FI84280B - Foerfarande foer en submers odling av pseudomonas aeruginosa-bakteriestammar. - Google Patents

Description

Menetelmä Pseudomonas aeruginosa-bakteerikantojen^A^j^öe-mlseksl submerssisesti

Keksinnön kohteena on menetelmä Pseudomonas aeruginosa-bak-teerikantojen viljelemiseksi submerssisesti eli pinnanalai-sesti Pseudomonadaceaen taksonomisesta heimosta.

Pseudomonas aeruginosa-bakteeri on opportunistinen, patogeeninen taudinaiheuttaja, jota esiintyy usein sairaalainfektioissa, pääasiassa potilaissa, joilla on heikentynyt vastustuskyky, kuten palovammoista kärsivissä potilaissa, henkilöissä, jotka sairastavat kystistä fibroosia tai joilla on orgaanisia virhetoimintoja, ja syöpäpotilaissa. Antibiootit tehoavat vain rajoitetusti Pseudomonas-infektioihin resistenssin esiintymisen johdosta, mistä syystä pyritään käyttämään immunologisia menetelmiä Pseudomonas aeruginosan aiheuttamien infektioiden torjuntaan.

Infektioita voivat laukaista useat kannat, jotka tuottavat O-ryhmäantigeenejä ja H-antigeenejä. Ansorgin H-antigeeni-kaavion mukaisesti (Zbl. Bakt. Hyg. I. Abt. Orig. A 242, 228 - 238 (1978) käytettäessä epäsuoraa immunofluoresenssitek-niikkaa differentioidaan Pseudomonas aeruginosan kohdalla kompleksinen flagella-antigeeni a, jossa on osa-antigeenit ao/ ai, β2' a3* a4' 3a yhtenäinen flagella-antigeeni b. Osatekijät ao - 84 ovat itsenäisiä determinantteja, niin että tuloksena syntyy useita H-tyyppejä sisältävä flagellaarinen antigeenikaavio. O-ryhmillä ja H-tyypillä on vapaita yhdistelmiä .

On jo tunnettua valmistaa Pseudomonas-infektioiden ennaltaehkäisemiseksi Pseudomonas-roketteita, jolloin lähtöaineina käytetään joko itse Pseudomonas aeruginosa-bakteerimassaa ja/tai viljelysuodoksia, joita saadaan kasvattamalla mikro-organismeja pintaviljelmissä tai submerssisesti kompleksisissa ravintoväliaineissa. Näissä kompleksisissa ravintovä-liaineissa on käytetty hiili- ja energialähteen (useimmiten hiilihydraattien) ja olennaisten ravintosuolojen lisäksi 2

8 4 2 S O

mitä erilaisimpia uutteita ja/tai eläin-, mikrobi- tai kas-viproteiinien hydrolysaatteja (niin kutsuttuja peptoneja). Tällaisten liuoksten täydennysaineiden tarkkaa koostumusta ei ole määritelty ja ne saattavat lisäksi vaihdella erästä toiseen. Ne sisältävät aminohappojen lisäksi myös epätäydel-lisesti hajaantuneita proteiiniosia ja niiden määrittelemättömiä komplekseja ja niiden oleellinen tehtävä on aminohappo- ja kasvuainetarpeen kattaminen. Viljelmän emäliuokset sisältävät tästä syystä aina runsaasti aineita, jotka eivät ole peräisin bakteereista, mikä on haitallista siksi, että Pseudomonas aeruginosan flagella(H)-antigeenin valmistamiseksi tarvitaan yhä useampia viljelyasteen mukaisesti säädettäviä erotusasteita, jotta flagella(H)-antigeeni voidaan vapauttaa mahdollisimman pitkälti ravintoväliaineesta peräisin olevista epäpuhtauksista.

Eräänä toisena tähänastisten erittäin suoritettavien viljelymenetelmien haittana on se, että bakteerit ovat alttiina jatkuvalle fysiologiselle muutokselle niiden inokulointi-ajankohdasta niiden viljelystä suoritettavaan erotushetkeen asti. Bakteeribiomassan tämän fysiologisen ja tästä syystä funktionaalisen differentoitumisen laukaiseva hetki johtuu itse solukasvusta ja ravintoväliaineen koostumuksen siten alunperin aiheutuneesta ajallisesta muutoksesta. Tämän spontaanin fysiologisen differentoitumisen näkyvä seuraus voidaan todeta yksinään jo "batch"-viljelmän kasvukäyrän erilaisissa vaiheissa. Toisaalta solumassan fysiologisen aktiviteetin ja toisaalta sen ympäristön välisen esitetyn suoran suhteen seurauksena liittyy siihen myös erilaisten intra- ja ekstrasellulääristen aineenvaihduntatuotteiden etusijalla oleva rikastuminen kasvuvaiheesta ja differentoitumisvai-heesta riippuen. "Batch"-viljelmän viljelyn emäliuokset sisältävät tästä syystä kaikkien ajallisesti yksittäisten differentoitumisvaiheiden aikana muodostuneiden aineenvaihduntatuotteiden integroidun seoksen.

