　日＞　ＲＭ−Ｐ　７０５２ン
−Ａ１リクｌ、・−１・シンディグ１１１　Ｆ　Ｏ４５
で］ｒ） ミグ１１′ｌノノノス・ルラー■ンス へ′Ｉ″ＣＣ４（ｉで）８ バ１．ソレンークンノフィラス Ｉ　Ｆ　ＯＩ　（＋　（１７ 一すルーｙ・・）＠）′ルビダ △Ｊ　Ｉ　２１　（ｌ　Ｉ”　Ｉ＞　ＲＭ　−Ｐ　７０
４　Ｂトリ　ｔスボ１ノン・力ビタータ１１ １　Ｆ　ＯＩ　Ｉ　Ｅｌ　７ トリントセづスＱカッペストリス Ａ　Ｊ　２７８７　Ｆ　ＩうＲＭ　−Ｐ　７　（１５０
クルイヘＩＩミセス・ターモトレジ／スＩ　Ｐ　Ｏｔｌ
　（ｉ　（ｉ　２ １ノドミセス・詞ベノーノンス ＋　１”　ＯＩ　２　（ｌ　Ｉ リップ胛ミセス・セレビジＪ １１”　０２　（１０３なとがある。

これらの微生物の菌体を得るには、通常の培地を用いて
、必要に応じて培養の始めから、あるいは培養の途中で
１．−アスパラギン酸とＰ　Ｒを添加して培養すればよ
い。

本微生物の培養のために用いられる培地は１．−アスパ
ラ・１′！ン酸とｌ）　Ｒを含むほかは通常の炭：＋：
ｄ皇、窒素源、無機イオンを含イ丁する通常の培地であ
る。

史にビタミ／、アミノ酸等のイ１機微ｈ１．栄養素を添
加すると１１！ましい結果かｉＵられる場合か多い。

Ｊ′夷ｌ；源としては、グル：ノース、シ・、り１１−
ス）。

の炭水化物、酢酸′）の佇槻酸、アル：ｌ−ル類、その
他か適宜使用される。窒素源としては、ア／モニγガス
、アンモニア水、アンモニラ”　１１４　、その他か用
いられる。無機イオンとしては、マグネノウ１１イＡノ
、燐酸イオン、カリイ」ノ、鉄イ詞／、その他か必要に
応じ適宜使用される。

ｊ１１′丁養は好気的条イ’＋１・に、ｐ　ＩＩ　４な
いし８、ｌ！、Ａ　ｌσ２５ないし４（）℃の適当な範
囲に制御しつつＩ　ｊｉいし１０１］培谷を行えば（２
μましい結果か得られる。

１′４°１体としては、培養終ｒ後の培養液そのまま、
’ｒｆ　４を６　Ｊ、り分ＩＩされた菌体、洗浄された
菌体なとい４れも使用ＩＩＩＩ能である。菌体処理物と
しては凍ｆ１−乾＋”ｉ＋　＋ニアｆ体、アセトノ乾燥
菌体、トルエン、界面１’ｌ電１１剤等とｌに触ｕしめ
た菌体、リゾチートで処ｅｌｆ（５だ菌体、超音波にさ
らした菌体、機械的に摩砕１７だ＋′４′４体′ηのほ
か、これら１７１体処理物から得られた【、−アスパラ
−）！ン酸とＩ）　Ｒを八１）　Ｈに変換せしめる酊に
　１＋”ｉ↑１１をイ１する酵素蛋白区分、更には、こ
れらのｌ：ｌ：１体の固定化物、菌体処理物の不溶化物
、その他いずれも使用てきる。

