KR101849642B1

KR101849642B1 - 캡슐형 폴리오스의 수율 개선을 위한 박테리아의 배양 방법

Info

Publication number: KR101849642B1
Application number: KR1020147019651A
Authority: KR
Inventors: 카프레 수브하쉬 비나약; 자나 스와판 쿠마르; 아마르 쿠마르 스리바스타바
Original assignee: 세럼 인스티튜트 오브 인디아 프라이비트 리미티드
Priority date: 2011-12-15
Filing date: 2011-12-15
Publication date: 2018-04-17
Also published as: MX348547B; EP2791317B1; CN104080904B; CA2859124A1; JP2015500649A; MX2014007268A; JP5979684B2; WO2013088448A1; CA2859124C; CN104080904A; KR20140109967A; ZA201405160B; US20140342411A1; EP2791317A4; EP2791317A1; BR112014014656B1; BR112014014656A2; US9249439B2

Abstract

본 발명은, 다양한 영양분 공급 용액 및 공급 방법을 이용하는, 캡슐형 폴리오스의 생산성을 향상시키기 위한 최적화된 배양 조건에 관한 것이다.

Description

캡슐형 폴리오스의 수율 개선을 위한 박테리아의 배양 방법 {A NOVEL PROCESS OF CULTIVATING BACTERIA FOR YIELD IMPROVEMENT OF CAPSULAR POLYOSES}

본 발명은 캡슐형 폴리오스(capsular polyoses(CP))의 수율 개선을 위한 박테리아의 배양 방법에 관한 것이다.

캡슐형 폴리오스는, 다양한 박테리아성 질병에 관여하는 박테리아의 표면에서 발견되는 중요한 면역원(immunogen)이다. 이러한 특성 때문에 캡슐형 폴리오스는 백신을 설계하는 데 중요한 요소로 여겨진다. 캡슐형 폴리오스는, 특히 캐리어 단백질(carrier protein)과 결합되었을 때, 면역 반응을 유발하는 데 유용한 것으로 밝혀졌다.

전형적으로, 캡슐형 폴리오스는 복합 배지에서 회분 배양을 통해 제조된다(Shen 등의 2001 Vaccine 19: 850-61; Palazzi 등의 2004 J. Infect. Dis. 190:558-64; Merritt 등의 2000 J. Biotech. 81:189-97; Dassy 및 Fournier의 1996 Infect. Immunol. 64:2408-14; Suarez 등의 (2001) Appl. Env. Microbiol. 67:969-71; Wicken 등의 (1983) J. Bact. 153:84-92 참조). 영양분 공급에 있어서 전통적인 DO-stat 조절은, 단순히 영양분의 제한 또는 고갈에 따른 DO의 증가/스파이크(spike)(탄소 기질의 환원이나, 산소 소비 또는 호흡의 중단에 의함)에 기반한다. DO-stat 조절은, DO가 설정값을 초과하여 상승하면 영양분의 공급속도(feed rate)를 증가시키고, DO가 설정값 미만으로 하락하면 영양분의 공급속도를 감소시킴으로써, 배양을 소정의 범위(DO 설정값) 내에서 일정한 DO 수준으로 유지하고자 하는 것이다. DO-stat 방법은, 영양분의 고갈이 급속한 DO의 증가를 초래하는 한정 배지(defined medium)에서 전형적으로 잘 맞는다. 그러나, DO-stat 방법은, 효모 추출물, 트립토판, 펩톤, 카사미노산 또는 Hy-Soy와 같이 풍부한 복합 영양분으로 보강된 배지에서는 종종 실패한다. 영양분이 풍부한 복합 배지는, 아미노산 이화작용을 통해 DO 수준을 낮게(즉, DO 스파이크가 나타나지 않도록), 심지어 탄소원의 한계 또는 고갈 수준 이하로 유지함으로써, 세포의 유지 및 호흡을 지원할 수 있다.

