KR920004255B1 - L-아스파르틸-l-페닐알라닌 알코올 에스테르 또는 치환되거나 비치환된 페놀 에스테르의 제조방법 - Google Patents

L-아스파르틸-l-페닐알라닌 알코올 에스테르 또는 치환되거나 비치환된 페놀 에스테르의 제조방법 Download PDF

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Abstract

내용 없음.

Description

L-아스파르틸-L-페닐알라닌 알코올 에스테르 또는 치환되거나 비치환된 페놀 에스테르의 제조방법
본 발명은 감미제로서 유용한 탄소수 2이상의 L-아스파르틸-L-페닐알라닌 알코올 에스테르 또는 치환되거나 비치환된 페놀 에스테르(이후에서는 "APR"로 약칭한다)의 신규한 제조방법에 관한 것이다.
L-아스파르틸-L-페닐알라닌 알코올 에스테르는 최근에 와서 감미제로서 주목받고 있는 펩타이드이다. 이러한 알코올 에스테르 중에서 대표적인 것으로는 L-아스파르틸-L-페닐알라닌 메틸 에스테르(이후에서는 "APM"으로 약칭한다)가 잘 알려져 있다.
APM의 제조방법으로는 화학적 합성방법과 효소적 합성방법이 있는 것으로 알러져 있다.
APM을 제조하기 위한 화학적 합성방법은 N-보호된 L-아스파르트산 무수물과 L-페닐알라닌 메틸 에스테르(이후에서는 "PM"으로 칭한다)를 축합시켜 N-보호된 APM을 수득한 다음 보호그룹을 제거하는 방법이다. 한편, 효소적 합성방법은 N-보호된 L-아스파르트산과 PM에 대해 단백질 분해효소를 작용시켜 N-보호된 APM 또는 N-보호된 APM의 PM 부가물을 수득한 다음 보호그룹을 제거하여 APM을 수득하는 방법이다. 그러나, 이러한 두가지 방법은 모두 보호그룹을 도입시키고 이후에 제거해야 하는 복잡한 단계를 필요로 한다.
보호그룹을 사용하지 않고 APM을 제조하는 방법, 즉 슈도모나스(Pseudomonas), 토루로프시스(Torulopsis), 로도토룰라(Rhodotorula) 및 스포로볼로마이세스(Sporobolomyces)중의 하나를 사용하는 미생물학적 합성방법[참조 : 일본국 공개특허공보 제126796/1983호, "Digests of the Publications at the Annual Meeting of the Agricultural Chemical Society of Japan"(1983), p.42]도 또한 알려져 있으나, 이 방법은 수율이 매우 낮기 때문에 대규모적인 APM의 제조에 반드시 적절하다고는 볼 수 없다.
본 발명자들은 미생물을 사용함으로써 L-아스파르트산과 PM으로부터 APM이 직접 효과적으로 생성된다는 사실을 알게 되었다[참조 : 일본국 특허원 제75559/1983호].
그러나, 보호그룹을 사용하지 않고 L-아스파르트산을 사용하여 아스파르틸 페닐알라닌-알킬에스테르를 제조하는 방법에 있어서의 문제점은 L-아스파르트산과 PM으로부터 APM을 형성하는 반응이 평형반응이며, 이러한 평형반응은 기질이 아스파르틸 페닐알라닌 알킬에스테르로 효율적으로 전환되는 것을 방해한다는 점이다.
본 발명자들은 아스파르틸 페닐알라닌 알킬에스테르의 통상적인 제조방법보다 더 효과직인 방법을 탐구해왔으며 본 발명에 이르러 페닐알라닌 에스테르로서 알코올 에스테르 또는 치환되거나 비치환된 페놀 에스테르(이후에서는 "PR"이라고 한다)를 사용하여 여기에 미생물을 작용시키면, 수득된 APR은 용해도가 낮아 반응계로부터 배출되기 때문에 효과적으로 APR을 생성할 수 있음을 알게 되었다.
APR 자체는 감미제로서 사용할 수 있을 뿐만 아니라 에스테르 교환반응(또는 기타의 방법)에 의해 APM을 합성하기 위한 원료물질로서 사용할 수도 있을 것으로 기대된다.
