CN115011496A - 高密度培养海洋病原菌大菱鲆弧菌的培养基及培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种高密度培养海洋病原菌大菱鲆弧菌的培养基及培养方法。所述培养基含酵母粉、蛋白胨、氯化钠、葡萄糖、磷酸二氢钾、氢氧化钠。本发明的培养基，适合于大菱鲆弧菌Vibrio scophthalmi的生长，且可大大的提高最终获得的菌体密度。

Description

高密度培养海洋病原菌大菱鲆弧菌的培养基及培养方法
技术领域
本发明属于生物工程领域，涉及微生物培养基和微生物发酵方法；更具 体地，本发明涉及一种高密度培养海洋病原菌大菱鲆弧菌的培养基及培养方 法。
背景技术
鉴于世界人口的不断增长及天然渔业资源的日益枯竭，水产业作为一种 传统产业，在近代得到了快速，有效的发展，并在社会、经济和人们生活中 突现出其重要地位。据统计，2002年中国水产品总量占全球总产量的71％和 总产值的49.8％，居世界第一位。据FAO统计，2004年中国的水产产品总 量达4750万吨。然而，由于水土资源的有限性，从提高养殖面积来增加产量 难以持续发展。因此，规模化、集约化、高密度研制模式逐渐成为中国鱼类 养殖业的发展主流。然而，随着渔业养殖的不断稳步发展，各种病害问题日 益突出，对养殖产量及成长造成严重影响。
针对各种病害的发生，以抗生素为代表的化学疗法对病害的控制和防治 曾发挥了积极作用。但是，这种病害控制措施造成的环境污染、抗药病原的 大量出现、水产品的药物残留等负面影响日趋严重。在欧盟、美国和加拿大, 以抗生素为主的化学药物在水产养殖业中已逐渐被禁用。其中，根据欧盟食 品安全白皮书的规定，欧盟国家禁止使用抗生素药物的养殖水产品进入贸易 市场。日本也开始限制使用多种抗生素药物用于养殖鱼类和虾类病害的防治。
作为世界上的水产养殖大国，中国的海水养殖品出口量只占到了养殖总 量的6％左右，一个主要的制约因素就是中国的水产品质量安全问题突出， 药物和有害物残留超标严重，成为扩大出口的主要障碍。近几年中国水产品 出口因质量安全问题受到欧盟、日本等国家和地区的限制。同时，由于病害 严重，突发性强，为规避病害风险，生产者普遍提早收获，造成产品规格偏 小，也影响了出口率和出口价格。为了增强水产养殖业的国际市场竞争力， 扩大水产养殖的出口创汇，国家已提出并开始推广建立无公害养殖技术规范， 其中一个主要技术指标就是禁止使用抗生素药物，以确保养殖水产品的食品 质量安全。
为遏制各种环境因素和养殖密度激增等造成的养殖鱼类病害日益严重的 发展趋势，推进海水养殖业的可持续发展，世界粮农组织结合发达国家渔业 发展的成功经验(OrmondeP.Fisheries resources:trends in production， utilization and trade.In:Nomura I(ed.).The State of World Fishery and Agricul ture 2002.Rome:FAOInformation Division，2002，p3～p45)，倡导“系统管理 途径”(System managementapproaches，SMA)养殖模式预防各种病害的发生。 这一措施中的一个主要内容就是提倡以疫苗接种为代表的各种免疫防治技术 的应用。这些措施的采用将大大减少化学药物的使用，既避免了对环境的污 染，又增加了水产品的消费安全性。作为符合环境友好、可持续发展战略的 经济有效的疾病控制策略和手段，接种疫苗在现代水产养殖规范中正成为世 界各国研究和开发的主要前沿和应用领域。
