NO140800B - Fremgangsmaate for fremstilling av encelleprotein ved dyrking av en blandet kultur av mikroorganismer - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse gjelder en fremgangsmåte for fremstilling av éncelleprotein ved dyrking av en blandet kultur av mikroorganismer. Det er kjent mange mikroorganismer som kan utnytte hydrokarboner eller visse oksygenerte eller andre derivater av dem som karbon- og/eller energikilde. Den tørkede biomasse som oppnås ved dyrking av slike mikroorganismer, ofte referert til som éncelleprotein, er rik på protein oq kan anvendes som et mulig næringsmiddel eller næringstilskudd for mennesker og dyr. Av spesiell interesse i denne forbindelse er mikroorganismer som kan utnytte gassformige organiske forbindelser som inneholder ett eller flere karbonatomer i molekylet, eksempelvis metan.

Det er et formål med foreliggende oppfinnelse å skaffe

en forbedret fremgangsmåte for dyrking av metan-utnyttende mikroorganismer.

Ifølge oppfinnelsen tilveiebringes en fremgangsmåte for fremstilling av éncelleprotein ved dyrking av en blandet kultur av mikroorganismer under aerobe betingelser i et flytende dyrkningsmedium omfattende assimilerbare nitrogenkilder og essensielle mineralsalter og i nærvær av metan, hvorefter organismecellene isoleres fra dyrkningsmediet og tørres. Fremgangsmåten karakteriseres ved at det anvendes en blandet kultur av mikroorganismer som består av a) Methylomonas NCIB 11084, b) Pseudomonas NCIB 11112 eller Hypomicrobium NCIB 11040 og c) Pseudomonas NCIB 11019, NCIB 11022,

NCIB 11062, NCIB 11063, NCIB 11065, Mycobacterium NCIB 11061, Acinetobacter NCIB 11020 og/eller Curtobacterium NCIB 11021.

US-patent 3.649.459 beskriver en blandet kultur og

anvendelse av denne ved fremstilling av et proteinholdig produkt.

Det er imidlertid hverken beskrevet eller antydet i patentet at

den blandede kultur i tillegg til den metan-utnyttende mikro-

organisme også skal inneholde en metanol-utnyttende organisme

og én eller flere ikke-metylotrofiske bakterier, slik som ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse. De blandede kulturer som anvendes ved fremgangsmåten ifølge nevnte amerikanske patent, omfatter åpenbart bare én dominerende organisme (den metan-utnyttende) og andre uidentifiserte mindre bakterier og gjærceller (se spalte 3, linje 3-15) . I foreliggende eksempel 1 er det vist at det oppnås forbedret bakterievekst når det i tillegg til den metan-utnyttende organisme også anvendes en metanol-utnyttende organisme og ikke-metylotrofiske organismer. Dette kunne ikke forutsies på grunnlag av ovennevnte US-patent.

En annen bemerkelsesverdig fordel ved anvendelse av den blandede kultur ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen sammenlignet med den fremgangsmåte som er beskrevet i US-patent 3.649.459,

er at man får et produkt med et høyt proteininnhold. Det vil av resultatene angitt i foreliggende eksempel 4 fremgå at med fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen får man éncelleprotein med et proteininnhold på ca. 78%, sammenlignet med bare 34,0% ved den kjente fremgangsmåte (se tabell 2, spalte 5 i US-patentet).

Det er funnet at det i den ovenfor nevnte blandede mikroorganismekultur er en.synergistisk virkning som resulterer i en større veksthastighet og større utbytte av mikroorganismer enn når de metan-utnyttende mikroorganismene dyrkes alene eller når metan- og metanol-utnyttende mikroorganismer dyrkes sammen. Visse andre fordeler oppnås i fremgangsmåter som anvender slike blandekulturer, innbefattet en øket motstandskraft mot infeksjon og minsket skumdannelse sammenlignet med fremgangsmåter som anvender bare en mikroorganismeart.