水溶Ｖ１１体としては、水、バッフ１−および：Ｉ。

り／−ル）゛のイ１゛機溶媒を含むものが使用できる。

史に必要に応じて、微生物の生育に必要な栄養素、抗酸
化剤、界面活慴剤、捕酊索、ヒトｌ’＋キシルアミンお
よび金ｈ１イ」ノ）を水性媒体に添加することもてきる
。

１°記微生物の菌体を水溶性媒体中で培養しながら、菌
体と１．−アスパラギン酸と１）１セを接触廿し−めて
イ′１川せしめる場合には、■、−アスパラギン酸と１
）１りを含み、かつ微生物の牛Ｙ目ご必要な炭素源、窒
素類、無機イＡンなどの栄呑索を含む水性媒体か用いら
れる。更にビタミ／、アミノ酸）の自機ｖｌｉ　ｂｔ栄
谷素を添加すると望ましい結果か得られる場合か多い。

炭素源としては、グル：、Ｉ−ス、シュラ１１−ス等の
炭水化物、酢酸等のイ１°機酸、γル：Ｉ−ルチ゛１、
その他が適宜使用される。窒素源としては、アノモニア
ガス、）′ンモニγ水、アンモニラｌ＼１！ａ　１ソＯ
Ｊ他か用いられる。無機イオンとしては、マグ：（、シ
ラノ、イＡ）、燐酸イオン、カリイ２ノ、鉄イＡノ、そ
の他が必要に応じ適宜使用される。

）７２養は好気的条件上に、Ｉ）　ＩＩ　４ないし８、
’ｌ＋ｉ一度２５ないし４０℃の適当な範囲に制御しつ
つ行えば望ましい結果が得られる。

かくして１ないしＩ　（ｌ　ＩＩ　１１も培養を１１え
は、■。

−アスパラギン酸と１１　ＲはＡ　Ｉ’　Ｒのみに効・
ｔ′かＪ、く変換される。

これに対し、」−記微生物の培養ｉｌｋをそのまま、培
養菌体あるいは菌体処理物を１．−アスバシ−１コ／郵
わＪ、び１）１りと１−ト触せしめてイ′１川甘しめる
場合には、１．−アスバソ′１！／酸と１１　Ｒと培養
液、培得菌体あるいはｉ’ａ’、ｉ体処理物を溶解また
は懸濁した水性蝉体を＋　（＋　’Ｃξ五いし７０℃の
適当なｌ！度に調節しＩＩＩ＋を４４にいし８に保ちつ
つ、暫時静置または撹（１４ればＪ、い。かくして５な
いしＩ　（１（１時間も経過すれば水（’Ｌ　Ｗ体中に
多［１１，の八１）１セが生成蓄積される。

１１成したΔｌ’　Ｒは、公知の分１ｉｌＥ方法により
分離４１１１製する°Ｊｆができる。生成したＡ　Ｐ　
Ｒはアミノ酸アリライザーを用いて？ｌ１ｌＩ定した。

実施例１ タル：ｌ−ス２　、（ｌ　Ｊｒ　／ｃｌｊ！、（Ｎ１１
４　）　２３０４（）５ｇ八へ℃、ＫＩＩ２１’０４．
（１，１ｇ／ｄＪ！、に２１１１’０４（１、＋　５：
　八１１．Ｍ５＜　Ｓ　ｏ　４　・７１１２　０（１，
（１５ｇ／ｃ（Ｊ！　、！’　ｃ　Ｓ０４　・７１１２
０１　ｍｇ／ｃｌｉ、Ｍｎ　ＳＯ４・４１ｈＯ１１１ｇ
／　Ａ、ｅ　１酊１：Ｊ：　：１°ｌ’ス１．　（Ｉｇ
／Ｊｕｌ！％　マル７：＋：キｙ、　（１、５５ｒ　／
　ｔｂ！ｓ炭酸ツノルシウム４．０ｇ／ｄ６（別殺菌）
を含む培地（ｐＨ７、（１）を５　（１０紅容フラス：
Ｉに５　Ｃ１１ｌｌｔ入れ１２　（１’ＣでＩ　Ｅｉ分
間殺菌した。

