SU676177A3

SU676177A3 - Способ получени биомассы микроорганизмов

Info

Publication number: SU676177A3
Application number: SU762331955A
Authority: SU
Inventors: Эрнест Форестер Гаррисон Дэвид; Йоханнес Доддема Харманнус
Original assignee: Шелл Интернэшнл Рисерч Маатсхаппий Б.В. (Фирма)
Priority date: 1975-03-14
Filing date: 1976-03-12
Publication date: 1979-07-25
Also published as: JPS5944036B2; FR2303853B1; US4042458A; DK107776A; DK141706B; NO760882L; GB1535320A; IE43456L; JPS51112586A; NO144854B; HU178347B; FR2303853A1; DE2610478A1; NL7602602A; CH623356A5; NO144854C; DK141706C; IE43456B1; IT1183051B; DE2610478C2

Description

Изобретение относитс к способам получени биомассы микроорганизмов, представл ю1цих собой микроорганизмы, которые способны усваивать газообразные органические соединени , содержащие один или более атомов углерода, например метан. Наиболее близким по технической сущности к предложенному способу вл етс способ получени биомассы мик роорганизмов, предусматривающий культивирование в аэробных услови х в при сутствии газообразного метана на жидкой питательной среде, содержащей источники азота и минеральные соли, метаниспользующего микроорганизма в присутствии штамма Pseudomonas NC1B №11112, которые культивируют в присутствии по меньшей мере одного из неметилотрофных микроорганизмов штамма Pseudomonas N С1В 11062, №11063 или №11065 и Mycobacterium N С1В №11061/ при этом температуру культивировани поддерживают в пределах 30-60°С и рН среды 6,0-8,0 1. Недостаток способа состоит в том, что он осуществим лишь при участии всех упом нутых видов микроорганизмов . Преимуществом предлагаемого способа вл етс применение потребл ющего метан микроорганизма Methylococcus 999 N С1В №11083 в способе получени одноклеточных протеинов как без, так и с добавлением других микроорганизмов . Цель изобретени - повышение выхода биомассы. Это достигаетс тем, что в качестве метаниспользующего микроорганизма примен ют штамм Methylococcus 999 N С1В №11083, а также тем, что процесс культивировани ведут в присутствии штамма Pseudomonas NC1B №11112 и/или по меньшей мере одного из неметилотрофных микроорганизмов штаммов Pseudomonas N С1В №11062, №11063 или №11065 и Mycobacterium N С1В №11061, при этом в процессе культивировани температуру поддерживают в пределе 30-60С. Сущность способа состоит в том, что дл получени биомассы используют как смешанные культуры, полученные следующим путем, так и чистые культуры этого штамма: А. Смешанные культуры, включающие в себ метанпотребл ющие микроорганизмы с одним или более видом (штаммом)

метанолпотребл гащих микроорганизмов и одЕшм или более видом (штамг/юм) неметилотрофных микроорганизмов,

В предложенном способе они определены как Т4 и представл ют собой следующие культуры Methylococcus 999 N С1В №11083, Pseudomonas N CIB №11112, Mycobacterium N CIB №11061 и три штамма Pseudomonas N CIB №11062, №11063 и №11065.

В. Штамм Methylococcus 999 NCIB №11083 также хорошо растет на метане в присутствии одного или более неметилотрофных микроорганизмов без добавлени метанолпотребл ющих микроОрганизмов метаболизма штамма Methy- lococcus 999 NCIB №11083.

Если в качестве источника азота используют мочевину, то выращивание штамма Methylococcus 999 ведут в присутствии положительных к уреазе неМетйлотрофных микроорганизмов.

Смешанна культура Т4, выделенна из вз той с фермы тропических уток унавоженной земли, предпочтительна дл осуществлени способа.

Из смешанной культуры Т4 техникой перекрытых слоев выдел ют штамм Methylococcus 999 NCIB W11083 со следующи: 1и характеристиками.

Тип перегородки: и трубчата перегородка , кокки, диаметр клетки около 0,9 мм, рост при температурах 37, 42 и 55°С и на метаноле.

Сформулированные капсулы.

Цвет колонии: белый/коричневый. Чувствителен с антибиотикам: сульфафуразолу 100 мкг, пенициллину G 1,5 единицы, стрептомицину 10 мкг, тетрациклину 10 мкг и ампициллину 2 мкг.