따라서, 본 발명에 의해 APR을 생성시킬 수 있는, 코리네박테리움(Corynebacterium), 캔디다(Candida), 크립토코쿠스(Cryptococcus), 에쉐리키아(Escherichia), 플라보박테리움(Flavobacterium), 지오트리쿰(Geotrichum), 마이크로코쿠스(Micrococcus), 파키졸렌(Pachysolen), 삭카로마이세스(Saccharomyces), 트리코스포론(Trichosporon), 크산토모나스(Xanthomonas), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 엔도마이세스(Endomyces), 아르스로박터(Arthrobacter), 셀룰로모나스(Cellulomonas), 및 브레비박테리움(Brevibacterium)중에서 선택된 미생물을 L-아스파르트산과 PR의 축합반응에 작용시킴으로써 APR을 생성시키는 APR의 제조방법이 제공된다.
L-아스파르트산과 PR을 축합시켜 APR을 생성시킬 수 있는 미생물의 작용을 이용하여 수성 배지 중에서 축합반응을 수행함으로써 L-아스파르트산과 PR을 APR로 전환시키는 공정은 L-아스파르트산과 PR을 상기한 미생물의 세포, 배양액 또는 미생물 세포-처리물질과 접촉시킴으로써만 이루어질 수 있다.
본 발명에 있어서, L-아스파르트산과 PR을 축합반응으로 APR로 전환시킬 수 있는 미생물의 예는 다음과 같다 : 코리네박테리움 종(Corynebacterium Sp.) ATCC 21251(한국기탁기관 : 한국종균헙회, 기탁번호 : KFCC-10104, 기탁일 : 1984. 7.10) ; 코리네박테리움 제로시스(Corynebacterium xerosis) ATCC 373(한국기탁기관 : 한국종균협회, 기탁번호 : KFCC-10100, 기탁일 : 1984. 7.10) ; 캔디다 인터메디아(Candida intermedia) FERM-BP 508(한국기탁기관 : 한국종균협회, 기탁번호 : KFCC-10099, 기탁일 : 1984. 7.10) : 크립토코쿠스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans) IFO 4289 ; 에쉐리키아 콜리(Escherichia coli) FERM-BP 477(한국기탁기관 : 한국종균협회, 기탁번호 : KFCC-10102, 기탁일 : 1984. 7.10) ; 플라보박테리움 세와넨스(Flavobacterium sewanens) FERM-BP 476(한국기탁기관 : 한국종균협회, 기탁번호 : KFCC-10101, 기탁일 : 1984. 7.10) : 지오트리쿰 캔디둠(Geotrichum candidum) IFO 4599 : 마이크로코쿠스 루테우스(Micrococcus luteus) ATCC 4698(한국기탁기관 : 한국종균협회, 기탁번호 : KFCC-10096, 기탁일 1984. 7.10) ; 파키졸렌 탄노필루스(Pachysolen tannophilus) IFO 1007 ; 트리코스포론 캐피타툼(Trichosporon capitatum) IFO 1197 ; 크산토모나스 캄페스트리스(Xanthomonas campestris) FERM-BP 507(한국기탁기관 : 한국종균협회, 기탁번호 : KFCC-10095, 기탁일 : 1984. 7. 10) ; 클루이베로마이세스 서모톨러란스(Kluyveromyces thermotolerans) IFO 0662 ; 엔도마이세스 오베텐시스(Endomyces ovetencis) IFO 1201(한국기탁기관 : 한국종균협회, 기탁번호 : KFCC-10105, 기탁일 : 1984. 7.10) ; 삭카로마이세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae) IFO 2003 ; 아르스로박터 시트레우스(Arthrobacter citreus) ATCC l1624(기탁기관 : 한국종균협회, 기탁번호 : KFCC-10098, 기탁일 : 1984. 7.10) ; 셀룰로모나스 플라비게나(Cellulomonas flavigena) ATCC 8183(기탁기관 : 한국종균협회, 기탁번호 : KFCC-10103, 기탁일 : 1984. 7.10) 및 브레비박테리움 리넨스(Brevibacterium linens) ATCC 8377(기탁기관 : 한국종균협회, 기탁번호 : KFCC-10097, 기탁일 : 1984. 7 10).
이들 미생물의 세포는 통상의 배양배지를 사용하여 수득할 수 있다. 또한, L-아스파르트산과 PR은 배양의 초기 단계 또는 배양 도중에 첨가할 수 있다.
본 발명의 미생물에 대해 사용할 수 있는 배양배지는 L-아스파르트산 및 PR 이외에 통상의 탄소 및 질소 공급원과 무기 이온을 함유하는 통상의 배지이다. 또한, 비타민 및 아미노산 등의 유기 영양물질을 미량 첨가하여 바람직한 결과를 얻을 수 있다.
