DK143286B - Fremgangsmaade til fremstilling af bakteriecellemasse - Google Patents

Description

|j| (12) FREMLÆGGELSESSKRIFT ου 143286 B

(tff»

(19) DANMARK

DIREKTORATET FOR PATENT- OG VAREMÆRKEVÆSENET

(21) Ansøgning nr. 2326/77 (51) tntCI.3 C 12 N 1/32 (22) Indleveringsdag 22. jul. 1977 (24) Løbedag 22. jul. 1977 (41) Aim. tilgængelig 25· jan. 1978 (44) Fremlagt 3· aug. 1981 (86) International ansøgning nr. -(86) International indleveringsdag -(85) Videreførelsesdag -(62) Stamansøgning nr. -

(30) Prioritet 24. jul. 1976, 2633451 i DE

(71) Ansøger HOECHST AKTIENGES ELLS CHAFT, 6230 Frankfurt/Main 80, DE.

(72) Opfinder Paul Praeve, DE: Dieter Sukatsch, DE: Uwe Faust, DE.

(74) Fuldmægtig ingeniørfirmaet Budde, Schou & Co.

(54) Fremgangsmåde til fremstilling af b akt eri ecellemas s e.

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af bakteriecellemasse, der indeholder en stor mængde protein og desuden fedtstoffer, carbonhydrater og vitaminer. Cellemassen tjener som grundsubstans for fodermidler.

Kendte metoder til fremstilling af bakteriecellemasse ved hjælp af bakteriestammer, der vokser på methanol som eneste carbonkilde, D r O fører ofte til produkter, der indeholder farvestoffer, slim eller ^ uønskede reservestoffer såsom polyhydroxysmørsyre, hvorved deres eg- t nethed som fodermidler indskrænkes stærkt. Lugt, smag eller toksiske egenskaber hos sådanne ledsagende stoffer kan forhin-t, dre en sådan anvendelse.

Il 2 143286

Man har nu fundet en ny stamme af slægten Methylomonas, der som carbonkilde kan bruge methanol, methan eller dimethylamin. Denne stamme er nybestemt som Methylomonas clara FH-B-5460 og deponeret i American Type Culture Collection under betegnelsen ATCC 31226.

Fremgangsmåden til fremstilling af bakteriecellemasse ifølge opfindelsen ved dyrkning af bakterier af slægten Methylomonas under aerobe betingelser i et næringsmedium indeholdende methanol som carbonkilde, nitrogenkilder og mineralsalte er ejendommelig ved, at der anvendes en stamme af arten Methylomonas clara ATCC 31.226, og at koncentrationen af methanol ligger mellem 5 og 150 dpm beregnet på vægten af næringsmediet. Methanol er den eneste carbonkilde.

Foretrukket er en methanolkoncentration, der ligger mellem 5 og 100 dpm. Særlig foretrukket, især til kontinuerlig drift, er en methanolkoncentration mellem 5 og 30 dpm.

Fremgangsmåden foregår i godt udluftede fermentationsbeholdere, der indeholder et næringsmedium, der foruden methanol som eneste carbonkilde indeholder salte såsom kaliumnitrat, ammoniumsulfat, ammoni-umphosphat eller ammoniak som nitrogenkilde. Desuden indeholder det phosphater såsom kaliumdihydrogenphosphat eller dinatriumhydrogen-phosphat samt magnesium- og kaliumsalte; desuden spor af grundstoffer, således som de indeholdes i ledningsvand, altså især jern-, kobber- og molybdænsalte.

Fremgangsmåden gennemføres fortrinsvis ved temperaturer mellem 30 og 42°C, fortrinsvis mellem 35 og 39°C.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan foregå i kendte fermentationsbeholdere, f.eks. i luftgennemstrømmede rørkedler eller også i moderne gæringsbeholdere såsom "slynge"reaktorer med afbrudt eller kontinuerlig drift.

Det flydende næringsmedium i fermentationsbeholderen udluftes med 0,1-1,5 liter luft pr. liter næringsmedium og minut (vvm).

Den methanolkoncentration, der skal opretholdes, kan styres kontinuerligt ved forskellige forholdsregler, f.eks. ved måling af nitrogenforbruget, af mængden af baktericellemasse i suspensionen eller fortrinsvis ved måling af carbondioxidproduktionen. Denne regulering kan med særlig fordel også ske ved hjælp af målingen af gasformig methanol med en flammeioniseringsdetektor.

pH-værdien af den kultursuspensionen, der består af næringsmedium og den voksende bakteriecellemasse, ligger fortrinsvis mellem 4,0 og 9,0, særlig foretrukket mellem 6,0 og 7,2. Når kultursuspensionens pH-værdi falder under den foreskrevne værdi, tilsættes der en tilsvarende mængde alkali, f.eks. natriumhydroxid- eller kaliumhydroxidop 3 143286 løsning. En for høj pH-værdi reguleres ved tilsætning af syre, f.eks. saltsyre eller svovlsyre.