배양물의 pH는 일단 탄소원이 고갈되면 증가하는 경향이 있기 때문에, 배양물의 생장을 위해서 복합 배지를 사용하는 경우에는 pH-stat 방법이 DO-stat 방법보다 더 적절할 수 있다. DO-stat 조절과 유사한 방식으로, pH-stat 방법은, pH가 설정값을 초과하여 상승하면 영양분 공급속도를 증가시키고, pH가 설정값 미만으로 하락하면 영양분 공급속도를 감소시킴으로써, 설정값 수준으로 배양물의 pH를 일정하게 유지한다. 그러나, 영양분의 고갈시 배양물의 pH 변화는 DO 변화보다 반응이 떨어지기 때문에, pH-stat 방법에 의한 영양분 공급 조절은 DO-stat 방법에 의한 영양분 공급 조절보다 상대적으로 완만할 수 있다.

최근의 연구들은, 배양이 일어나는 동안 생장률, 영양분 수준 및 대사 정도(metabolic concentration)가 변화하는 회분 배양 시스템을 사용하였다. 이러한 시스템에서는, 하나의 요소(factor)가 변화하면 생장과 관련된 다른 요소들의 변화를 초래하고, 수율에 예측할 수 없는 영향을 미칠 수 있다. 연속 배양을 이용하면, 연구자들은, 회분 배양물의 생장시에 상호의존적인 파라미터들, 예를 들면, 생장률, 영양분과 생성물의 농도 및 세포 밀도 등을 분리하여 정의할 수 있다. 연속 배양이 이루어지는 동안, 새로운 배지(fresh medium)가 일정한 속도로 배양물에 첨가되고, 일정한 배양물 부피를 유지하는 속도로 세포와 배지가 제거된다.

관류(perfusion) 배양에서, 새로운 배지가 일정한 속도로 배양물에 첨가되고, 일정한 배양물 부피를 유지하는 속도로, 세포를 제외한 사용된 배지가 제거된다. 그러나, 연속 관류 배양은, 균주의 안정성 문제 및 오염의 문제를 안고 있고, 배지와 영양분을 지속적으로 공급해야 하기 때문에 다소 비경제적이다. 따라서, 연속 배양이 가지는 이와 같은 문제점들을 극복하기 위해서, 캡슐형 다당류를 고수율로 생산하기 위해 연속 배양 방법에 대한 대안을 개발할 필요가 있다.

연속 배양이 가지는 이러한 문제점을 극복하기 위한 한 가지 접근법은 WO 2007/052168에 예시되어 있다. 복합 유가식 발효(complex fed batch fermentation) 공정은, 캡슐형 폴리오스의 생산에 적합한 영양적인 환경 및 생장률을 유지하기 위해서 개발되었다. 복합 유가식 발효 공정은, 회분식 기술과 연속식 기술이 가지는 이점을 결합하여, 급속 생장기를 연장시키고 발효가 일어나는 동안 기질의 첨가 조건을 조절함으로써, 높은 세포 밀도를 형성한다. 그러나, 복합 유가식 기술은, 발효를 제어하기 위해서 복잡한 알고리즘을 갖는 소프트웨어를 사용한다.

또 다른 접근법은 WO 20100272755에 기재되어 있다. 효모 추출물의 두 번의 즉각적인 첨가 후 연속적으로 글루코스를 첨가하는 단계를 포함하는, 박테리아의 배양 방법이 개발되었다. 매 첨가는 미리 설정된 OD 수준에서 개시된다. 따라서, 알고리즘이 배제된 탄소원의 연속적인 첨가는, 이전의 복합 유가식 발효보다 개선된 것이다. 그러나, 이 접근법은 OD의 지속적인 측정이 필요한 매우 성가신 방법이다. 또한, 이 접근법은 유기체의 지속적으로 변화하는 요구(미세환경(microenvironment))를 고려하지는 못한다.

본 발명은 놀라운 발견에 기반한 것이며 새로운 영양분 공급 방법에 관한 것으로서, 본 방법에서는, 미리 설정된 pH를 유지하기 위해, 유가식 발효가 일어나는 동안 공급 배지의 첨가속도가 알칼리 혼합물의 첨가속도와 평형을 이루게 함으로써, 기존의 회분식 발효 방법에 비해 캡슐형 폴리오스의 용적 수율이 크게 증가한다.

본 발명은, 회분식 발효에 비해 캡슐형 폴리오스의 생산성을 3배 내지 5배 증가시킨 새로운 유가식 발효 방법을 제공한다.