Keksinnön tarkoituksena on välttää nämä vaikeudet ja haitat ja sen tehtävänä on saada aikaan Pseudomonas aeruginosa-bak-

8 4 2 S O

teerikantojen submerssinen viljelymenetelmä, joka tuottaa olennaisesti tähänastista paremmalla saannolla bakteeribio-massan antigeenien valmistamiseksi, joiden fysiologinen tila pysyy muuttumattomana koko viljelyaikana. Menetelmässä käytetään synteettistä ravintoväliainetta (elatusainetta), josta ei muodostu mitään ylimääräisiä epäpuhtauksia autoklavoi-taessa, ja joka mahdollistaa bakteeribiomassan helpomman kemiallisen viimeistelyn flagella-antigeeniksi.

Tämä tehtävä ratkaistaan keksinnön mukaisesti siten, että seuraavia H-tyyppi-antigeeneja tuottavia kantoja

Kanta H-tyyppi 170001 (ATCC 33350) - b M-2 (ATCC 33349) - b 5940*) - a0, a2 5939*) - a0, a3 5933*) - a0, alt a2 1210 (ATCC 33354) - a0, a1# a2 170018 (ATCC 33356) - a0, a3, a4 *) Kannat on esitetty julkaisussa Zbl. Bakt.

Hyg., I. Abt. Orig. A242, 228-238 (1978) ja ne ovat saatavissa Pariisissa sijaitsevasta Collection de 1'Institut Pasteur-nimisestä talletuslaitoksesta viljellään vesipitoisessa, antigeenivapaassa ja proteiiniva-paassa ravintoväliaineessa, joka sisältää typpilähteen ja mineraalisuoloja sekä hiililähteenä sukkinaattia tai virtsa-ainetta eli ureaa.

Mainittu hiililähde on osoittautunut erityisessä määrin kasvua edistäväksi.

Kannoissa 170001, 5940, 5939, 5933 ja 170018 käytetään An-sorgin nimitystä. Tyypittömien kantojen M-2 ja 1210 luokittelu vastaavaksi H-serotyypiksi tapahtui Montien et ai:n mukaisten molekyylipainojen vertailututkimusten ja serologisten ristireaktioiden perusteella.

4 84280

Mieluummin suoritetaan kantojen viljely jatkuvatoimisesti.

Erään edullisen suoritusmuodon mukaisesti kasvatus voi tapahtua turbidostaattisesti, jolloin ravintoväliaineen happipitoisuus on 5 - 20 etenkin n. 10 %, solutiheys pidetään arvossa 2 - 3 x 109 solua/ml ja substraatin laimennus-määrä pidetään arvossa 0,1 My - 0,3 My lisäämällä tuoretta ravintoväliainetta.

Pseudomonas aeruginosa-bakteerikantojen keksinnön mukainen viljely tapahtuu sekoittamalla ja ilmastamalla "avointa" viljelmää siten, että ne saatetaan maksimaaliseen kasvuun ja flagellien muodostukseen. Ravintosubstraatin syöttö suoritetaan viljelmän kasvumäärän tai vastaavasti viljelmän saavuttaman tasapainotilan mukaan. Tuoreen ravintoväliaineen syötön säätö tai vastaavasti ohjaus tapahtuu viljelmän kasvun suhteen verrannollisesta parametrin, sopivimmin solutiheyden ajallisen muutoksen mukaisesti. Kuitenkin voidaan käyttää myös muita parametrejä, jotka ovat verrannollisia viljelmän kehityksen suhteen, kuten hengitysaktiivisuus, C02~tuotanto, vetyionikonsentraation muutos, hiililähdekonsentraation muutos, respiraatio-osamäärä, typpikulutus, happikulutus ja lämpöefekti. Edelleen voi tuoreen ravintoväliaineen syötön säätö tapahtuu muodostuneen antigeenin määrästä riippuvaisena .

Keksinnön mukaisessa yhtäjaksoisessa kasvatusmenetelmässä poistetaan samanaikaisesti tuoreen ravintoväliaineen syötön kanssa viljelynestettä viljelyastiasta, niin että kasvun ja fysiologisen aktiivisuuden, etenkin toisaalta solujen muodostuksen ja toisaalta solujen ympäristön välille säätyy tarkoin määriteltävä ja aina toistettava virtaustasapainoti-la, joka voidaan säilyttää käytännöllisesti katsoen ajallisesti rajattomasti.

Ravintoväliaineena käytetään synteettistä proteiinivapaata väliainetta, joka sisältää yksinomaan kemiallisesti sekä fysikokemiallisesti kvalitatiivisesti ja kvantitatiivisesti 5 84280 määriteltäviä aineosia. Tähän tarkoitukseen soveltuu epäorgaaninen ravintoliuos, joka sisältää kaikki olenaiset elementit.

Eräässä edullisessa keksinnön mukaisessa menetelmässä voidaan käyttää tauti-itiöiden fermentatiiviseen valmistukseen sekä jatkuvatoimisen viljelyn kemostaattista periaatetta, jossa viljelmän fysiologista aktiivisuutta säädetään rajoittavalla substraatilla, mieluummin hiili- ja energialähteen substraatilla, että jatkuvatoimisen viljelyn turbidostaat-tista periaatetta, jossa laimennusnopeutta (My) ja siten viljelmän fysiologista aktiivisuutta säädetään ulkoisesti kasvuparametrin, mieluummin viljelmän hetkellisen solutihey-den avulla.