これにブイ＝１〕寒大培地で３０℃にて、２４時間培６
したフラボバクゾリウム　セゾネンス　ＡＪ２４７　［
ｉ　Ｆ　ｌ：　ＲＭ　ｌ’　７　（１５２を１自金」−
１１と４ＩＩＩし、３０　’Ｃで２　（ｌ　１１４１間
培養した。この培養ｌ（ｋより菌体を遠心分ＰＩＩｉに
より採取し、培養ｉ＋＆と同１．１の生理食塩水で１回
洗浄し、菌体を集めた。

これらの菌体を＆１に示ず反応ｉ１ｖ　Ａに５シζ／ｄ
」：になるよう添加しく終末ｐ　１１５．４．５１ｅ）
、３７°Ｃに１（）時間保持反応した。

この１１ンに生成した八ｌ’　ｌシをアミノ酸アリライ
ザーで測定し、その結果を表２に示した。

表　１ ※　０．１Ｍリン酸バッフ１−中に一１記基質を含む（
最終ｐＨ５，４）表　２ 実施例２ 実施例１と同様に倍径し洗浄した、と４に小ず微生物を
表３に示す反応液１１に５５Ｈ／　＋＋１！になるよう
に添加しく終末１）’１１５．４．５ＩＩ、ＩＫ）、３
７°ｃに１６時間保持した。この時生成したアスパルチ
ルツマニルアラニン　インゾロビル）、スゾルをアミノ
酸アリライザーで測定し、その結果を表４に小した。

表　で） ※　０．Ｉ’Ｍリン酸バッファー中に１記基７’ｉを；
′入む（１１］柊１）＋１５．／ｌ） 表　４ 実施例丁（ 実施例１．！：回トηに１？゛Ｓ谷し、洗浄したフラ、
−１′バクノリウｌ、・セワ不／ス　八Ｊ　２　’＋　
７　（ｉ　Ｆ　Ｉり１＜へ１−１”／’　（１５２５＋
ｒを反応７１ｋ　１３１　（１（ｌ　ｍｌ、に投入し、
で（７°Ｃ１２４時間反応した。

この反応ｉ１ｋを調製用Ｔ　１．　Ｃに帯状に５ｐｏｉ
シ、ｎ−ノ′り／−ル二内１酸：水＝２：１：ＩのＩＪ
ｃ開溶媒で層間し、１１成γスバルチルフエニルアラニ
ンイソゾＩＩピル書、スフ′ルの部分をかきとり、蒸留
水で抽出後の反応１１成物を結晶化させ＋　（１２３ｍ
ｇの結晶を得た。この結晶の旋光度、融点、比旋光度を
Ｘｌｌ＋定したモ１１果、反応１１ン１１よりの生成物
はアスバルｆ−ルアｔニル°Ｊ°ソニノイソプ１１ピル
ニスプルＦｌ　品と、゛、；仝に　・致した。

実施例４ 実施例１と同様の培地を用いて３０　”Ｃで１２時ｌｆ
ｌ　Ｉｆｆ　Ａ　ｌ、た−１ン、リヒ−ｊ’　ａ　：Ｊ
リ　Ａ　Ｊ　２　［３（ｌ　Ｇ１”　Ｌ：　ｌぐＮｑ　
−１”　７　（］　５５の培６液中にＬ−アスバシギ７
酸５ｇ／山：と］、−ノ、ニルアラニンイソゾ１１ピル
−１，ス１ゾールｌ　Ｏｇ／ｄｌを含む水ｉ８　ｉ夜１
０紅（１）１１５．４に調製）を無菌的に投入し、無菌
的に培養ｉｔｋの１）１１を５．４にａｔ！製後、更に
Ｉ　０時間培養を行った。１を丁養中□ば２時間おきに
Ｉ）１１を５．４になるＪ−うに％゛菌的、３．’Ｊ製
した。

この培養液中での１１成物をアミノ酸アリ゛シイザ−で
１１１１Ｉ定した９、１７　果、　７スバルチルフ・、
ニルン′シニ／イソプＩ＋ビル：１．スゾルが４８ｊｌ
ｌ１ｇ／山Ｚ牛Ｉ戊していた。