특히, 본 방법은, 캡슐형 폴리오스의 높은 용적 생산성(volumetric production)을 위한 캡슐화된 박테리아를 배양하는 방법에 관한 것으로서, 본 방법은 (a) 캡슐형 폴리오스를 발현하는 박테리아 균주의 접종원을 제공하는 단계; (b) 미리 설정된 pH를 유지하기 위해, 공급 배지의 첨가속도가 알칼리 혼합물의 첨가속도와 평형을 이루도록 하면서, pH 7.2에서 발효하여 균주를 배양하는 단계; (c) 배양물 배지를 0.1-0.5 vvm의 기체유속(air flow rate)으로 50-150 RPM으로 교반하면서 35-38 ℃에서 발효하는 단계;를 포함한다.

도 1: 다양한 영양분 공급 방법에 대한 Pneumococcus 혈청형(serotype) 1 다당류 (유가식 발효)
도 2: pH를 유지하기 위해, 알칼리 혼합물 중 염기의 비율을 다양하게 변화시킨 경우에 대한 Pneumococcus 혈청형 1 다당류 수율 (유가식)
도 3: 유가식 발효에 의한 Pneumococcus 혈청형 1, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 19A, 19F 및 23F 다당류 수율과 회분식 발효에 의한 Pneumococcus 혈청형 1, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 19A, 19F 및 23F 다당류 수율의 대비

본 발명은, 미리 설정된 pH를 유지하기 위해서, 유가식 발효가 일어나는 동안의 공급 배지 첨가속도가 알칼리 혼합물 첨가속도와 평형을 이루는, 박테리아의 배양 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면은, a) 미리 설정된 pH를 유지하고, b) 캡슐형 폴리오스의 높은 수율을 얻기 위해서, 특정 비율의 NaOH 및 Na₂CO₃로 구성된 알칼리 혼합물이 사용될 수 있다는 것이다. Na₂CO₃만을 사용하면, 생장 및 pH 조절에 적합한 배지를 제공할 수 있으나, Na₂CO₃를 제한하는 조건은 캡슐형 폴리오스를 생성하는 데 스트레스 상태를 유발할 수 있으며, 더 많은 양의 Na₂CO₃를 필요로 할 수 있다. 따라서, pH를 유지하기 위해서 NaOH와 Na₂CO₃의 혼합물을 사용하면, 알칼리 소비가 감소하기 때문에, 폴리오스의 비생산성(specific productivity) 및 높은 용적 생산성을 나타내면서 생장이 감소할 수 있다.

본 발명에 따른 방법에 의하면, 글루코스가 젖산으로 변환되고 pH가 감소하기 시작하면, pH는, 알칼리 혼합물의 첨가 및 동시에 배지 내 고갈된 글루코스의 공급을 위한 글루코스의 첨가에 의해 유지될 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시예에서, 발효 영양분 공급 성분은 하나 이상의 탄소원, 하나 이상의 질소원, 하나 이상의 마그네슘원을 포함할 수 있고, 이들은 알칼리 혼합물 첨가속도와 평형을 이루는 공급속도로 특정 세포 밀도에서 회분식 발효에 공급될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 알칼리 혼합물은, 수산화나트륨, 탄산나트륨, 탄산수소나트륨, 수산화칼륨, 탄산칼륨 및 수산화칼슘으로 이루어진 군으로부터 선택된 두 개 이상의 염기를 함유한다. 또한 수산화나트륨과 탄산나트륨의 소정의 비율은 캡슐형 폴리오스의 높은 용적 생산성을 달성할 수 있도록 선택된다.

수산화나트륨과 탄산나트륨의 소정의 비율은 1:1 내지 4:1일 수 있다.

본 발명에 따르면, NaOH는, pH를 유지하기 위해서, Na₂CO₃와 함께 혼합물로 사용될 때 캡슐형 폴리오스의 생산성을 더 증가시킨다. pH를 유지하기 위해서 Na₂CO₃만을 사용하면, 생장에 적합한 배지를 제공할 수 있으나, Na₂CO₃를 제한하는 조건은 캡슐형 폴리오스를 생성하는 데 스트레스 상태를 유발한다. pH를 유지하기 위해서 NaOH와 Na₂CO₃의 혼합물을 사용하면, 생장은 감소하지만 캡슐형 폴리오스의 생산성은 증가한다.

