SU615870A3 - Способ получени биомассы микроорганизмов - Google Patents

Description

Изобретение относитс  к вопросам технической микробиологии, а именно к способам получени  биомассы. Многие микроорганизмы обладают способцостью у1йлианровать углеводороды в качестве источника углерода и образов вать биомассу, представл ющую собой одноклеточный белок или протеин, который может быть использован в качестве источ ника пищевых продуктов. Особый интерес представл ют М1пфоорга1шалы, способные использовать газообразные органические соединени , содержащие в молекуле один или несколько углеродных атрмов, например метан. Известен способ получени  биомассы микроорганизмов, согласно которому осуществл ют культивирование в аэробных ус ловн х в присутствии газообразного мета на на жидкой питательной среде, содержащей источник азота н минеральные соли, метаниспользующего микроорганизма рода Methy Eoinonaa в присутствии, метанолиспользующего микроорганизма, относ щегос  к роду P$eu49«ottae. Однаковыход, получаемый при осуществлении известного способа нед таточно высок. Целью изобретени   вл етс  повышение выхода целевого продукта. Цель достигаетс  тем, что в качестве метаниспольэуюшего микроорганизма используют штамм М е 1 h у t о m О а Ч ST В№ 11О84,измикроорганиамоврода Peeudomonois используют штамм TeeucJolmonas N С1В 1112, при этом эти оба микроорганизма культивируют в при-. сутствии по меньшей мере одного из неметилотрофиых микроорганизмов,  вл ющихс  видовыми обрарпами poдaгвeudott(ottCfS а именно щтаммК-СГБ hfc 11О62, 11О63 или 11065, или рода MycobacteHium щтамм N CIB № 11061, которые спосо&ны метанизировать органические вешест-. ва, полученные метан-и/или метанолисполь эующими микроорганизмами. Согласно этому способу во врем  его осуществлени  поддерживают температуру 38-45 С. а рН б.4-.7,4.| Преимуществом этого способа,  роме повьлиениа выхода целевого продукта  в лаетс  п&вышевве устойчивости к. внф幫 шшм и уменьшений пенообразован а. Используемые микроорганизмы выделе вы из ПрЯрОДНШ ВСТОЧШЕКОВ источником азота жидкой митательноЙ. среды $1вл ютс  аммиаК| мочевина, аммо нийные соли например сульфат, хлорид или нитрат, например нитрат щелочного металла. Кроме того, в ней содержатс  источмвЦ ки фосфора, серы, магни  и железа, ИстЬч НИКОМ фосфора служат фосфаты, например KgHPCJ, KHjPO -, та1н{Щ,1ЦП Еп  фосфорна  кислота, предпочтительно, в концентрацш 3-20 г/.ц, Источником серы может служить серна , кислота или сульфаты, например суль« фат аммони  в кондентраций 0,5-5 г/л, Используетс  семиводный сульфат Mapi ни  в конаентрании 0, г/п и шестиводное хлорное железо в коицентрации 0, ,1 г/л, В среде могут содержатьс  следы дру гих элементов, например соли кальци , марганца, аигаса, кобальта, молибдена и бора Способ можно осуществл ть периоде Чески и непрерывно. Среду, контактируют во врет-ш вЬ1ращивани  микроорганизмов с газовой смесью содержащей метан и шюлород, В качествз  юточника метана можно использовать при родный газ. Непрерывный способ осуществл етс  в ферментере с лопастной мешалкой или в ферменте колонного типа с разбрызгива- нием, снабженном рубашкой охлаждени . Скорость iqjHTOKa среды при осущестiHjetfflH способа равна скорости отвода культуральной жидкости и составл ет O,02i1 ,)0 объема культуры в час ГазВобразную смесь метана и кислоро аом Henpei BHO барботируют в питатель ную среду. Отработанный газ (вывод т из верхней частИ} ферментера.. . Клетки микроорганизмов (биомассу) от бирают из питательной среды известнымиспособами , например седиментацией, осаждением с последующей фильтрацией. Псшученную биомассу сущат выморажи )ванием или распылительной сущкой. .