Fraskillelsen af bakteriecellemassen sker på gængs måde, f.eks. ved centrifugering under flere gange vask med vand. Hertil kan der anvendes dekanteringsmidler og separatorer. Man får således en pastaagtig bakteriecellemasse, der stadig indeholde 75-90 vægtprocent vand.

Tørringen kan ske på forskellige måder, f.eks. ved valsetørring, tørring i hvirvellag eller sprøjtetørring. Det således tørrede produkt indeholder kun 1-4 vægtprocent vand og 80-90 vægtprocent råprotein. I dette råprotein er mængden af aminosyre 75-78 vægtprocent, idet mængden af essentielle aminosyre er ca. 50 vægtprocent af det samlede indhold af aminosyre. Produktets indhold af nucleinsyre, fedt og carbonhydrater er lavt. Nucleinsyreindholdet ligger mellem 10 og 14 vægtprocent, indholdet af fedt ligger mellem 5 og 10 vægtprocent, og indholdet af carbonhydrater ligger mellem 5 og 10 vægtprocent .

Særlig fordelagtigt er det, at den ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede tørrede bakteriecellemasse ikke indeholder pigmenter, toksiske stoffer, reservestoffer såsom slim eller poly-hydroxysmørsyre, ødelæggende lugtstoffer eller sekundære metabolitter.

Den ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen opnåede tørrede bakteriecellemasse er derfor i særlig udstrækning egnet som kilde for æggehvidestoffer til dyrefoder.

Den ny art Methylomonas clara FH-B-5460 ATCC 31226 kan karakteriseres som følger.

I. Vækstbetingelser a) Ingen vækst på Glukoseagar eller glukosemedium, kød- bouillonagar eller kødbouillonnærings-medium, gelatine, peptonagar eller -medium, lakmusmælk, kartoffelnæringsmedium og aminosyrenæringsmedium.

b) Vækst på Ilethanolholdigt syntetisk næringsmedium II. Morfologi a) Korte små stave på 0,5-1,5 ji, bevægelige ved polære fimrehår, ingen sporedannelse, cystedannelse.

b) Koloniformen rund, gennemskinnelig, let glinsende.

c) Ingen pigmentdannelse.

4 143286 III. Fysiologi a) Vækst ved: 20°C -, 25°C + 30°C ++ 35°C +++ 37°C ++++ 39°C +++ 41°C +

Optimal væksttemperatur: 37°C Optimal pH-værdi: 6,8-7,0 Gram-negativ b) Vækstfaktorer ikke påkrævet c) Vækstbetingelser

Polyhydroxysmørsyredannelse

Indoldannelse

Acetonedannelse

Reduktion af NO^ +

Cytochromoxidase +

Katalase +

Isoci tratdehydrogenase +

Malatdehydrogenase +

Oxidase +

Dannelse af I^S Smeltning af gelatine Stivelseshydrolyse Citronsyredannelse Mælkekoagulering Vækst på

Ammoniumsalte +

Urinstoffer

Acetat

Dimethylamin +

Trimethylamin

Monomethylamin 5 143286

Formiat Formaldehyd Sukker, Polysaccharid Alkoholer (excl. methanol) ^-fiksering + CC>2“f iksering +

De kendte Methylomonas-arter og andre methanolforbrugende mikroorganismer er beskrevet i Bergey's Manual of Determinative Bac-terology, 8. udg., Williams & Wilkens Company, Baltimore 1974; desuden er beslægtede stammer blevet karakteriseret i forskellige publikationer. Nedenstående tabel I viser teknikkens stade i sammenligning med de karakteristiske egenskaber hos den nye art Methylomonas clara. Som tabellen viser, er Pseudomonas-arterne forskellige ved dannelsen af polyhydroxysmørsyre og manglende vækst på methan eller dimethylamin som hos den nye art. L)é Kendte Methylomonas-arter adskiller sig fra den nye art ved temperaturoptimum, pigmentdannelse, poly-hydroxysmørsyredannelse og kokke-form. Et yderligere vigtigere adskillelsekendetegn mellem den nye art og kendte arter er hexylose-phosphatvejen. Denne er hos den nye art energetisk begunstiget i forhold til methanoludnyttelsens serinvej.

I nedenstående tabel betyder G+C (%) i slutningen af første kolonne guanin- og cytosinmængden i det samlede indhold af pyrimi-dinbaser.

I kolonne 2 karakteriseres den nye art Methylomonas clara ATCC 31266.

I kolonne 3-7 samt 11 er anført beslægtede stammer, der er beskrevet i Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. udg., 1974, The Williams & Wilkens Company, Baltimore.