바람직하게는, 본 발명은, 캡슐형 폴리오스가 높은 수율로 생산되는, Streptococcus의 유가 배양 방법을 제공한다. 바람직하게는, 배양 배지에서 얻은 캡슐형 폴리오스의 수율은 900 내지 2,000 mg/L 이상이다. 따라서, 이러한 유가 배양 방법을 사용하면 회분 배양에 비해 150 내지 350 % 증가된 용적 수율로 캡슐형 폴리오스를 생산할 수 있다. 경우에 따라서는, 수율은, 회분 배양을 사용할 때 생산되는 양보다 2배 이상, 바람직하게는 4배 이상일 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시예에서, 공급 배지는 하나 이상의 탄소원, 하나 이상의 질소원, 하나 이상의 염 및 하나 이상의 아미노산을 포함할 수 있다.

바람직하게는, 탄소원은 글루코스이다. 질소원은 효모 자가분해물(autolysate), 효모 질소 염기, 펩톤, 트립톤, 카사미노산, 콩가루, Hy-Soy, 효모 추출물 및 TSB(tryptic soy broth)로부터 선택될 수 있다. 염은 황산칼륨, 염화칼슘, 염화마그네슘, 황산마그네슘 및 이들의 혼합물로부터 선택될 수 있다.

본 발명에 따르면, 공급 배지는 다음의 성분들을 포함할 수 있다(단위: gm/L): 100-500 범위의 글루코스, 1-7.5 범위의 황산마그네슘, 40-150 범위의 Hy-soya, 5-50 범위의 효모 추출물, 0.002-0.005 범위의 티아민-HCl염, 0.2-0.5 범위의 시스테인, 0.2-0.5 범위의 염화칼슘.

또한 공급 배지는 다음의 성분들을 포함할 수 있다(단위: gm/L): 100-500 범위의 글루코스, 5-50 범위의 효모 추출물, 0.002-0.005 범위의 티아민-HCl염, 0.2-0.5 범위의 시스테인, 0.2-0.5 범위의 염화칼슘.

바람직하게는, 공급 배지는 다음의 성분들을 포함할 수 있다(단위: gm/L): 100-500 범위의 글루코스, 0.5-7.5 범위의 황산마그네슘, 40-150 범위의 Hy-soya 및 5-50 범위의 효모 추출물.

본 발명의 바람직한 실시예에서, 공급 배지는 다음의 성분들을 포함할 수 있다(단위: gm/L): 100-200 범위의 글루코스, 1-3 범위의 황산마그네슘, 50-150 범위의 Hy-soya, 및 15-25 범위의 효모 추출물.

본 발명에 따르면, 새로운 유가식 공정은, Escherichia coli, Francisella tularensis, Haemophilus influenzae, Klebsiella, Moraxella catarrhalis, Neisseria meningitidis 그룹 A, C, W₁₃₅ Y 및 X, Porphyromonas gingivalis, Pseudomonas aeruginosa, Burkholderia cepacia, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Salmonella paratyphi, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Vibrio cholera, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, 그룹 A Streptococcus, 그룹 B Streptococcus, Mycobacterium tuberculosis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis 및 Streptococcus pneumoniae로 이루어진 군으로부터 선택된 캡슐형 폴리오스를 생산하는 데 이용될 수 있다.

실시예

실시예 1

S. Pneumoniae 혈청형 1의 유가식 생장의 최적화를 위한 원료 공급 방법의 평가

원료 공급을 위한 다양한 원료 공급 방법을 평가하였다. DO-stat 방법은 S. Pneumoniae의 발효에 적합하지 않았다. S. Pneumoniae는 미세-호기성 박테리아이기 때문에, 발효 공정 동안 표면만 통기(aeration)하면 되었다. 회분식 발효가 일어나는 동안 발효조 내에서 S. Pneumoniae가 부분적으로 생장한 후에, 용존 산소량은 거의 0이었다.

유가식 발효를 위한 5가지의 상이한 공급 방법을 수행하였다.