Metanol er kjent å være et mellomprodukt ved mikrobiell metanutnyttelse og kan som sådant være tilstede i>kulturmediet under dyrkingen av metan-utnyttende bakterier. Nærvær av metanol-utnyttende mikroorganismer i tillegg til den metan-utnyttende bakterie kan således antagelig øke utbyttet av mikroorganismer fra en gitt vektmengde metan ved å gi en mer fullstendig omdannelse av metanet til biomasse og dette har blitt bekreftet av søkeren. Utbyttet ble ytterligere øket i nærvær av en tredje gruppe av

(ikke metylotrofiske) mikroorganismer. Denne observasjon kan for-klares som følger: De ikke-metylotrofiske organismene utnytter organiske substanser som er fremstilt under omdannelsen av metan og metanol og øker derved utbyttet av biomasse, fjerner hindrende stoffskifteprodukter og frembringer vekstfremmende molekyler. Blandekulturer for anvendelse ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan oppnås på en av to måter: a) Blandkulturer omfattende den metan-utnyttende mikroorganisme i forbindelse med de metanol-utnyttende mikro-organismer

og de ikke-metylotrofiske mikroorganismer kan isoleres fra natur-kilder. En spesielt foretrukket blandkultur betegnet T3 i eksemplene (og som har NCIB deponeringsnummer 11085) er isolert og funnet å omfatte den metan-utnyttende mikroorganisme som er karakterisert ved rekkeformede membraner og betegnet SM3 (NCIB 11084), den metanol-utnyttende mikroorganisme av en ny art betegnet OML (NCIB 11112) og de fire ikke-metylotrofiske mikroorganismer betegnet M^, M2, og M. i eksemplene. Organismen er en Pseudomonas-art (NCIB 11062), organismen M2 er en Mycobacterium-art (NCIB 11061), organismen er en Pseudomonas-art (NCIB 11063) og M4 er en Pseudomonas-art (NCIB 1106 5).

b) Egnede blandkulturer kan også oppnås ved å kombinere SM3 med én eller begge de metanolutnyttende mikroorganismer og en

eller flere av de ikke-metylotrofiske mikroorganismer.

En annen egnet metanol-utnyttende mikroorganisme er Hyphomicrobium NCIB nr. 11040.

Den foran nevnte blandkulturen T3 (NCIB 11085) og stammene SM3 (NCIB 11084), OML (NCIB 11112), (NCIB 11062),

M2 (NCIB 11061), M3 (NCIB 11063) og M4 (NCIB 11065) er alle nye mikroorganismer.

Det flytende vekstmediet omfatter også en nitrogenholdig forbindelse som kan være ammoniakk, urea eller et ammoniumsalt som f.eks. sulfatet, kloridet eller nitratet, f.eks. et alkali-metallnitrat. Forbindelsen er passende tilstede i en konsentrasjon av fra 3-50 g/l.

Andre elementer som kan forefinnes i mediet er fosfor, svovel, magnesium og jern. Fosforkilden er fortrinnsvis et eller flere fosfater, eksempelvis K2HP04, KH2P04> Na2HP04 eller (NH4)2HP04 eller fosforsyre, fortrinnsvis nærværende i en konsentrasjon fra 3-20 g/l. Svovelkilden kan være svovelsyre eller et sulfat som f.eks. (NH4)2S04 passende i en konsentrasjon fra 0,5-5,0 g/l. De to metallene tilsettes i form av et eller annet salt, eksempelvis MgS04'7H20 i en konsentrasjon fra 0,2-

2,0 mg/l og FeCl,*6H20 i en konsentrasjon fra 0,01-0,1 g/l.

Mediet kan også inneholde spormengder av andre elementer i form av egnede salter, eksempelvis kalsium, mangan, sink, kobolt, molybden og bor. Eksempler på egnede medier er angitt i eksemplene.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan utføres batch-vis, halvkontinuerlig, men fortrinnsvis i kontinuerlig flytende kultur. For å oppnå vekst inokuleres mikroorganismene i mediet som bringes i kontakt med en metan- og oksygenholdig gassblanding.

Metan kan tilføres i form av naturgass. For kontinuerlig flytende kultur kan mikroorganismene dyrkes i et hvilket som helst til-

passet gjæringskar, f.eks. et omrørt gjæringskar med flenser eller et gjæringskar i form av .et overrislet tårn, som enten er utstyrt med indre kjøling eller en ytre resyklert kjølesløyfe. Friskt medium pumpes kontinuerlig inn i kulturen i mengder som er ekvivalente med 0,02 til 1,00 kulturvolumer pr. time og kultur fjernes slik at kulturvolumet forblir konstant. En metan- og oksygenholdig gassblanding som også kan inneholde karbondioksyd eller andre gasser, bringes i kontakt med mediet, fortrinnsvis ved kontinuerlig bobling gjennom en spreder ved karets nedre del. Oksygenkilden for kulturen kan være luft, oksygen eller oksygen-

anriket luft. Brukt gass fjernes fra karets øvre del. Brukt gass kan resykleres enten gjennom en ytre sløyfe eller innvendig ved hjelp av en gassinnføringsrører. Gasstrømmene og resykleringene bør arrangeres slik at de gir maksimal vekst hos organismene og maksimal utnyttelse av metan.