ченную биомассу можно использовать в к тве источника белка, добавл емого в сорма животным или при приготовлении продуктов питани  людей. Пример 1. Выделение культуры бактерий выращиваемых на-метане, Смещаннук культуру бактерий, растущих на метане, выделили из образца почвы IrpS аи), вз той натропической утиной ферме, и 2 г образна поместили в колб5 качалку на 250 мл с 25 мл среды09М« В среду подавали дважды в день газовую смесь, состо щую на 25% метана и 75% воздуха. Колбу инкубировали на ротащсонной качалке с орбитальным радиусом 2,5 см при 2ОО об/мин в течение 1 нед. Культуру, В которой по вилась мутность, пересе ли, ва в 2 ып инокулюма, в аналогичные кол-« бь -качалки в асептических услови х. Операшпо повторили несколько раз к по полу чеиии репродуцируемого роста культуры (ТЗ) из колб-«ачапок„использовали дл  инокул ции ферментера; . описанного в примере 5. Среда D ЭМ состоит из штамма MeikvEoVnonua Д CIB № И084, шта маРзеис ОШОКаб ГЧ CIB №11112 и штаммов PseudоJ O V ClB , 11063 иМусоЬас1ен{Ц№ VC3B № 11061. Пример 2. Микробиологические характеристики культуры ТЗ. В состав культуры вход т следующие микроорганизмы: Метани пользующиЙ мшфоорганизм 6МЗ W № 11084 обладает нескользко изменчивой морфологией, име  вид коротких палочек, или кокковых палочек с внутренней мембранной (оболочковой) структурой , группированной параллельными складками в клетке. Этот микроорганизм растет в одиночестве на метане лишь медлешю . На основе приведенного вьше описани  этот микроорганизм  вл етс  ранее неописанным видом типаМеЬНуНощоПаб |cm №11084. Метанолис пользующий, микроорганизм, обозначенный ОМ U Я СШ Мз 11112, характеризуетс  способностью расти и образовать колонии лишь на агаровых пластинках , содержащих метанол в виде еди ственногЬ источника углерода. Рост не имеет места в присутствии глюкозы, лактозы , сахарозы, маннита, ионзита, цитрата или питательного агара. Микроорганизм около 2 мкм длиной и 1 мкм Ьгириной, с одним пол рным жгутиком. Колонии на агаре однородные (гладкие, ровные и серые со сплощными кра ми (не прерываемыми ) и по вл ютс  на агаровых пластинах с метаг олом/минеральными сол ми после 2 дней инкубации при 42°С. На ос новании описа1шого выше микроорганизм можно отнести к ранее неописанным вида типа Peeudomonas W ciB № 11112 Прочие типы микроорганизмов выделены из смеси, котора  не может расти ни на метане, ни на метаноле , как единственном источнике углерода . Они получили обозначение М, Ма И Mj. Пни были подвергнуты дартным испытани м или тестам дл  определени  того, к каким микроорганизмам они относ тс . Результаты этих тестов приведены в табл. 1 и 2. На основании приведенных результатов (полученных при указанных тестах) мож но сделать вывод об идентичных микроор ганизмах. Организм Mj  вл етс  видом PseudomoitaB N ciB № 11062. Микроорганизм Mg  вл етс  видом Mycobacler ium WCiB № lioei, микроорганизм Mg- видoмPвeuc}owoltas W CfB № 11O63, микроорганизм MA- видом Pseuclomortaie N CIB № noes. П p и M ep 3. Культуры выращйвали из семей .следующих бактерий: МЗ (растут лишь на метане) S ОМ (растут лишь на метаноле) (неметилотрофна  бактери ) Приготовили питательную среду в сооП ветствии с описанным Шиханом и Джонсо ном (далее обозначаема  как среда IfiM содержащую следующие ингредиенты, г/л: 1.6 1 Н21-ид , 1,16 1,18 WaNO 0,О8 7Н 0,О14 РебОд Са O/O), 4Н20 О,025 , 8 X 10 С Ц 504. 6,8 10 KSO 6,0 MrtS04 4,8 10Na/ЛоО 2Н2О Культуру выращивали в стерильных ст л нных сосудах емкостью 500 мл, через которые непрерывно барботировали смесь мётана с воздухом. Аппаратура представл ет серию сосуд через которые непрерывно через зинте1 золь ый фильтр барботировали смесь метана и воздуха в соотношении 1:3. Чере отверсти  в сосудахосуществл ют иноку л дию и отбор проб. Колбы ииокулировали 1,5 мл своей «ультуры (24-часивой) каждого из 4 ми 6 ста 06 роорганизмов, обозначенных М М,, М, {, /М, 1 к М, Вносили по 4 мл обоих метанисполь зующих (В МЗ) и метанолиспользуюших (ОМ 2 ) бактерий из 2-3 дневных культур, выращенных в колбах -качалках на среде Среда в сосудах представл ла собой 40О мл среды tJ5M, описанной выше а рост определ ли измерением оптической пло1;юсти (ОД) при длине волны 625 нм, Результаты приведены в табл. 3. Эти результаты показывают, что дл  обеспечени  лучшего роста на метане необходима смешанна  культура. Ситуаци  несколько улучшаетс  в присутствии метанолис пользующих , но дл  лучшего роста необходимы все компоненты (смешанной культуры).. Эти результаты  вл ютс  средними от трех экспериментов, из которых каждый повтор ли два-три раза. Пример 4. Эти эксперименты имели целью проверить, можно ли заменить