본 발명에서 사용하기에 적절한 탄소 공급원으로는 포도당 및 자당 등의 탄수화물, 아세트산 등의 유기산, 알코올 등이 있다. 본 발명에서 사용하기에 적절한 질소 공급원으로는 암모니아 개스, 수성 암모니아, 암모늄염 등이 있다. 무기 이온은 필요에 따라 마그네슘 이온, 인산 이온, 칼륨 이온, 철 이온들 중에서 적절히 선택한다.
배양은 호기성 조건하에 25 내지 40℃의 범위내로 조정된 적절한 온도와 pH 4 내지 8에서 1 내지 10일동안 수행함으로써 바람직한 결과를 얻는다.
본 발명에서 사용하는 미생물에는 배양이 종결된 후에 수득한 전배양액, 배양액으로부터 분리된 미생물 또는 세척된 미생물이 포함된다. 또한, 본 발명에서는 동결건조시키거나 아세톤 건조시키고, 톨루엔, 계면활성제 등과 접촉시키며, 라이소자임으로 처리하고, 초음파에 노출시켜 기계적으로 분쇄하여 처리한, L-아스파르트산과 PR을 APR로 전환시키는 효소 활성을 갖는 세포-처리물질로부터 수득된 효소 단백 부분을 사용할 수도 있다.
이들 미생물의 고정세포, 세포-처리물질의 불용성 물질 등을 사용할 수 있다.
수성 배지로는 물, 완충액 및 에탄올 등의 유기 용매를 함유하는 배지를 사용할 수 있다. 또한, 경우에 따라, 미생물 증식에 필요한 영양소, 산화방지제, 계면활성제, 조효소, 하이드록실아민 및 금속 이온 등을 수성 배지에 첨가할 수도 있다.
상기의 미생물 세포를 수성 배지 중에서 생장시키는 동시에 L-아스파르트산 및 PR과 접촉시켜 L-아스파르트산과 PR에 대해 작용시키는 경우, 수성 배지에는 L-아스파르트산, PR 및 미생물의 생장에 필요한 탄소 공급원, 질소 공급원 및 무기 이온 등의 영양소가 함유되어야 한다. 또한, 비타민 및 아미노산 등의 유기영양소를 미량 첨가하여 바람직한 결과를 얻을 수도 있다.
본 발명에서 사용하기에 적절한 탄소 공급원으로는 포도당 및 자당 등의 탄수화물, 아세트산 등의 유기산, 알코올 등이 있다. 본 발명에서 사용하기에 적절한 질소 공급원으로는 암모니아 개스, 수성 암모니아, 암모늄염 등이 있다. 무기 이온은 필요에 따라 마그네슘 이온, 인산 이온, 칼륨 이온, 철 이온 등으로부터 적절히 선택한다.
미생물은 호기성 조건하에 pH 4 내지 8과 25 내지 40℃의 범위내로 조정된 온도에서 생장시킴으로써 바람직한 결과를 얻는다.
따라서, L-아스파르트산 및 PR 또는 APR은 1 내지 10일간 배양하면 APR로 효율적으로 전환된다.
상기한 미생물의 전배양액, 배양세포 또는 세포-처리물질을 L-아스파르트산 및 PR과 직접 접촉시켜 작용하도륵 하는 경우에는 L-아스파르트산, PR 및 배양액, 미생물 배양세포 또는 미생물 세포-처리물질을 수성 배지에 용해시키거나 현탁시킨 후, 10 내지 70℃의 적온으로 조정하고 pH 4 내지 8로 유지시킨 다음 잠시 동안 정치시키거나 교반하면, 5 내지 100시간 후에 수성 배지내에 다량의 APR이 생성되어 축적된다.
이렇게 하여 생성된 APR은 공지의 분리방법으로 분리하고 정제할 수 있다. 수득된 APR은 아미노산 분석기로 정량한다.
본 발명의 이해를 돕기 위해 다음의 실시예를 들었으며, 이들 실시예는 본 발명을 설명하는 것이지 본 발명을 제한하는 것은 아니다.
[실시예 1]
500ml들이 플라스크에 포도당 2.0g/dl, (NH4)2SO40.5g/dl, KH2PO40.1g/dl, MgSO4,7H2O 0.1g/dl, FeSO4, 7H2O 0.05g/dl, MnSO4,
4H2O 1mg/dl, 효모 추출물 1.0mg/dl, 맥아추출물 0.5g/dl 및 탄산칼슘 4.0g/dl를 함유하는 배지(pH 7.0) 50ml를 넣고, 120℃에서 15분간 멸균시킨다.