Edullisesti käytetään turbidostaattista jatkuvatoimista viljelyä.

Maksimaalisen bakteerikasvun edistämiseksi myös lämpötilat tai vastaavasti pH-arvo ovat tärkeitä; siten on tarkoituksenmukaista noudattaa viljelyn aikana 20 - 35eC:n, sopivim-min 30"C:n lämpötilaa ja pH-arvoa 6,5 - 7,5, sopivimmin 7,0.

yksityiskohtaisesti keksinnön mukainen menetelmä suoritetaan turbidostaattisesti fermentaattorissa siten, että ensin ra-vintoväliaine ympätään bakteerikannalla ja työskennellään noudattaen esitettyjä olosuhteita, kunnes on saavutettu esitetty solutiheys, 2 - 3 x 109 solua/ml, logaritmisessa loppuvaiheessa. Heti kun asianlaita on näin, fermentaattorista poistetaan jatkuvasti bakteerisuspensiota ja se korvataan jatkuvasti tuoreella ravintoliuoksella. Laimennusmäärä ei saa tarkoituksenmukaisesti olla yli 0,3 My, mieluummin 0,1 -0,2.

Esitetyissä olosuhteissa virtaustasapainotilan saavuttamisen jälkeen saadaan 1,5 - 2,0 g/1 märkiä soluja, mikä vastaa suspension sameusarvoa 0,5 - 0,7 Tyndallin menetelmän mukaisesti ennen linkoamista 590 nmrssä.

6 84280

Keksinnön mukaista menetelmää selitetään lähemmin seuraavan esimerkin avulla:

Esimerkki: Käytettiin seuraavan koostumuksen omaavaa ravintoliuosta: dinatriumsukkinaattia 4,05 g/1 dikaliummonovetyfosfaattia 7 g/1 kaliumdivetyfosfaattia 3 g/1 ammoniumvetyfosfaattia l g/1 magnesiumsulfaattia . 7 H2O 0,05 g/1 rauta(III)kloridia 0,0025 g/1 pH säädettiin arvoon 7,0 ja lämpötila 30"C:seen. Ravinto-liuos ympättiin kannalla Pseudomonas aeruginosa M-2 ja sijoitettiin 15 l:n fermentaattoriin. 96 tuntia kestävässä fermentoinnissa käytettiin 140 1 ravintoväliainetta, jolloin ilman kulutus oli 10 % pC>2 (happiosapaine). Laimennusmäärä oli 0,1 My. Solutiheys oli virtaustasapainotilan saavuttamisen jälkeen 2 - 3 x 109 solua/ml.

Samoissa olosuhteissa viljeltiin kantoja 170001 ja 1210, jolloin seuraavassa taulukossa on esitetty viljelyolosuhteet, laimennusmäärä, happiosapaine %:eina ja solusaanto (g/1 märkäpainoa) kaksinkertaisen sentrifugoinnin jälkeen 15.000 x g:ssä. Edelleen on esitetty suspension sameusarvot ennen sentrifugointia.

kanta vilj elyolosuhteet__solusaanto _ laimennus- happi- sameusarvo g/1 märkiä määrä pitoisuus 590 nm:ssä soluja ____d = 1 cm__ 170001 0,1 My 10 % p02 0,6 - 0,67 1,7 M-2 0,1 My 10 % pC>2 0,6 - 0,7 1,6-1,7 1210 0,1 My 10 % p02 0,55 - 0,65 1,5 - 1,6 1210 0,1 My 10 % p02 0,6 1,5-1,6

Claims (2)

84230

1. Menetelmä Pseudomonas aeruginosa-bakteerikantojen viljelemiseksi subsmerssisesti Pseudomonadaceae-suvun taksonomisesta heimosta, tunnettu siitä, että seuraavia H-tyyppi-antigeeneja tuottavia kantoja Kanta_H-tyyppi 170001 - b M-2 - b 5940 - ao, a2 5939 - ag, aj 5933 - aQ, aj_, a2 1210 - a0, ai, a2 170018 - öq, aj, a4 viljellään vesipitoisessa, antigeenivapaassa ja proteiini-vapaassa ravintoväliaineessa, joka sisältää typpilähteen ja mineraalisuoloja sekä hiililähteenä sukkinaattia tai ureaa, jatkuvatoimisesti ja turbidostaattisesti, jolloin ravinto-väliaineen happipitoisuus on 5 - 20 %, sopivimmin n. 10 %, solutiheys pidetään arvossa 2-3x109 solua/ml ja substraatin laimennusmäärä pidetään arvossa 0,1 My - 0,3 My lisäämällä tuoretta ravintoväliainetta.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnet- t u siitä, että viljelyssä lämpötila pidetään 20 - 35eC:ssa, sopivimmin 30eC:ssa, ja pH pidetään arvossa 6,5 - 7,5, sopivimmin 7,0. θ Patentkrav: 84280