компоненты культуры ТЗ другими микроо{ ганизмами , обладающими аналогичными функци ми. Культуры в барботируемых стекл нных сосудах те же, что и в примере 3, но в некоторых случа х метанолиспотшэующие микроорганизмы из культуры ТЗ замен ли метан олис пользук цими микроорганизмами штамма NCIB № 1104О, Аналогичным образом неметилотрофическне компоненты ТЗ замен ли неметилотрофическими микроорганизмами MCIB № 11019, 11020, 11021, и 11022. Результаты приведены в табл. 4. Разница между цифровыми значени ми в вертикальных колонках 6 в табл. 4 невелика . Можно поэтому заключить, что метанолиспользующие гушкросрганизмы NCtJB №11040 можно заменить OMU, Неметалотрофные компоненты взаимозамен емы . Пример 5. Ферментаци  с испольрзованием культуры ТЗ. Культуру выращивали непрерывным способом на минеральной среде, метане и воздухе. Использовали при этом ферментер Биотек емкостью 2,5 л. Метан и воэдух распредел ли в жидком содержимом из расчета 150 и 45О мл/мин cooTBeivственно . Температуру среды поддерживали около , а рН около 7,4. Среду перемешивали мещалкой со скоростью 1ООО об/мин. Давление в ферментере было чуть выше атмосферного. Используема  дл  непрерывного культивировани  жидка  среда, обозначенна  Stli, содержала: К11оР04, г/л1,6 г/л1,16 , WaMOg, г/л 3,18 0,107 Mg6Q ) д 7 HI О, г/л 7 HjjO, г/л Са (MO),0, г/п Раствор микроэлементов, мл/л 1 Концентрированна , кислота, мл/л0,33 Дистиллированна  вода, до л.1 Использованный раствор микроэлементов имел следующий состав, г/л: СиаОд SH-O3 «504 7Н200,336 MWe04 ,5 2Н,00,213 Этот общий раствор добавл ли к ку среды в концентрации 1 мл/л, В ферментер внесли 2 л среды и куль  туру 1 М, перемешивали при аэрации и подавали метан. Мнокулировали 100 MJ: выращенной в колбе-качалке культуры ТЗ После обнаружени  роста в ферментере д бавл ли среду 5t).j из расчета 0,08 (степень разведени ); Ееповышали на 0,02 ч с двухдневными интервалами до 0,22 ч без промывки культуры. Бы ли достигнуты равновесные состо ни , при которых концентраци  биомассы нахо далась в.интервале 2,5-6 г/л. Это, не высша  концентраци  биомассы при непре рывном выращивании. Культуру выращивали непрерывно в течение более 3000 ч, Микроорганизмы собирали и анализировали результаты.. При любом состо нии равновеси  и да ной степени разведени  при непрерывном выращивании процент общей попул ции ба терий, представленных любыми видами, не измен лс . Кроме того, культура очень ,устойчива к инфекци м чужими микроор Идентификааш  не использующи в смешанной культуре ТЗ. 61 0 ганиэмами, так что зар1:Йзнени  нельз  было обнаружить даже при заражении культуры инородными микроорганизмами, Пример 6, Смешанную культуру метаниспользуюших бактерий выращивали непрерывным способом в ферментере емкостью ЗОО л в услови х, в основном эквивалентных указанным дл  ферментации в небольшом масштабе. Клетки собирали фугованием и сутшш методом распылител : ной cyuiKH, Получили рвободно-чгекущий без цвета и запаха порошок (SCP), соото ший из сухих бактериальных клеток с содержанием протеина 78%, Порошок испьн тывали на крысах следующим образом. SCP давали крысам отъемышам в течение 10 дней так, .что S СР представл л единственный источншс белков в диете. Каждый опыт контролировалс  контрольной диетой , в которой единственным HcT04tnncoM белков служил казеин. Дл  сравнени  давали сель, д ную муку - один их богатейших белком видов кормовых добавок (дл  животных). Общее .содержание протеина ( М х 6,25) в каждой диете равно 10%, прочие питательные вещества давались в количествах, соответствующих оптимальному росту. Результаты экспериментов с питанием пpeдcтaвлeны в табл. 5, Из табл, 5 можно заметить, что 6СР, полученный из смешанной культуры бактерий , растущих на метане,  вл етс  удовлетворительным видом белков. Несомненно он луще сельд ной муки в качестве диетического компонента при откор е животных. Аминокислотный спектр СР подвергали анализу, результаты приведены в табл. 6, Эти результаты указывают, что аминокислотный баланс таков, что позвол ет признавать 5СР весьма подход щим в качестве протеинового корма дл  живо-Рных . Таблица 1 тан бактерий, содержащихс  ы первой стадии