疫苗具有针对性强、抗病周期长、可终身免疫、效果显著和防治主动的 特点。以病原菌细胞灭活体为基础形式的灭活疫苗(Kill vaccine)为水产养殖 病害防治提供了有效手段，但灭活疫苗普遍具有给药不便(注射给药才具有较 好的免疫保护力)的技术应用缺陷，对于需要免疫成千上万数量的鱼类养殖业 来说极为不便，给药成本往往不能为水产养殖业所承受。而且，对于病害发 生严重的鱼苗和幼鱼则无法实施注射给药，同时，对许多病害灭活疫苗往往 效果不佳或无效。这一切都给水产养殖病害免疫防治技术的广泛应用带来了 阻碍。
水产养殖业的产业特点要求病害防治技术必须经济、应用实施方便。因 此，疫苗产品的开发除高效价的技术要求外，免疫成本必须低廉，不能超出 养殖业的承受能力。减毒活疫苗因具有给药方便(可浸泡给药)、免疫效价高(可减少给药剂量)、成本低廉、可开发广谱疫苗(活菌疫苗往往具有交叉保护 性)的新技术优势，已成为当前国际上水产养殖用疫苗研究和开发的热点和前 沿领域。
海洋病原菌大菱鲆弧菌能够感染鱼类，导致鱼的消化道疾病，然而，人 工培育大菱鲆弧菌在本领域中仍然是非常困难的，尤其是难以实现较大规模 的高密度培养。现有的通用型或商品化培养基均难以被直接应用于大菱鲆弧 菌的培养。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高密度培养海洋病原菌大菱鲆弧菌的培养基 及培养方法。
在本发明的第一方面，提供一种高密度培养大菱鲆弧菌的方法，包括：
(1)利用培养基发酵培养大菱鲆弧菌，所述培养基包括：酵母粉、蛋白 胨、磷酸二氢钾、氯化钠、葡萄糖、氢氧化钠；和
(2)发酵培养至6±1小时时以补料培养基1进行补料，补料培养基1包 括葡萄糖。
在一个优选例中，步骤(2)中，发酵培养至9±1小时时还以补料培养基2 进行补料，补料培养基2包括蛋白胨和酵母粉。
在另一优选例中，在发酵起始至10±2小时控制溶氧在10～20％，此后 调节溶氧上升至30～50％。
在另一优选例中，在发酵终止前2～5小时(如3、4小时)允许溶氧上升， 或不再控制溶氧。
在另一优选例中，还包括步骤：(3)在发酵培养至15～24小时、或在 OD600达到16～30(较佳地18～25)时，发酵结束。
在另一优选例中，(1)中，所述的培养基包括：
Figure BDA0002962614960000031
Figure BDA0002962614960000041
在另一优选例中，(2)中，所述的补料培养基1包括：
葡萄糖：250～350g/L。
在另一优选例中，所述的补料培养基2包括：
蛋白胨：30～70g/L；
酵母粉：60～100g/L。
在另一优选例中，培养基的各个组分溶于去离子水中。
在另一优选例中，发酵培养的规模为0.5～1000L，如1、2、5、10、15、 20、30、50、100、200、500L。
在另一优选例中，发酵培养的温度为28±2℃；更佳地28±1℃。
在另一优选例中，培养基中还加入消泡剂。
在另一优选例中，培养基中接种量为5～20％。
在另一优选例中，(2)中，补料培养基1的补料的速率为：初始速度10 ±2ml/h(较佳地10±1ml/h)，之后每1±0.3小时(较佳地1±0.2小时或1±0.1 小时)增加5±1ml/h，直至速度30±5ml/h时不再增加。
在另一优选例中，补料培养基2的补料的速率为：初始速度60±10ml/h (较佳地，60±5ml/h、60±2ml/h)。
在另一优选例中，发酵过程中，以氨水调节pH值；较佳地，所述氨水 为10～50％(w/v)氨水(如20～30％(w/v))。
在本发明的另一方面，提供一种用于进行大菱鲆弧菌高密度培养的培养 基或培养基组合(试剂盒)，所述的培养基包括：
Figure BDA0002962614960000042