Temperaturen i kulturen holdes vanligvis mellom 30 og 50°C

og fortrinnsvis fra 38 til 45°C. Kulturens pH reguleres til mellom 6,0 og 8,0 og fortrinnsvis mellom 6,4 og 7,4 ved tilsetning av.alkali, f.eks. NaOH, KOH, NH^OH og/eller en syre, f.eks.

H2S04 eller H3P04-

Mikroorganismecellene kan høstes fra dyrkningsmediet ved

vanlig anvendte standardteknikker, for eksempel flokkulering, sedimentering og/eller utfelning, fulgt av sentrifugering og/eller filtrering. Biomassen tørkes så, f.eks. ved fryse- eller spraytørking og kan anvendes i denne form som et protein-

næringsmiddel eller næringsmiddelsupplement for mennesker eller dyr. Oppfinnelsen illustreres ytterligere ved følgende eksempler.

Isolering av bakteriekulturer som dyrkes med metan

En blandbakteriekultur som vokser på metan ble isolert fra

en gjørmeprøve uttatt fra en tropisk andefarm. To gram av prøven ble innført i en 250 ml rystekolbe inneholdende 2 5 ml ISM-medium (beskrevet i eksempel 1) og gasset to ganger daglig med en gassblanding inneholdende 25% metan og 75% luft. Kolben ble inkubert på en roterende ryster med en baneradius på 2,5 cm med 200 omdr./min.

i en uke. Den kultur som det hadde utviklet seg en uklarhet i

ble anvendt som under-kultur ved å anvende 2 ml innpodningsvæske i en lignende rystekolbe under iakttagelse av aseptiske forsiktighets-regler. Dette ble gjentatt flere ganger og når det var oppnådd reproduserbar god vekst ble rystekolbekulturen anvendt for inokulering i en fermentator av den type som er beskrevet i eksempel 3. Egenskapene for kulturen, betegnet med T3, er beskrevet i detalj i det følgende.

Mikrobiologiske egenskaper for kulturen T3

1) Kulturen består av en obligatorisk metan-utnyttende

bakterie betegnet med SM3 (NCIB 11084) som dyrkes i forbindelse med en metanolutnyttende bakterie og arter av ikke metylotrofiske bakterier. Den metan-utnyttende organisme SM3 (NCIB 11084) har en noe variabel morfologi, opptrer som korte staver eller kokke-

staver, og har en indre membranstruktur av parallelle stabler i cellen. Denne organisme vokser bare lite når den bare tilføres metan. På basis av den ovenfor angitte beskrivelse synes organismene å være en tidligere ikke beskrevet art av en Methylomonas-type (NCIB 11084).

2) Den metanol-utnyttende organisme betegnet med OML

(NCIB 11112) er karakterisert ved sin evne til å vokse og danne

kolonier bare på metanolholdige agarplater som eneste karbonkilde.

Ingen vekst forekommer i nærvær av glukose, laktose, sukrose,

mannitol, inositol, citrat eller næringsagar. Organismen er omtrent 2u lang og ly bred, med et enkelt polart flagellum.

Kolonier på agar er glatte og grå med en udelt rand og opptrer på metanol/mineralsalt-agarplater efter inkubering i 2 dager ved 42°C.

På basis av den ovenfor gitte beskrivelse synes organismen å

være en tidligere ikke beskrevet art av en Pseudomonas-type

(NCIB 11112) .

3) Andre typer av organismer ble isolert fra blandingen

og disse vokste hverken på metan eller metanol som eneste karbon-

kilde. Disse ble betegnet M^, M2, M^ og M^.' Disse ble underkastet standardtester for å bestemme til hvilken generell klasse av mikro-organismer de tilhørte.