-+

ПалочкаПалочтса

-

-J--

помощи тгол рного жгутика

Палочка

Палочка Использование глюкозы (креп.)Тест О - (Хуга и Лейфзона)Кислотостойкость

Идентификаци  не использующих метан бактерий, С15держащихс  в смешанной культуре ТЗ, Втора  стади  испытаний (тестов) и VP (Вогеэ-Проскауэра)-. Глюкоза-Лактоза (кисл.)Сахароза (кисл.) Маннит (кисл.)-+. Мальтоза (кнсл.) Рост на питательном агаре++ Активность катала Восстановленле нитрата-Слабо

Таблица 2 ( veou) --I -Окислитель Окисл ныйтельный Нестойкий - - - - - ,л ( veoK) -. «, -ь + + лабо 61587012

Рост на метане после 3 дней при использовании раал1 чных сочетаний бактерий, содержащихс  Б культуре ТЗ.

Микроорганизмы, содержащиес  в инокулуме

SM3 SM3, ОМЬ

5МЗ, МА, м, Мд, Мд

SM3, ОМЬ , М|, М, М Повышение оптической плотности (при 625 нм) различных

.смешанных купътур,: вырашиваемых на метане (средние значени  2 экспериментов, иа которых каждый повтор ли четыре каждой культуры)

знак - обозначает отсутствует в культуре.

Таблица 3

Оптическа  плотность через 3 дн 

О,14 О,25 О,27 0,59

. Т а б л и ц а 4.

Таблица

13

Аминокислота

Аспарагинова

Треонин

Серии

Глутаминова 

Пролин

Глшшн

Алании

Вал н

Цистин (1/2)

Метионин

Изолейдин

Лейцин

Тирозин

Феннлаланин

Аммиак

Омитик

Лизин

Гистидин

Аргинив

% М % м/м

Claims (4)

1. Неочищенный Формула изобретен й 1. Снособ получени  биомассы мшфо- организмов, предусматривающий культивирование в аэробных услови х в присутствин газообразного метана на жидкой пи тательной среде, содержащей источник аз1 та и минеральные соли, метаниспольаующего микроорганизма в присутствии мета нолиспользующего микроорганизма, относ щегос  к роду Peeudomo ttoie, о т личаюшийс  тем, что, с целью повышени  выхода целевого продукта, в качестве метаниспользующего микроорга

   61587014

   jjj a б n и ц a 6

   % протеина

   ,48 4,00 3,30

   0,ев

   4Д8 4,63 6,16 5,91 О,31 2,78 4,50 7,02 3,51 4,37 2,О9 0,16 5,43 2,00 5,84 1,4 1,25 низма используют штамм Metll EoWOitaS fi № 11084, из микроорганизмов рсн;. да pseud О то RdS используют штамм PaeudomottoieN С1В № 11112, при этом последние культивируют в присутствии по меньшей мере одного иэ неметилотрофных микроорганизмов, предпочтительно штаммов Pseud ото на в W С|В № 11062,lPeeudomona5 МСЗВ № НОбЗ, PseudortfOKas NCIB №11065 Mjcobacle ium Ч С1В Мг 11601.
2. 2. Способ по п. Ij о т л и ч а ю щи й ,   тем, что температуру культивировеи1561587016

   ни  поддерживают в интервале 38-45 С.Источники информации) прин тые.во

   внимание при экспертизе:
3. 3. Способ по п. 1, о т л и ч а ю щ и ...-,

   с   тем, что рН регулируют в интервалеi.Патент Великобритании № 127ООО6,

   e,,
4. 4.. С 6 f, 1972.