実施例５ 実施例１と同様に培青し、洗浄したフシボバクノ゛　リ
　ウ□ノ、　セ　「ノ　ネ　／　ス　ＡＪ’２４’７に
　Ｐ１４１ぐ　Ｍ１’　７０５２を反応１１ＶＡ（）、
ニルアシニア　Ｊノ）°ルとして、フ、ニルアシニンｎ
−ブチル５Ｉスノルを使用）に５　ｇ　／　ｔ３ｅにな
るように添加しく終末ｐＨ５，４＋　５紅）、て（７℃
にｌ　（ｉ時間保ｔ１１反応させた。

？ｉＩられた酵素反応ｉ＆　Ｉ　１を０°Ｃて　昼佼放
置後？＋ｉ’　＋Ｈした結晶ｒ（ｇを濾別した。・部を
とり、―；、速ｒｆｋ体りＩＩマトグシソイー（カラｌ
１．シリ：１ン０］）Ｓ溶−１剤、メタ／−ルー水）に
て定１１１シたところ（ｔ−１，−アスバルヂルーＬ−
）１．ニルアラニンｎ−ノヂル、１−スフル１．０７ｇ
を含イ１していた。この結晶を３３５％均酸３．８ｇ、
メタノール１．Ｏｇ、水２、（Ｉｇの組成上りなる混合
溶液に加え１５°Ｃにおいて７１１間かきまぜ続りだ。

小成した白色結晶をδ・≦１別後乾燥しく１．／１２３
；の乾燥品を得た。アミノ酸γづシイザー、赤外スペク
トル、酸１１η定、塩酸根滴定によりα−Ｉ、−アスバ
ルヂルーＩ、−）ｙニルアワニｙメチル〕スシルル酸１
ム（１、３８）？を３自する中を認めた。

α−■、−γスバルヂルーＬ−フ、ｒ、ニルアシニンノ
チル：１スゾルに対する収率２　ａ％。

１１ｒ　＋：’ｌ出願人　味の素株式会社第１頁の続き

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 アク１１モバクター属、コリネバクテリウム属、キャノ
   ディダ雇、クリプトコツカス雇、エシェリヒア届、フシ
   ボバクデリウｌ司ｔ’ｓ　、ジオトリクム届、ミクＩＩ
   　：ＩツカスＩ＋ｉｌ、バ４−ツレ／属、ザルヂリー属
   、勺ツカＩ＋ミセスＩＩｃＩ　、　トリコスボ「１７に
   ４、キ勺ントモリス属、クルイヘＵミセス属及びエンド
   ミセス屈に：　ｋｒｌ　ｆ、　１．−アスパラ１！ン酸
   とＬ−フゴニルアシニノの、υぶ、÷、数２以１の）′
   ル：ｌ−ルエスデルあるいは置換もしくはフ１１【置換
   フェノールエステルを縮合して１．＝γスバルチルー１
   ．−フェニルアラニンの、ＬＡ　、＋’ｉ　数２　慶、
   、Ｉのアル：ｌ−ルエステルあるいは置換もしくは無置
   換フ。ノールエステルを生成する能力をイ１する微生物
   を１．−アスバシギ／酸と１．−フＸニールアラニンの
   、炭素数２リ−１のアル：ｌ−ルコースプルあるいは置
   換もしくは無置換フ□ノール：Ｉスプルにｆ′１川ぜし
   めて、■、−アスパルチルー１゜−ソー、ニルアラニン
   の、炭素数２ＣＩのアル：Ｉ−ルエスデルあるいは置換
   もしくは無置換ソ□ノール：ｒ−スプルを生成する事を
   特徴とするＩ、−アスパルチル−Ｉ、−フェニルアシニ
   ノの、炭ｌ、数２以１゛のアル：Ｉ−ルエステルあるい
   は置換もしくは無置換フェノール、「−スゾルの製造方
   法。