De tester som ble anvendt er tidligere beskrevet i slike standard-arbeider som: a) "Manual for the Identification of Medical Bacteria", S. T. Cowan og K. J. Steel, Cambridge University Press (1966).

b) "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology", 7de utgave,

Williams og Wilkins (1959) og

c) "A Guide to the Identification of the General of Bacteria",

V. B. D. Skerman, 2dre utg., Williams og Wilkins (1967).

For noen av disse tester er det tilgjengelig alternative fremgangsmåter og ytterligere detaljer er i korthet angitt nedenfor for å påvise de testmetoder som anvendes i de aktuelle tilfeller.

Oksydasetest - Kovacs, 1956,

Indolproduksjon - Kovacs-reagens, 1928

Voges-Proskauer-test - Barritt, 1936,

Ureaseproduksjon - Oksoidmedia, Christensen-medium, 1946 og Citrat-utnyttelse - vekst på Simons citratskrå,

bekreftet i Koser's medium.

Resultatene av disse testene er vist i tabellene 1 og 2.

Fra resultatene av testene kan følgende konklusjon trekkes når det gjelder organismenes identitet:

Organisme er en Pseudomonas-art (NCIB 11062). Organisme M2 er en Mycobacterium-art (NCIB 11061). Organisme NU er en Pseudomonas-art (NCIB 11063). Organisme M4 er en Pseudomonas-art (NCIB 11065).

Eksempel I

Kulturer ble dyrket fra blandinger av følgende bakterier:

Et næringsmedium basert på det som er beskrevet av Sheehan & Johnson (herefter referert til som medium ISM) ble fremstilt og dét inneholdt følgende ingredienser:

Kulturer ble dyrket i sterile glasskår med et volum på

500 ml som.det-ble boblet en kontinuerlig blanding av metan og.

luft gjennom.

Apparatet besto av en serie kar som det ble boblet en blanding-av.metan (25%) og luft (75%) gjennom via et sintersol-filter. Apparatåpningene tillot inokulering og prøvetagning av kulturen. •

Kolbene ble inokulert med 1,5 ml av en frisk kultur

(24 timer gammel) av hver av de 4 organismene som er betegnet med M^, M2, M3 og M4- 4 ml av både de metan-utnyttende (SM3) og metanol-utnyttende bakteriene ble tilsatt fra 2-3 dager gamle kulturer som var dyrket i rysteflasker på ISM-medium.

Mediet i karene var 400 ml av ISM-medium som er beskrevet ovenfor og veksten ble fulgt ved å måle optisk densitet (OD) ved 625 nM bølgelengde.

Resultatene er gjengitt i tabell 3. Disse resultater viser

at en blandkultur er nødvendig for å oppnå best vekst på metan.

Situasjonen forbedres litt ved nærvær av metanol-utnytteren, men for å oppnå best vekst er alle bestanddeler nødvendige.

Disse resultater er middelverdiene fra 3 forsøk som hvert blir gjentatt 2 eller 3 ganger.

Eksempel 2

Følgende forsøk ble utført for å se om komponentene i kultur T3 kunne erstattes med andre mikroorganismer med lignende funksjoner. Kulturer oppsettes i boblede glasskår som i eksempel 1, men i noen tilfeller erstattes metanol-utnytteren fra kultur T3

med den metanolutnyttende organisme NCIB 11040. På tilsvarende måte erstattes de ikke metylotrofiske organismene fra T3 med de ikke-metylotrofiske organismene med NCIB-numrene 11019, 11020, 11021 og 11022. Resultatene av disse forsøk er vist i tabell 4.

Forskjellen mellom tallene i de vertikale kolonnene i tabell 6 er ikke signifikant. Det kan derfor konkluderes med at den metanolutnyttende organisme NCIB 11040 kan anvendes istedenfor OML. På lignende måte kan de ikke-metylotrofiske organismene erstatte hverandre.

Eksempel 3

Gjæringer med anvendelse av kulturen T3

Kulturen ble dyrket kontinuerlig på mineralmedium, metan og luft. Et"Biotec" gjæringskar (fermentator) med arbeidsvolum på 2,5 liter ble anvendt. Metan og luft ble innblåst i den flytende blandingen i en mengde av 150 ml/min og 4 50 ml/min respektive. Temperaturen i mediet ble regulert til 42°C og pH til 7,4 ved automatisk tilsetning av 2n'NaOH. Mediet ble omrørt med en hastighet av 1000 omdr/min. og arbeidstrykket i gjæringskaret var bare litt over atmosfæretrykk.

