JPH07114690B2 - シュ−ドモナス・アエルギノサ細菌株を溶液中で増殖させる方法 - Google Patents

シュ−ドモナス・アエルギノサ細菌株を溶液中で増殖させる方法

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JPH07114690B2 JP61500682A JP50068286A JPH07114690B2 JP H07114690 B2 JPH07114690 B2 JP H07114690B2 JP 61500682 A JP61500682 A JP 61500682A JP 50068286 A JP50068286 A JP 50068286A JP H07114690 B2 JPH07114690 B2 JP H07114690B2
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は分類学上、シユードモナダシアエ(Pseudomona
daceae)族に属するシユードモナス・アエルギノサ(Ps
eudomonas aeruginosa)細菌株を溶液中で増殖させる方
法に関するものである。
シユードモナス・アエルギノサ細菌は、主に免疫防衛能
が低下している患者(例えば、火傷を負つている患者、
のう胞性線維症の患者、または欠損性器官機能患者、お
よび癌患者)において院内感染を引き起こすことの多
い、条件的病原菌である。耐性が生じるために、緑膿菌
感染に対し、抗生物質は限られた範囲でしか活性を持た
ないので、シユードモナス・アエルギノサに起因する感
染症に対しては、免疫学的方法を用いて対抗する試みが
なされてきた。
感染はO−群抗原およびH−群抗原を生成する種々の菌
株によつて、ひき起こされる。間接的免疫螢光法を用い
たアンソルグ(Ansorg)(ZBl.BaKt.Hyg.I.Abt.Orig.A2
42、228−238(1978)によるH−抗原のパターンによる
と、シユードモナス・アエルギノサに関しては、部分抗
原(a0、a1、a2、a3、a4)を有する、複合的なべん毛の
抗原であると、統一的なべん毛抗原であるとが識別
される。部分因子であるa0−a4は、独立した抗原決定基
であり、それ故、いくつかのH−型を有するべん毛抗原
のパターンが生じる。O−群とH−型とは自由に組み合
せをつくる。(改行)緑膿菌感染に対する予防用ワクチ
ンの製造法は既知であり、シユードモナス・アエルギノ
サを表面培養、または混合栄養培地溶液中で液中培養す
ることにより増殖させて得た該細菌の細菌塊(集団)お
よび/または、培養過物を出発原料として使用する。
これらの混合栄養培地に関しては、炭素およびエネルギ
ー源(主に炭水化物)および必須栄養塩類の他に、種々
の抽出物および/または、動物性たんぱく質、微生物た
んぱく質、または植物性たん白質の水解物(いわゆるペ
プトン)を用いた。このような栄養溶液補充物の組成は
厳密に定めておらず、ロツトごとに変えることができ
る。栄養溶液補充物は、アミノ酸の他に不完全に分解し
たたん白質フラグメントおよびその不確定な混合物をも
含み、実質上、アミノ酸と成長促進物質に対する需要を
償うことができる。それ故、培養上清は常に、非微生物
起源の物質に富んでいるが、このことは、培養段階の
後、免疫原性を有するべん毛抗原から栄養培地に由来す
る不純物をできる限り除くことを目的とするいくつかの
分離工程を常に必要とするので、シユードモナス・アエ
ルギノサのべん毛(H)抗原の調製にとつては不利であ
る。
さらに、従来、用いられていたロツトまたはバツチ内で
増殖させる方法は、細菌が、その接種時から、培養物か
らの分離に至る間、連続的な生理学的変化の条件下にお
かれることとなるのでこれもまた、不利である。この細
菌生物量の生理学的変異、すなわち、機能上の変異の引
き金となるのは、細胞増殖そのもの、および、細菌の増
殖による栄養培地の組成の一時的な変化である。この突
発的な生理学的変化の明らかな結果として、バツチ培養
の増殖曲線には、常に数種類の相が認められる。1方の
細胞塊の生理学的活性と他方の細胞集団周囲の環境との
間に前記の直接的な関係が存在する結果、それと関連し
て、成長期および分化期に応じて好ましい量の細胞内外
の種々の代謝産物が豊富に得られる。それ故、バツチ培
養の培養上清は、一時的に個々の分化期において生成さ
れたすべての代謝産物を統合した混合物を含むことにな
る。
本発明は、これらの困難さ、および不都合さを避けるこ
とを目的とし、従来よりも高収率で、培養の全期間中、
生理学的状態が一定である、抗原回収用の細菌生物量を
得るために、シユードモナス・アエルギノサ株を液中で
増殖させる方法であつて、人工栄養媒質中に、加圧滅菌
による余分な不純物の生じないものを使用すると共に、
べん毛抗原のための細菌生物量の化学的後処理をより容
易ならしめる方法を提供することを目的とするものであ
る。
本発明の目的は、以下に示すH型抗原生産株を、抗原を
含まず、たん白質を含まず、窒素源を含み、炭素源とし
てのコハク酸塩または尿素を含むと共に、無機塩類を含
んでいる水性栄養培地中で培養することにより達成され
る。
言及した炭素源は特に成長を促進することが証明されて
いる。
170001、5940、5939、5933および170018株に対しては、
アンソルグ(Ansorg)による分類を用いる。M−2、12
10および16990株のH−血清型における位置付けは、型
による分類でなく、分子量の比較検査および、モンテイ
ら(Montieet al)による血清学的交差反応に基づいて
行なう。
株は連続培養するのが好ましい。
さらに好ましい操作方法では、株をタービドスタテイツ
ク(濁度一定)に培養することができ、その栄養培地の
酸素含量を5〜20%、好ましくは約10%とし、細胞密度