이렇게 하여 제조된 배지 각각에 백금이를 사용하여 육즙-한천 배지 속에서 30℃에서 24시간 동안 배양한 플라보박테리움 세와넨스 FERM-BP 476(한국기탁기관 :한국종균협회, 기탁번호 : KFCC-10101, 기탁일 : 1984. 7.10) 또는 아르스로박터 시트레우스 ATCC l1624(한국기탁기관 : 한국종균협회, 기탁번호 : KFCC-10098, 기탁일 : 1984. 7.10)를 접종한 후, 30℃에서 20시간 동안 더 배양한다. 원심분리하여 배양액으로부터 세포를 수득하고, 배양액과 동일한 양의 생리 식염수로 1회 세척한 다음, 모은다.
수집된 미생물의 세포를 표 1에 기재한 반응용액 A에 가하여 5g/dl에 상당하는 양이 되게 하고(최종상태 : pH 5.4, 5ml), 37℃에서 16시간 동안 반응시킨다. 생성된 APR을 아미노산 분석기로 정량하고, 그 결과를 표 2에 기재한다.
[표 1]
Figure kpo00001
* 상기의 기질을 0.1M 인산완충액에 넣는다(최종 pH 5.4).
[표 2]
Figure kpo00002
[실시예 2]
실시예 1과 유사한 방법으로 증식시키고 세척한, 표 4에 기재한 미생물의 세포를 표 3의 반응용액 B에 가하여 5g/dl에 상당하는 양이 되게 하고(최종상태 : pH 5.4, 5ml), 37℃에서 16시간 동안 유지시킨다. 생성된 아스파르틸 페닐알라닌 이소프로필에스테르를 아미노산 분석기로 정량하고, 얻은 결과를 표 4에 기재한다.
[표 3]
Figure kpo00003
* 상기의 기질을 0.1M 인산 완충액에 넣는다(최종 pH 5.4).
[표 4]
Figure kpo00004
[실시예 3]
실시예 1과 유사한 방법으로 증식시키고 세척한 플라보박테리움 세와넨스 FERM-BP 476(한국기탁기관 : 한국종균협회, 기탁번호 : KFCC-10101, 기탁일 : 1984. 7. 10) 5g을 반응용액 B 100ml에 넣고, 37℃에서 24시간 동안 반응시킨다.
생성된 반응용액을 띠의 형태로 전개하기 위한 TLC 판에 점적하고, n-부탄올 : 아세트산 : 물=2 : 1 : 1로 이루어진 용매계로 전개시킨다. 아스파르틸 페닐알라닌 이소프로필에스테르 생성물 부분을 취하고, 증류수로 추출한다. 이어서, 생성된 반응 생성물을 결정화하여 결정을 1023mg 수득한다. 수득된 결정을 선광성, 융점 및 비회전력에 관하여 특정화한 결과, 반응용액 B로부터 수득한 생성물을 아스파르틸 페닐알라닌 이소프로필 에스테르 표본과 일치했다.
[실시예 4]
실시예 1과 유사한 방법으로 증식시키고 세척한 아르스로박터 시트레우스 ATCC l1624(한국기탁기관 : 한국종균협회, 기탁번호 : KFCC-10098, 기탁일 : 1984. 7.10) 5g을 반응용액 B 100m1에 넣고 37℃에서 24시간 동안 반응시킨다.
생성된 반응용액을 띠의 형태로 전개하기 위한 TLC 판에 점적하고, n-부탄올 : 아세트산 : 물=2 : 1 : 1로 이루어진 용매계로 전개시킨다. 아스파르틸 페닐알라닌 이소프로필에스테르 생성물의 분획을 취하고, 증류수로 추출한다. 이어서, 생성된 반응 생성물을 결정화하여 결정을 1005mg 수득한다. 수득된 결정을 선광성, 융점 및 비회전력에 관하여 특정화한 결과, 반응용액 B로부터 수득한 생성물은 아스파르틸 페닐알라닌 이소프로필 에스테르 표본과 일치했다.
[실시예 5]
L-아스파르트산 5g/dl와 L-페닐알라닌 이소프로필 에스테르 10g/dl를 함유하는 수용액(pH 5.4로 조정) 10ml를 실시예 1에서 사용한 배지와 동일한 배지 속에서 멸균조건하에 30℃에서 12시간 동안 배양한 에쉐리키아 콜리 FERM-BP 477(한국기탁기관 : 한국종균협회, 기탁번호 : KFCC-10102, 기탁일 : 1984. 7. 10)의 배양액에 부어 넣고, 용액을 멸균조건하에 pH 5.4로 조정한 다음, 10시간 동안 더 배양한다. 배지를 배양하는 동안 2시간 간격으로 조정함으로써 pH 5.4로 유지시킨다.