I kolonnerne 8-10 er angivet beslægtede arter fra nogle enkelte publikationer. Det drejer sig om Pseudomonas methanolica, der er beskrevet i USA patentskrift nr. 3.755.082, Pseudomonas AM 1, der er beskrevet i J. Bact. 114 (1), 390 (1973), og Pseudomonas me-thylotropa, der er beskrevet i tysk fremlæggelsesskrift nr. 2.161.164.

Nærværende patent omfatter ikke fremgangsmådens anvendelser ved tilvirkning af næringsmidler.

Følgende eksempler illustrerer fremgangsmåden ifølge opfindel-? sen yderligere.

6 U328G

HSS < ι-3 S'o 2 tS »ti W ^ O

Cl DH-nfl S S' rt CD © ffi CD O O to S H- © O © “*ioo 8 *· g OJ M i w m < η h + Ξ Η-Ί ’Ij-HjiffU1 (1¾ I Hi C/3 3 ffi 3 H 1

^333 jiJHmjj λ. l-h H'- CD i) CD I

n rt n> <--u ^ Ο o P 3 Η- · Η- Ϊ"Τ 3 © m m i—1 0 Ό 0 H ?rcn rt-H r+ rt r·, _Mg H fi« U Dj 3 03 © P· i-· ^ °* k*< 2-5" (+ © H- CD H OJiQ ti rt IH- 3 S’ ti Ξ § ^ .8 · · · 3 H F- 3 3 © (i

-^-3 0-¾ H- O O 3 iD ©Di H

^ anooDniQiQ η © °* (+111 O © M © < ?f X to 3 © /5 Η- H- F- t< I >_p ~ Η Η H H “ pi Dj Di © w CD CD © t1_ L:0 Methylomonas'clara ρη F FH-B-5460 ' + ø+ ++ 1 ^ B 0 0 1 Q + s X ATCC 31226 2 L2J b Γ1 U1"

CO

y, rt, Methylomonas 0 ΡΠ m 2 S' methanica 3 1 + 1 + EJ + 1 1 0 i3 * .£ -

O

------------------—----------- ta S)

Methylomonas 4 g1

o ΡΠ Π r~i π rf -i methano- H

J, +I + + joJULJU' ' + ^ * oxidans h © . Methylomonas

tn 03· . C

o i—> i—i t+N»-· methanom- 3 J, + +++ + B 0 + trificans •c. ro j_ Methylococcus g + + + 0 ^ + ' 1 1 * 1 ticus tn Π) ____________LssJ__ o jMethylosinus . B methylocystis 7 tn __ _ ___ _ __ __ ______-

Ps.methanolica α • + 0 ______ g, + + |>Pseudomonas AM 1 9 r? Ps .methylotropha 10 tn » '0+ 1 ' + Φ to [Tli i + + ii+j Methylomonas .. 11 ^ methanica

i U32SG

Eksempel 1

Stammen Methylomonas clara FH-B-5460 ATCC 31266 holdes ved dyrkning på små skrå rør med følgende sammensætning:

Agar 18 g 85%'s H3P04 2,0 ml 12%'s NH4OH 3,0 ml

NaHP04 0,01 g H2S04 1,2 g

MgS04 . 7 H20 0,8 g

FeS04 . 7 H20 0,03 g

Methanol (tilsat før rørene tappes) 10,0 ml

Sporelementopl.*^ 1,0 ml

Vand 1 liter pH før sterilisation 6,7 *) indeholder CuSO^, H^BO^, MnS04, ZnS04 og Na2Mo04

De skrå rør med denne sammensætning opvarmes 30 minutter i en autoklav til 120°C. Derefter podes rørene med Ilethylomonas clara og holdes i 2 døgn på 37°C. Fra to rør vaskes cellemassen med 10 ml fysiologisk kogsaltopløsning og overføres til næste trin.

Dette trin er en rystekultur (forkultur), hvor der anvendes en Erlenmeyerkolbe på 2 liter, der fyldes med 1 liter næringsopløsning som ovenfor, dog uden agar, og hertil sættes 3,3 ml methanol (filtreret sterilt). Denne kultur holdes i tre døgn ved 37°C i rystemaskinen, der kører med 220 0/m og en amplitude på 4 cm. Efter 24 og 48 timers forløb tilsættes 3,3 ml methanol.