1. pH-stat 방법: pH-stat 공급 방법은 pH-설정값에 의해 조절되었으며, 배양물의 pH가 pH-설정값을 초과하여 상승하면 탄소원이 배지에 첨가되고, pH가 pH-설정값 미만으로 하락하면 탄소원의 공급이 중단되었다.

2. 일정 속도 공급 방법: 이 방법에서 1 L의 농축 영양분이 1.6 L의 배지 배양물에 4시간 동안 4.2 ml/min로 공급되었다.

3. 지수적(exponential) 공급 방법: 공급속도는 1 ml/min로 시작하여 OD가 증가함에 따라 증가되었다. 공급속도는 OD가 1단위 증가할 때마다 0.5 ml/min씩 증가하였다.

4. 일정 글루코스 농도: 유가식 발효가 일어나는 동안 글루코스 잔기의 농도가 약 0.5 g/L로 유지되도록 하였다.

5. pH-의존적 공급 방법: 이 방법에서 pH는 Na₂C0₃를 통해 유지되었다. pH를 유지하기 위해서, 배지 내에 고갈된 글루코스를 보충하기 위한 글루코스는 Na₂C0₃가 공급되는 속도와 같은 속도로 배지에 첨가되었다.

모든 실험에서 NBS Bioflo 115 및 Bioengineering AG fermenter를 사용하였다. 본 연구는 3 L NBS Bioflo 115 fermenter 모델로 수행하였고, 30 L Bioengineering AG Fermenter로 스케일-업(scale-up)시켰다. 추가적인 스케일-업은 450 L Bioengineering fermenter로 수행할 수 있었다. 모든 유가식 발효에서 200 g/L의 글루코스 및 5 g/L의 MgSO₄를 공급 배지로 사용하였다. 발효 조건은 모든 유가식 실험에서 동일하였다. 발효 과정 동안 pH는 20% Na₂CO₃ 용액을 통해 유지되었다.

다음 파라미터는 유가식 발효에서 동일하다: 온도(36.5±0.5), pH(7.1±0.2), RPM - 100, 기체흐름(표면 통기) - 0.5 vvm.

다양한 공급 방법에 따른 혈청형 1의 캡슐형 폴리오스 수율

공급 방법	캡슐형 폴리오스 수율 ( mg /L)
미공급	210
pH-stat 방법	170
일정 속도 공급 방법	198
지수적 공급 방법	180
일정 글루코스 농도	160
pH-의존적 공급 방법	260

실시예 2

S. Pneumoniae 혈청형 1 캡슐형 폴리오스의 유가식 발효에 최적화된 공급 배지

발효가 일어나는 동안 영양분의 공급을 위해서 하기의 다양한 배지를 사용하였다.

1. 글루코스 - 200 g/L

2. 글루코스 - 200 g/L, MgSO₄ - 2.5 g/L

3. 글루코스 - 200 g/L, MgSO₄ - 2.5 g/L, 효모 추출액 - 25 g/L

4. 글루코스 - 100 g/L, MgSO₄ - 5 g/L, 효모 추출액 - 15 g/L, Hy-soya - 50 g/L

5. 글루코스 - 200 g/L, MgSO₄ - 2.5 g/L, 효모 추출액 - 25 g/L, Hy-soya - 100 g/l

6. 글루코스 - 200 g/L, MgSO₄ - 2.5 g/L, 효모 추출액 - 25 g/L, Hy-soya - 100 g/L, 티아민-HCl염 - 0.02 g/L, CaCl₂.2H₂O - 0.02 g/L, 시스테인 - 0.2 g/L

7. 글루코스 - 100 g/L, MgSO₄ - 1 g/L, 효모 추출액 - 10 g/L, Hy-soya - 40 g/L, 티아민-HCl염 - 0.04 g/L, CaCl₂.2H₂O - 0.04 g/L, 시스테인 - 0.2 g/L

모든 발효 조건은 전술한 조건으로 유지하였다. 모든 배치에서 유가식 발효의 영양분 공급을 위해 pH-의존적 공급 방법을 사용하였다. 4번 공급 배지는 추가적인 유가식 실험에 사용되었다.