Det flytende mediet betegnet med SJ4 som ble anvendt for kontinuerlig kultur hadde følgende sammensetning: Sporelementløsningen som brukes for fremstilling av mediet hadde følgende sammensetning:

Denne forrådsløsning ble tilsatt til resten av mediet i en konsentrasjon av 1 ml/l som nevnt ovenfor.

Gjæringskaret ble først fylt med 2 liter ISM-medium

(se eksempel 1), omrørt, luftet og tilsatt metan som beskrevet ovenfor. Det ble inokulert med 100 ml helt ferdigvokst ryste-flaskekultur T3. Straks vekst hadde funnet sted i gjæringskaret i

ble mediet SJ4 innmatet i en fortynningsgrad av 0,08 h"<1.> Dette ble øket i trinn på 0,02 h 1 med 2 dagers intervaller opp til 0,22 h 1 uten at kulturen ble utvasket. Det ble oppnådd stabile forhold hvori biomassens konsentrasjon var fra 2,5 til 6 gl ^. Dette representerer ikke på noen måte den høyeste biomasse-konsentrasjon som er oppnådd ved kontinuerlig dyrking. Kulturen ble dyrket kontinuerlig i mer enn 3000 timer. Organismer ble høstet og underkastet analyse og resultatene av analysen angis i de følgende eksemplene.

Ved ethvert stabilt forhold og spesielt fortynningsgrad ved kontinuerlig dyrking forandret ikke totalmengden av bakterier seg. Kulturen var også meget resistent mot infeksjon av fremmede mikroorganismer, slik at det ikke kunne oppdages besmittelse selv når kulturen med overlegg ble infisert med fremmede organismer.

Eksempel 4

En blandkultur av metan-utnyttende bakterier ble dyrket

i kontinuerlig kultur i et 300 liters gjæringskar under betingelser som i hovedsak var ekvivalente med de som er beskrevet for gjæring i liten skala. Disse cellene ble høstet ved sentrifugering og spraytørket. Et frittstrømmende, farveløst, luktfritt pulver (SCP) ble oppnådd og dette pulver besto av tørre bakterieceller. Det har et proteininnhold på ca. 78% (beregnet som N x 6,25). Ernæringskvaliteten for pulveret ble testet i rotteforingsforsøk som følger.

SCP ble matet til avvente rotter i 10 dagers forsøk slik at SCP utgjorde den eneste proteinkilden i kosten. I hvert forsøk ble det innbefattet en kontrolldiett som inneholdt kasein som eneste proteinkilde. Sildemel, en av de rikeste former for til-skudd til dyref6r, ble også gitt til rottene som sammenligning. Det rå protein-nivå (N x 6,25) i hver diett, var 10%, men alle andre næringsmidler ble gitt i mengder som var adekvate for optimal vekst. Resultatene av mateforsøkene er vist i tabell 5.

Av tabell 5 kan det sees at SCP fremstilt fra en blandkultur av bakterier som vokser på metan er en tilfredsstillende proteinkilde. Det er faktisk bedre enn sildemel som nærings-bestanddel i dyrefSr.

Aminosyrespektret for SCP ble analysert og resultatene er vist i tabell 6. Disse resultater indikerer at aminosyre-balansen er slik at SCP er meget egnet som proteinfCr til dyr.

Claims (4)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av éncelleprotein ved dyrking av en blandet kultur av mikroorganismer under aerobe betingelser i et flytende dyrkningsmedium omfattende assimilerbare nitrogenkilder og essensielle mineralsalter og i nærvær av metan, hvorefter organismecellene isoleres fra dyrkningsmediet og tørres, karakterisert ved at det anvendes en blandet kultur av mikroorganismer som består av a) Methylomonas NCIB 11084, b) Pseudomonas NCIB 11112 eller Hypomicrobium NCIB 11040 og c) Pseudomonas NCIB 11019, NCIB 11022, NCIB 11062, NCIB 11063, NCIB 11065, Mycobacterium NCIB 11061, Acinetobacter NCIB 11020 og/eller Curtobacterium NCIB 11021.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det anvendes en blandet kultur av mikroorganismer betegnet som T3 og med NCIB deponeringsnummer 11085.

3. Fremgangsmåte ifølge et av kravene 1 og 2, karakterisert ved at temperaturen holdes i området 38-45°C.

4. Fremgangsmåte ifølge et av kravene 1 til 3, karakterisert ved atpH holdes i området 6,4-7,4.