배양액 속에 생성된 생성물을 아미노산 분석기로 정량한 결과, 아스파르틸 페닐알라닌 이소프로필 에스테르가 489mg/dl 생성되었다.
[실시예 6]
L-아스파르트산 5g/dl와 L-페닐알라닌 이소프로필 에스테르 10g/dl를 함유하는 수용액(pH 5.4로 조정) 10ml를 실시예 1에서 사용한 배지와 동일한 배지 속에서 멸균조건하에 30℃에서 12시간 동안 배양한 브레비박테리움 리넨스 ATCC 8377(한국기탁기관 : 한국종균협회, 기탁번호 : KFCC-10097, 기탁일 : 1984. 7.10)의 배양액에 부어 넣고, 용액을 멸균조건하에 pH 5.4로 조정한 다음, 10시간 동안 더 배양한다. 배양하는 동안 배지의 pH를 2시간 간격으로 조정하여 5.4로 유지시킨다.
배양액 속에 생성된 생성물을 아미노산 분석기로 정량한 결과, 아스파르틸 페닐알라닌 이소프로필 에스테르가 479mg/dl 생성되었다.
[실시예 7]
실시예 1과 유사한 방법으로 증식시키고 세척한 플라보박테리움 세와넨스 FERM-BP 476(한국기탁기관 : 한국종균협회, 기탁번호 : KFCC-10101, 기탁일 : 1984. 7.10)을 반응용액 A(페닐알라닌 에스테르로서 페닐알라닌 n-부틸 에스테르 사용)에 가하여 5g/dl에 상당하는 양이 되게 하고(최종 조건 : pH 5.4, 5ml), 37℃에서 16시간 동안 반응시킨다.
생성된 효소 반응용액 1ℓ를 0℃에서 24시간 동안 정치시키고, 분리된 결정을 3g 여과한다. 생성물 부분을 취하여 고속 액체 크로마토그라퍼 (컬럼 : 실리콘 ODS, 용출제 : 메탄올-물)로 측정한 결과, 생성물에는 L-아스파르틸-L-페닐알라닌-n-부틸에스테르가 1.67g 함유되어 있는 것으로 나타났다. 이들 결정을 35% 염산 3.8g, 메탄올 1.0g 및 물 2.0g으로 이루어진 혼합용액에 가하고 15℃에서 7일 동안 계속 혼합한다. 생성물을 아미노산 분석기, 적외선 스펙트럼, 산 적정법, 염산 적정법으로 측정한 결과, 생성물은 L-아스파르틸-L-페닐알라닌 메틸에스테르 염산염 0.38g이었다. L-아스파르틸-페닐알라닌 부틸에스테르의 수율은 23%이다.
[실시예 8]
실시예 1과 유사한 방법으로 증식시키고 세척한 아르스로박터 시트레우스 ATCC l1624(한국기탁기관 : 한국종균협회, 기탁번호 : KFCC-10098, 기탁일 : 1984. 7.10)를 반응용액 A(페닐알라닌 에스테르로서 페닐알라닌 n-부틸 에스테르 사용)에 가하여 5g/dl에 상당하는 양이 되게 하고(최종조건 : pH 5.4, 5ml), 37℃에서 16시간 동안 반응시킨다.
생성된 효소 반응용액 1ℓ를 0℃에서 24시간 동안 정치시킨 다음, 분리된 결정을 3g 여과한다. 생성물 부분을 취하여 고속 액체 크로마토그라피(칼럼 : 실리콘 ODS, 용출제 : 메탄올-물)로 측정한 결과, 생성물에는 L-아스파르틸-L-페닐알라닌 n-부틸에스테르가 1.65g 함유되어 있는 것으로 나타났다 이들 결정을 35% 염산 3.8g, 메탄올 1.0g 및 물 2.0g을 함유하는 용액에 가하고, 15℃에서 7일 동안 계속 혼합한다. 생성물을 여과하고, 건조시켜 무수 백색 결정을 0.39g 수득한다. 생성물을 아미노산 분석기, 적외선 스펙트럼, 산 적정법, 염산 적정법으로 측정한 결과, 생성물은 L-아스파르틸-L-페닐알라닌 메틸 에스테르 염산염 0.36g이었다. L-아스파르틸-페닐알라닌 부틸에스테르에 대한 수율은 22%이다.