다양한 공급 배지 조성 변화에 따른 혈청형 1의 캡슐형 폴리오스 수율

공급 배지 조성	캡슐형 폴리오스 수율 ( mg /L)
1	265
2	385
3	460
4	420
5	400
6	375
7	352

실시예 3

pH 유지에 사용되는 알칼리 혼합물

NaOH는, pH를 유지하기 위해서, Na₂CO₃와 함께 혼합물로 사용하였을 때 캡슐형 폴리오스의 생산성을 더 증가시켰다. pH를 유지하기 위해서 Na₂CO₃만을 사용하였을 때는, 생장에 적합한 배지를 제공할 수는 있었으나, Na₂CO₃를 제한하는 조건이 캡슐형 폴리오스를 생성하는 데 스트레스 상태를 유발하였다. pH를 유지하기 위해서 NaOH와 Na₂CO₃의 혼합물을 사용하였을 때, 생장은 감소하였지만 캡슐형 폴리오스의 생산성은 증가하였다. 8% NaOH 및 20% Na₂CO₃를 1:1, 2:1, 3:1 및 4:1의 비율로 사용하였다. 이하의 유가식 방법에서 영양분 공급원으로서 실시예 2의 공급 배지 조성물 3번을 사용하였다.

S. Pneumoniae 혈청형 1의 유가식 발효에서 pH 유지에 사용되는 알칼리 혼합물

	캡슐형 폴리오스 수율 ( mg /L)	OD (590 nm ) X10
20% Na₂CO₃	440	154
20% Na₂CO₃ + 8% NaOH (1:1)	650	145
20% Na₂CO₃ + 8% NaOH (2:1)	590	148
20% Na₂CO₃ + 8% NaOH (3:1)	430	145
20% Na₂CO₃ + 8% NaOH (1:2)	705	125
20% Na₂CO₃ + 8% NaOH (1:3)	900	105

실시예 4

최적화된 유가식 조건에서 다양한 혈청형을 갖는 S. Pneumoniae 의 실험

혈철형 1에 대한 유가식 조건을 다른 혈청형에 대해서도 사용하였다. 유가식 발효를 수행하는 동안 이하의 조건들을 사용하였다.

1. pH-의존적 공급 방법

2. 알칼리 혼합물의 사용

3. 최적화된 공급 배지

4. 다른 발효 조건은 전술한 것과 유사함

유가식 방법의 새롭게 최적화된 조건을 사용하여 혈청형 1, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 19A, 19F 및 23F를 실험하였다.

혈청형	회분식 발효시 캡슐형 폴리오스 수율 ( mg /L)	유가식 발효시 캡슐형 폴리오스 수율 ( mg /L)	회분식 발효에 대한 유가식 발효의 캡슐형 폴리오스 수율( mg/L)의 증가 배수
혈청형 1	228	900	3.95
혈청형 5	450	1450	3.2
혈청형 6B	550	1400	2.54
혈청형 9V	700	2000	2.86
혈청형 14	450	1100	2.44
혈청형 19A	450	1450	3.2
혈청형 19F	510	1530	3
혈청형 23F	550	1410	2.56
혈청형 7F	517	1800	3.48
혈청형 6A	508	1200	2.36

따라서 본 발명의 유가식 방법은 캡슐형 폴리오스 용적 수율을 150 내지 350 % 증가시키며, 본 발명에서 최종적인 캡슐형 폴리오스 수율은 900 내지 2,000 mg/L이다.

본 발명이 전술한 실시예의 상세한 사항으로만 한정되는 것이 아니며, 본 발명이 그 본질적인 특징을 벗어나지 않는 한 다른 형태로도 실시될 수 있다는 것은 당업자에게 자명할 것이다. 그러므로, 본 발명 및 실시예는 모든 측면에서 청구항에 관하여 예시적으로 설명하기 위한 것을 뿐 전술한 기재 내용으로 제한되는 것은 아니며, 따라서, 청구항의 등가적인 범위와 의미 내에서 이루어지는 모든 변형은 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.