在一个优选例中，其为培养基组合(试剂盒)，其包括：
包装1，其中装有培养基：
Figure BDA0002962614960000051
包装2，其中装有补料培养基1：
葡萄糖：250～350g/L；
和/或，包装3，其中装有补料培养基2：
蛋白胨：30～70g/L；
酵母粉：60～100g/L。
在另一优选例中，培养基或培养基组合中还包括消泡剂。
在另一优选例中，培养基组合中还包括氨水，较佳地，所述氨水为10～ 50％(w/v)氨水(如20～30％(w/v))。
在本发明的另一方面，提供前面所述的培养基或培养基组合的应用，用 于进行大菱鲆弧菌高密度培养。
在本发明的另一方面，提供前面所述的方法的应用，用于进行大菱鲆弧 菌高密度培养。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显 而易见的。
附图说明
图1、实施例2的培养方法的发酵过程中生物量以及溶氧曲线。
图2、实施例3的补糖补料分批发酵的发酵过程中生物量以及溶氧曲线。
图3、实施例4的不分段控制DO补料分批发酵的发酵过程中生物量以 及溶氧曲线。
图4、实施例5的补料分批发酵的发酵过程中生物量以及溶氧曲线。
具体实施方式
本发明人经过深入的研究，揭示了海洋病原菌大菱鲆弧菌的新型发酵策 略，其能够实现高密度、较长周期的发酵。本发明人充分考虑海洋病原菌大 菱鲆弧菌这一菌种的生长特点和发酵过程特点，在进行培养基优化的同时、 进一步在发酵过程中采取适当的补加策略和/或溶氧策略，可有效提高该菌的 生长密度、促进发酵周期的持续时间。本发明提供了一种条件可控、过程控 制简易、成本低廉的调控其高密度生长的方法，可极为有效地延长发酵的有 效时间，提高海洋病原菌大菱鲆弧菌的产量。
术语
如本发明所用，所述的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、 “主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”；“主要 由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具 有”或“包括”的下位概念。
如本发明所用，“约”、“大约”、“大概”或“基本上”一般应指一 特定数值或范围如20％以内、较佳10％以内、更佳地5％以内的上下浮动。 在此所使用的数值为近似值，代表若未明示地陈述，“约”、“大约”、“大 概”或“基本上”等词可以被推断适用。
如本发明所用，所述的“一级发酵”、“二级发酵”是指种子罐发酵。 所述的“三级发酵”是以生产青霉素为目的的发酵。除非另外说明，本发明 权利要求及说明书中所述的“发酵”、“培养”是指“三级发酵”。
除非另外说明，本发明权利要求及说明书中时间点的计算以“三级发酵” 起始的时间点作为起始(0小时)。
培养基
如前所述，海洋病原菌大菱鲆弧菌(Vibrio scophthalmi)能够感染鱼类，导 致鱼的消化道疾病，然而，人工培育大菱鲆弧菌在本领域中仍然是较为困难 的，尤其是难以实现较大规模的高密度培养。
本发明人的分析和实验中发现，对于大菱鲆弧菌这一种菌株，发酵培养 基中，葡萄糖作为碳源相对于其它碳源(如甘油、淀粉、蔗糖等碳源)来说更 易被利用，具有更好的表现。由此，本发明中采用葡萄糖作为碳源。
本发明人的分析和实验中发现，对于大菱鲆弧菌这一种菌株，发酵培养 基中，氮源的使用上，酵母粉与蛋白胨的组合相较于单纯的蛋白胨或酵母粉 或玉米粉表现更好；而氯化钠的加入则可进一步提升菌体量。而一些无机氮 源如尿素、氯化铵等的添加并不能提高菌体量。