Claims (3)

  1. L-아스파르트산 및 탄소수가 2이상인 L-페닐알라닌 알코올 에스테르 또는 치환되거나 비치환된 페놀 에스테르를 수성 배지 속에서 코리네박테리움(Corynebacterium), 캔디다(Candida), 크립토코쿠스(Cryptococcus), 에쉐리키아(Escherichia), 플라보박테리움(Flavobacterium), 지오트리콤(Geotrichum), 마이크로코쿠스(Micrococcus), 파키졸렌(Pachysolen), 삭카로마이세스(Saccharomyces), 트리코스포론(Trichosporon), 크산토모나스(Xanthomonas), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 엔도마이세스(Endomyces), 아르스로박터(Arthrobacter), 셀룰로모나스(Cellulomonas), 및 브레비박테리움(Brevibacterium)중에서 선택되며 L-아스파르트산과 탄소수가 2이상인 L-페닐알라닌 알코올 에스테르 또는 치환되거나 비치환된 페놀 에스테르를 축합시켜 탄소수가 2이상인 L-아스파르틸-L-페닐알라닌 알코올 에스테르 또는 치환되거나 비치환된 페놀 에스테르를 생성시킬 수 있는 미생물 또는 하나 이상의 효소를 추가로 함유하는 미생물의 효소-함유 부분과 접촉시킴을 특징으로 하여 감미제를 제조하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 미생물이 코리네박테리움 종(Corynebacterium sp.) ATCC 21251(한국기탁기관 : 한국종균협회, 기탁번호 : KFCC-10104, 기탁일 : 1984. 7.10) ; 코리네박테리움 제로시스(Corynebacterium xerosis) ATCC 373(한국기탁기관 : 한국종균협회, 기탁번호 : KFCC-10100, 기탁일 : 1984. 7.10) ; 캔디다 인터메디아(Candida intermedia) FERM-BP 508(한국기탁기관 : 한국종균협회, 기탁번호 : KFCC-10099, 기탁일 : 1984. 7.10) ; 크립토코쿠스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans) IFO 4289 ; 에쉐리키아 콜리(Escherichia coli) FERM-BP 477(한국기탁기관 : 한국종균협회, 기탁번호 : KFCC-10102, 기탁일 : 1984. 7.10) ; 플라보박테리움 세와넨스(Flavobacterium sewanens) FERM-BP 476(한국기탁기관 : 한국종균협회, 기탁번호 : KFCC-10101, 기탁일 : 1984. 7.10) ; 지오트리콤 캔디둠(Geotrichum candidum) IFO 4599 ; 마이크로코쿠스 루테우스(Micrococcus luteus) ATCC 4698(한국기탁기관 : 한국종균협회, 기탁번호 : KFCC-10096, 기탁일 : 1984. 7.10) ; 파키졸렌 탄노필루스(Pachysolen tannophilus) IFO 1007 ; 트리코스포론 캐피타툼(Trichosporon capitatum) IFO 1197 ; 크산토모나스 캄페스트리스(Xanthomonas campestris) FERM-BP 507(한국기탁기관 : 한국종균협회, 기탁번호 : KFCC-10095, 기탁일 : 1984. 7.10) ; 클루이베로마이세스 서모톨러란스(Kluyveromyces thermotolerans) IFO 0662 ; 엔도마이세스 오베텐시스(Endomyces ovetencis) IFO 1201(한국기탁기관 : 한국종균협회, 기탁번호 : KFCC-10105, 기탁일 : 1984. 7 10) ; 삭카로마이세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae) IFO 2003 : 아르스로박터 시트레우스(Arthrobacter citreus) ATCC l1624(한국기탁기관 : 한국종균협회, 기탁번호 : KFCC-10098, 기탁일 : 1984. 7 10) ; 셀룰로모나스 플라비게나(Cellulomonas flavigena) ATCC 8183(한국기탁기관 : 한국종균협회, 기탁번호 : KFCC-10103, 기탁일 : 1984. 7.10) 및 브레비박테리움 리넨스(Brevibacterium linens) ATCC 8377(한국기탁기관 : 한국종균협회, 기탁번호 : KFCC-10097, 기탁일 : 1984 7.10)로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 미생물을 호기성 조건하에 pH 4 내지 8 및 온도 25 내지 40℃에서 1 내지 10일 동안 배양시키는 방법.
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