Характеристика штамма Pseudomonas NCIB №11112.

Характерисзуетс способностью к росту и образованию колоний только на агаровых пластинках, содержащих 5 метанол в качестве единственного источника углерода.

Не растет в присутствии глюкозы, лактозы, сахарозы,маннита, инозита/ цитрата или питательного агара. . 0 Размер примерно 2 мк в длину и 1 мк в ширину с одним пол рным флагеллумом .

Колонии на агаре - гладкие и серые с целыми кра ми, образуютс на агаровых пластинках с метанолом и минеральными сол ми порле инкубации в течение 2 дней при .

Характеристика идентифицированных штаммов приведена в табл.1.

Таблица 1

С помощью пол рных жгутиков

Продуцирование каталаэы .

Активность оксидазы

Использование глюкозы

Испытани O-F (Хью и Лейфсон ).

Стержни

с помощью

пол рных

жгутиков

ОкислиОкислительна тельна

Кислотный фест

Активность уреазы

Использование цитрата

Гидролиз х елатина

Продуцирование индола

Метилкрасный и проба Воже-Проскауэра

Реакции (в килой среде) на

глюкозу сахарозу

маннит мальтозу

Рост на питательной среде

Каталазна активность

Восстановление гидрата Способ получени биомассы осущест л ют предпочтительно при непрерывном культивировании. Дл роста микроорганизмы засевают в жидкую питательную среду, которую контактируют с газовой смесью, содер жащей метан и кислород. Метан может быть подан в виде природного газа. Свежую среду непреролвно подают в культуру со скоростью 0,02-1,00 объема в 1 ч и культура выводитс с такой скоростью, чтобы объем культуры оставалс посто нным. Газ подают в виде пузырьков. Источником кислорода служит воздух, чистый кислород или обогащенный кис (лородом воздух. Отработанный газ отвод т из верхней части ферментера, и он может быт замкнут в цикл. Температура культивировани 3060°С , предпочтительно 38-50°С; рН- культуры предпочтительно 6,0-7,0. Клетки микроорганизмов отдел ют от культуральной жидкости любым стандартным методом.

Продолжение табл JL

3 .

Нет

Слабое

Слабое Биомассу высушивают вымораживанием или распылительной сушкой и используют как протеиновую пищу или пищевую добавку дл людей и животных. Пример 1. Непрерывную культуру как смешанной культуры Т4, так и чистой культуры Methylococcus 999 NC1B №11083 выращивают в стерильных услови х в ферментерах с механическим перемешиванием и рабочим объемом 2,5 л. Смесь метана и воздуха в соотнс иении 2:1 барботируют через жидкость со скоростью 900-1200 мл/мин. Температура культуры при рН 6,8, регулирующемс автоматически добавлением смеси 0,5 NaOH и 0,5 КОН. Культуру перемешивают со скоростью V 200 об/мин. Свежую среду подают и отвод т непрерывно, поддержива посто нный объем. Состав среды в концентрации, ммоль (ЫНч)250ч - 11,0; НзРОч - 10,0; MgSO) - 0,4; CaCIg - 0,1; FeSOg 33 X 10 2пБОц - 1,0 X 10Л MnSO Н,ВО} - 1,0 X CuSOv

Claims

1,0 X 10 Ыа,МоОч - 0,2 X KI

0,5 X 10 г- -

0,5 X Н.БОн 1,0 X 10 .

Каждый ферментер засевают 100 мл культуры, выращенной в колбах дл встр хивани , один - смешанной кульtypoй Т4, а остальные - чистой культурой Methylococcus 999 NC1B №11083,

Т4

0,34

Пример

2. Культивируют штамм Methylococcus 999 (один) и смесь этого штамма с поло жительными к мочевине бактери ми, не способными к росту на метане, но способными к росту на веществах, производимых микроорганизмом Methylococcus 999.

Культивирование ведут при 42°С в солевой среде в стерильных стекл нных сосудах емкостью 500 мл.

Иетан, воздух и углекислый газ Пропускают со скоростью 25, 100 и 10 мл соответственно через фильтр из спеченного стекла.