Claims

(a) 캡슐형 폴리오스(capsular polyoses)를 발현하는 박테리아 균주의 접종원을 제공하는 단계;
(b) pH 6.9 내지 7.3 범위에서 유가식 발효에 의해 공급 배지가 첨가된 배양 배지에서 균주를 배양하는 단계로서, 상기 pH 범위를 유지하기 위하여 알칼리 혼합물이 공급 배지의 첨가속도와 같은 속도로 배양 배지에 첨가되며, 상기 알칼리 혼합물은 수산화나트륨과 탄산나트륨을 3 : 1의 비율로 포함하는, 단계; 및
(c) 배양물 배지를 0.1-0.5 vvm의 기체유속(air flow rate)으로 50-150 RPM으로 교반하면서 35-38 ℃에서 발효하는 단계
를 포함하는, 캡슐형 폴리오스의 높은 용적 생산성(volumetric production)을 위한 캡슐화된 박테리아의 배양 방법으로,
상기 박테리아가 Streptococcus pneumonia 임을 특징으로 하는,
캡슐화된 박테리아의 배양 방법.
제1항에 있어서,
상기 캡슐형 폴리오스의 용적 수율 증가량이 회분 배양 또는 연속 배양 조건에 대하여 150 내지 400 %인 것을 특징으로 하는, 캡슐화된 박테리아의 배양 방법.
제2항에 있어서,
상기 캡슐형 폴리오스의 수율이 900 내지 2,000 mg/L인 것을 특징으로 하는, 캡슐화된 박테리아의 배양 방법.
제1항에 있어서,
상기 공급 배지가 하나 이상의 탄소원, 하나 이상의 질소원, 하나 이상의 염 및 하나 이상의 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는, 캡슐화된 박테리아의 배양 방법.
제4항에 있어서,
상기 탄소원이 글루코스인 것을 특징으로 하는, 캡슐화된 박테리아의 배양 방법.
제4항에 있어서,
상기 질소원이 효모 자가분해물(autolysate), 효모 질소 염기, 펩톤, 트립톤, 카사미노산, 콩가루, Hy-Soy, 효모 추출물 및 TSB(tryptic soy broth)로부터 선택되는 세 개 이하의 성분으로 구성되는 것을 특징으로 하는, 캡슐화된 박테리아의 배양 방법.
제4항에 있어서,
상기 염이 황산칼륨, 염화칼슘, 염화마그네슘, 황산마그네슘 및 이들의 혼합물로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 캡슐화된 박테리아의 배양 방법.
제4항에 있어서,
상기 공급 배지가, 구성성분으로, 100-500 g/L 범위의 글루코스, 1-7.5 g/L 범위의 황산마그네슘, 40-150 g/L 범위의 Hy-soya, 5-50 g/L 범위의 효모 추출물, 0.002-0.005 g/L 범위의 티아민-HCl염, 0.2-0.5 g/L 범위의 시스테인, 및 0.2-0.5 g/L 범위의 염화칼슘을 포함하는 것을 특징으로 하는, 캡슐화된 박테리아의 배양 방법.
제4항에 있어서,
상기 공급 배지가, 구성성분으로, 100-500 g/L 범위의 글루코스, 5-50 g/L 범위의 효모 추출물, 0.002-0.005 g/L 범위의 티아민-HCl염, 0.2-0.5 g/L 범위의 시스테인, 및 0.2-0.5 g/L 범위의 염화칼슘을 포함하는 것을 특징으로 하는, 캡슐화된 박테리아의 배양 방법.
제4항에 있어서,
상기 공급 배지가, 구성성분으로, 100-200 g/L 범위의 글루코스, 1-3 g/L 범위의 황산마그네슘, 50-150 g/L 범위의 Hy-soya, 및 15-25 g/L 범위의 효모 추출물을 포함하는 것을 특징으로 하는, 캡슐화된 박테리아의 배양 방법.
제1항에 있어서,
알칼리 혼합물 내 수산화나트륨의 농도가 1.5 내지 3.0 M인 것을 특징으로 하는, 캡슐화된 박테리아의 배양 방법.
제1항에 있어서,
알칼리 혼합물 내 탄산나트륨의 농도가 10 내지 20 % (w/v)인 것을 특징으로 하는, 캡슐화된 박테리아의 배양 방법.
제5항에 있어서, 상기 글루코스가 젖산으로 변환되고, 알칼리 혼합물의 첨가 및 젖산으로 변환된 글루코스를 대체하기 위한 글루코스의 동시 첨가에 의하여 상기 pH 범위가 유지되는 것을 특징으로 하는, 캡슐화된 박테리아의 배양 방법.
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