を2−3×109細胞/mlに保ち、基質希釈率を、新しい栄
養培地を補うことにより、0.1μ〜0.3μに維持すること
ができる。
本発明に係るシユードモナス・アエルギノサ細菌株の培
養は、撹拌下、「開放型培養」で、通気下、増殖を最大
にし、べん毛を生成させるような方法で行う。栄養基質
は、培養物の成育速度または、培養物が到達した平衡状
態に応じて供給する。新しい栄養培地の供給の調節また
は制御は、培養物の成長に比例したパラメーター、好ま
しくは細胞密度の一時的な変化に応じて行なう。しか
し、また、培養物の成長に比例する他のパラメーター
(例えば、呼吸活性、CO2産生、水素イオン濃度の変
化、炭素源濃度の変化、呼吸指数、窒素消費量、酸素消
費量、および熱状態(heat tone))を用いてもよい。
また、新しい栄養培地の供給は、生成された抗原量に応
じて行なつてもよい。
本発明に係る連続生育(増殖)法においては、新しく栄
養培地を供給するのと同時に、培養溶液を成育容器から
引き出すので、成長と生理学的活性との間、特に、一方
では細胞の形成、他方では細胞の周囲の環境との間に、
正確に定義でき、いつでも再生しうる流動平衡状態が調
節され、これは、実際上、無制限期間、維持され得る。
栄養培地としては、たん白質を含まない人工培地を用
い、それは、物理化学的および化学的に、定性および定
量的に決定しうる成分のみをもっぱら含んでいる。すべ
ての必須要素を含む無機栄養溶液が適している。
細菌の発酵的生産のための本発明に係る好ましい方法に
おいては、培養物の希釈率(μ)、従つて、培養物の生
理学的活性を、成長パラメーターに応じて、好ましくは
瞬時の培養物の細胞濃度に応じて、外部から調節する連
続培養のタービドスタツト(濁度一定)の原理を適用で
きると同様に、培養物の生理学的活性を、基質、特にエ
ネルギー源としての炭素を制限することにより調節する
連続培養のケモスタツト(化学的一定)原理をも適応で
きる。
タービドスタツト連続培養を用いるのが好ましい。
細菌の増殖を最大にするためには、温度およびpH値も、
また重要である。すなわち、成育中においては、温度は
20〜35℃、好ましくは30℃、そして、pH値は6.6〜7.5、
好ましくは7.0に維持するのが適切である。
詳細には、タービドスタツトの操作方法を用いる本発明
方法では、発酵槽内で、最初、栄養培地に細菌株を接種
し、対数的最終相において前記の細胞濃度(2−3×10
9細胞/ml)に達するまで、前記の条件を維持して続行す
る。この状態に達すると、すぐに、細菌懸濁液を発酵槽
から連続的に引き出し、連続的に新しい栄養培地溶液で
置換する。その希釈率は0.3μ以上でない方がよく、0.1
〜0.2μであることが好ましい。
前記の条件下においては、流動平衡状態に到達した後、
湿細胞(1.5〜2.0g/)、が得られるが、これは、遠心
分離する前において、チンダル(Tyndall)の方法によ
る590nmにおける懸濁液の濁度、0.5〜0.7に相当する。
本発明に係る方法を、以下に実施例を挙げてさらに詳し
く説明する。
実施例: 以下に示す組成の栄養溶液を用いた。
コハク酸2ナトリウム 4.05 g/、 リン酸1水素2カリウム 7 g/、 リン酸2水素カリウム 3 g/、 リン酸水素アンモニウム 1 g/、 硫酸マグネシウム・7H2O 0.05 g/、 塩化第2鉄 0.0025 g/、 pHを7.0に調節し、温度を30℃にした。その栄養溶液に
シユードモナス・アエルギノサM−2株を接種し、発酵
槽(15)内に入れた。発酵期間(96時間)の間、栄養
培地(140)を通し、空気の流速は10%pO2(酸素分
圧)に達した。希釈率は0.1μであつた。流れが平衡状
態に達した後の細胞密度は2−3×109細胞/mlとなつ
た。
同じ条件下において、170001株および1210株を培養し
た。培養条件、すなわち、希釈率、酸素分圧(%)およ
び、遠心分離(15,000×g)を2回行なつた後の湿重量
で表わした細胞収量(g/)を以下の表中に示す。さら
に、遠心分離を行なう前の懸濁液の濁度を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 マクドネル,ジエームズ・エル アメリカ合衆国インデイアナ46616、サウ ス・ベンド・コテージ・グローブ・アベニ ユー814番 (72)発明者 ムント,ウルフガング オ−ストリア国ア−‐1080、ウイ−ン、フ ロリアニガツセ57番 (56)参考文献 米国特許3987164(US,A) 米国特許3928565(US,A) Infection and Immu nity 35,〔1〕(1982)P.281− 288

Claims (2)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】シュードモナス・アエルギノサ細菌株を液
    中で培養する方法であって、以下のH−型抗原生産株: を、水性栄養培地中、連続的方法で濁度一定に増殖させ
    ることからなり、該水性栄養培地は、抗原を含まず、た
    ん白質を含まず、炭素源としてコハク酸塩または尿素を
    含むと共に、窒素源および無機塩類を含み、該水性栄養
    培地中の酸素含量を5〜20%、好ましくは約10%とし、
    細胞密度を2−3×109細胞/mlに維持し、新しい栄養培
    地を補充して、基質希釈率を0.1μ〜0.3μに維持するこ
    とを特徴とする方法。
  2. 【請求項2】増殖期間中、温度を20−35℃、好ましくは
    30℃に維持し、pHを6.5〜7.5、好ましくは7.0に維持す
    ることを特徴とする第1項に記載の方法。
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