Methylococcus 999 (чиста )

Methyiococtus 999 (смешанна с положительными к уреазе бактери ми)

Положительные к мочевине бактерии характеризуютс следующим образом грамм штамм +, форма - палочки, неподвижные , рост на воздухе +, кат.алазе +, оксидазе -, кислой глюкозе (газ) +, OF (Hugh and Zeifson) +, уреазе +, нет денитрификации.

Результаты показывают, что Methylococcus 999 NC1B 11083 хорошо растет только на мочевине, если присутствуют положительные к уреазе микроорганизмы .

Среду подают в ферментеры в интервале скоростей разбавлени 0,100 ,2-0,3 тех пор, .пока культура не начнет вымыватьс из сосуда.

Установившеес состо ние поддерживают дл каждой скорости разбавлени по крайней мере в течение 48 ч.

Полученные результаты приведены в табл.2..

Таблица 2

0,71

2,42

Колбы инокулируют 1,5мл свежего 5 инокулума. Среда следующего состава, г/л: КНаРОч - 1,6; - 1,16, {NH3)aCO - 2,0; MgSOi(-7HjO - 0,08; FeSOi, 7НзО - 0,014; 3.( 0 ,025; CuS04-5HgO - ZnSOi/-7H,O3 ,4 MnSO;. - 3 lO; Ыа МоОц-2НаО - 2,4-10.

Количество среды 300 мл.

Рост Methylococcus 999 NCIB №11083 и смешанной культуры оценивают путем измерени оптической плотности при 625 нм {значени величины дл одной из трех культур).

Полученные результаты приведены в табл.3.

ТаблицаЗ

0,005 0,005 0,029 0,054

0,005 0,229 0,490 0,550

Пример

3. Смешанную культуру Т4 выращивают на различных источниках азота в различных услови х.

Культивирование ведут аналогично примеру 1. Услови культивировани температура 42°С, рН 7,0, скорость разбавлени 0,18 ч, скорость перемешивани 100 об/мин, обща скорость потока газа 600 мл/мин.

Выход рассчитывают по анализу газового потока на входе и выходе из ферментера с помощью газовой хроматографии и с учетом измерени скорости потока газа. Определ ют концентрацию сухой массы микроорганизмов, котора находитс между 4 и 5 г/л, по разнице концентрации углерода между образцом культуры и культурой, всплывшей после центрифугировани образца 6000 г в течение 15 мин.

Содержание углерода в клетках, высушенных в сушильных шкафах, равно 48%,

Использованна среда содержит, г/л: KHjPO - 1,60; - 1,16; MqSO4-7H O - 0,080; FeSOi 7Н2О Подаваемое соотношение

воздух/метан в газе 3:1 6;1 .3:1 6:1

Предельный фактор

ростаО, СН, О, СНч

0,014; Ca(NOj). - 0,025; CuSO(v5HjO - 2,4-10- ; ZnS04-7H O 3 ,4-10-; - 3,0-10- ; КаМоОч-2Н О - 2,410; CoCI;. 1 ,5 -10-.

Добавл ют концентрированную серную кислоту (36 н.) в количестве 0,33 мл/л.

В качестве источника азота добавл ют 3,18 г/л NaNO3, 2,46 г/л (NH;,)2SO4 или 1,122 г/л (NH2)2CO.

Вли ние источника азота и предельного фактора на непрерывное культи1вирование смеси Т4 показано в табл.4 Таблиц а 4

3:1 тивирование метаниспользующего микро организма в аэробных услови х в присутствии газообразного метана в жидкой питательной среде, содержащей источники усво емого азота и необходимые минеральные соли, отличающийс тем, что с целью увеличени выхода биомассы, в качестве ме таниспользующего микроорганизма примен ют штамм Methylococcus 999 NC1B №11083. 2. Способ по п.. I, отличающ и и с тем, что процесс культивировани ведут в присутствии штамма 6 12 Pseudomonas NC1B №11112 и/или по мень шей мере одного из неметилотрофных микроорганизмов штаммов Pseudomonas NC1B №11062 или №11065 и Mycobacte- , rilum NCIB №11061. 3. Способ по п.1 или 2, о т л и - чающийс тем, что в процессе культивировани температуру поддерживают в пределе 30-60 С. Источники информации, прин тые во внимание при экспертизе 1. За вка №2090249/13, кл. С 12 D 13/06, 1974, по которой прин то решение о выдаче патента.