Det følgende trin (hovedkultur) foretages i en fermenteringsbeholder med et volumen på 25 liter, der fyldes med ca. 20 liter af o-venstående næringsopløsning, dog uden methanol og uden agar. Efter sterilisering (30 min./120°C/l,2-l,4 bar) podes fermenteringsbeholderen med 2 liter forkultur. Fermenteringsbetingelserne i fermenteringsbeholderen, der er udstyret med en bladomrører, ventilationskrans og tre skvulpeplader, er følgende:

Temperatur 37°C

Udluftning 10 liter/min. 0,5 vvm

Tryk 0,2 bar

Omdrejningstal 500 o/m pH-værdi 6,6 8 143286

Methanol tilsættes på forhånd med 20 ml; hver gang cellernes CC^-produktion falder, tilsættes yderligere 20 ml methanol. Methanol-koncentrationen bliver derved ikke mere end 0,1 volumenprocent.

Efter 22 timer overføres hovedkulturens 20 liter kultursuspension til en forfermenteringsbeholder på 200 liter. Denne fermenteringsbeholder behandles nøjagtig som hovedkulturen, og den er udstyret på samme måde. Fermenteringsbetingelserne er:

Temperatur 37°C

3

Udluftning 6-8 m /h 0,5-0,75 vvm

Tryk 0,2 bar

Omdrejningstal 380 o/m pH-værdi 6,7 pH-værdien holdes med 10%'s sterilt ammoniakvand på 6,7-6,8. Methanoltilførslen reguleres ved måling af methanolkoncentrationen i afgangsluften ved hjælp af et FID (flammeioniseringsdetektor), idet ethvert fald i methanolværdien under 50 ppm medfører yderligere tilsætning af methanol. Ved 600 vpm methanol i udgangsluften er der 0,22% methanol i opløsningen.

Efter 20 timers fermentering podes en hovedfermenteringsbeholder med 200 liter kultursuspension fra forfermenteringsbeholderen; den indeholder 2000 liter næringsopløsning og har følgende driftsbetingelser:

Temperatur 37°C

Udluftning 60-80 m^/h 0,5-0,75 wm

Tryk 0,2 bar

Omdrejningstal 170 o/m pH-værdi 6,7

Tilsætningen af methanol sker som i forfermenteringsbeholderen på 200 liter. Methanolkoncentrationen ligger ved 50-80 ppm i næringsopløsningen. Efter 22 timers fermenteringstid høstes bakteriecellemassen. Hertil bringes kultursuspensionens pH ved tilsætning af fortyndet svovlsyre på 4,0, og cellemassen slynges i separatoren ved 400 o/m.

Man kan også slynge ved pH 6,5-6,8. Den slyngede cellemasse (tørstofindhold 20%) vaskes med vand og bringes derefter i separatoren til et tørstofindhold på 25%. Herefter tørres cellemassen i en sprøjtetørrer ved en indgangstemperatur på 120-150°C. Det således fremkomne pulver indeholder stadig en restfugtighed på 1,5-3,5% samt 9 143286 (N x 6,25) råprotein 85%

Aminosyrer 74%

Essentielle aminosyrer heraf ca. 50%

Nucleinsyrer 8-12% Råfedt 6- 8% Råaske 5- 6% (procentangivelserne er vægtprocent).

Eksempel 2

Stammen Methylomonas clara FH-B-5460 ATCC 31266 dyrkes som beskrevet i eksempel 1.

Hovedfermenteringsbeholderen er på 3000 liter og beregnet til kontinuerlig fermentering under stadig ventilering. Dens driftsbetingelser er følgende:

Temperatur 37°C

3

Udluftning 80 Nm /h 0,67 vvm

Tryk 0,1 bar

Omdrejningstal 390 o/m pH-værdi 6,8

Der podes med 200 liter kultursuspension fra forfermenteringsbeholderen; den indeholder 2000 liter næringsopløsning (som beskrevet i begyndelsen af eksempel 1, dog uden agar). Methanolkoncentrationen måles som beskrevet ovenfor og reguleres ved tilsætning af methanol/ vand i et volumenforhold på 40:60, således at der opretholdes en fri middelmethanolkoncentration på 10-50 ppm methanol i næringsopløsningen.

Efter produktion af 7-10 kg cellemasse/liter optages kontinuerlig drift.

Med en gennemstrømningshastighed (D) på 0,25/h tilsættes næringsmediet; dette tal øges efter ca. 12 timer til D = 0,33/h, hvilket udgør ca. 650 1/h. Efter dette tidspunkt har strømningsligevægten reguleret sig ind. Den frie middelmethanolkoncentration holdes nu mellem 10 og 20 ppm. Den tilsvarende mængde tilgroet næringsmedium fjernes, holdes i en mellembeholder uden tilsætning af methanol i 1-2 timer og tilføres derefter til cellefraskillelse og tørring som beskrevet i eksempel 1.

Den således opnåede cellemasse indeholder 2-4% restfugtighed samt ίο 143286 Råprotein (N x 6,25 81%

Aminosyrer 70%

Essentielle aminosyrer 50% af de samlede aminosyrer Nucleinsyrer 8-10% Råfedt 5-10% Råaske 5-10%