本发明人的分析和实验中发现，发酵培养基中，磷酸二氢钾及氢氧化钠 能很好地控制培养基的初始pH，有利于菌体稳定地增量。
基于本发明人的上述新发现，本发明提供了一种新型的用于高密度培养 大菱鲆弧菌的培养基，所述培养基包括：酵母粉、蛋白胨、磷酸二氢钾、氯 化钠、葡萄糖、氢氧化钠。
在本发明的优选方式中，所述的大菱鲆弧菌的培养基包括的组分的用量 如表1所示。
表1
较佳量 更佳量 举例
酵母粉 12～20g/L 14～18g/L 15、16、17
蛋白胨 6～15g/L 8～12g/L 9、10、11
磷酸二氢钾 4～10g/L 5～8g/L 6、7
氯化钠 20～30g/L 23～27g/L 24、25、26
葡萄糖 2～4g/L 2.5～3.5g/L 2.6、2.8、3、3.2、3.4
氢氧化钠 1～3g/L 1.5～2.5g/L 1.6、1.8、2、2.2、2.4
作为本发明实施例中的一个具体实例，每升(L)发酵培养基中包括：酵母 粉16g，蛋白胨10g，磷酸二氢钾6.8g，氯化钠25g，葡萄糖3g，氢氧化钠 2g。
除了发酵培养基，结合本发明的优化的工艺，本发明人也优化了补料培 养基，所述的补料培养基具有适合于被大菱鲆弧菌利用的合适的营养成分。 作为本发明的优选方式，本发明人设计了两组补料培养基，配合发酵的不同 阶段进行先后的补料。补料培养基1包括葡萄糖，补料培养基2包括蛋白胨 和酵母粉。本发明人发现，无机氮源的添加反而不利于补料后的菌体密度的 提高，因此所述的补料培养基中不包括无机氮源。
在本发明的优选方式中，所述的大菱鲆弧菌的补料培养基1或2包括的 组分的用量如表2所示。
表2
较佳量 更佳量 更佳量 举例
葡萄糖 250～350g/L 270～330g/L 280～320g/L 290、300、310g/L
蛋白胨 30～70g/L 35～65g/L 40～60g/L 45、50、55、60、65g/L
酵母粉 60～100g/L 65～95g/L 70～90g/L 75、80、85g/L
本发明的培养基，各个组分配方简单、原料易得、制备方法简单、成本 低廉，但是却能由大菱鲆弧菌有效且高效地利用，维持菌体良好的生长状态， 非常适用于大菱鲆弧菌的培养，可显著地增加整个发酵系统的发酵时间，且 大大提高发酵体系最终获得的菌体密度。
培养基组合/试剂盒
基于上述的培养基的优化，本发明还提供了一种用于高密度培养大菱鲆 弧菌的培养基组合，其包括上述的发酵培养基，以及包括上述的补料培养基。
此外，本发明也提供了一种用于高密度培养大菱鲆弧菌的试剂盒，其中 包括上上述的发酵培养基和补料培养基。试剂盒通常包括包装/容器，立分别 装入合适量的所述的发酵培养基和补料培养基，两种培养基独立地被包装。 所述的试剂盒通常还包括使用说明书，其上可记载使用所述培养基的方法， 也可记载例如本发明的优化工艺或方法概要，以利于本领域技术人员方便地 进行高密度发酵培养的操作。
发酵工艺
大菱鲆弧菌是一种感染大菱鲆消化道的菌，严重威胁此类鱼的健康。因 此，开发其疫苗(如减毒或灭活的疫苗)是非常重要的。规模化制备疫苗时需 要大量的菌体，找到高密度发酵生产该菌株的方法显得非常迫切。
作为本发明的优选方式，本发明人采用以下策略来优化菌体产量：以葡 萄糖为基础碳源支持菌体的生长，在适当的时期控制低速补糖结合底物能保 证菌体快速生长。此后开始补入氮源能进一步提升菌体浓度，在此发酵工艺 下能大幅度提高菌体产量且减少副产物生成。结果发现，与普通分批发酵相 比，菌体产量有很大提高。具体地，该方法包括：(1)利用培养基发酵培养 大菱鲆弧菌，所述培养基包括：酵母粉、蛋白胨、磷酸二氢钾、氯化钠、葡 萄糖、氢氧化钠；和(2)发酵培养至6±1小时时以补料培养基1进行补料， 补料培养基1包括葡萄糖。这一方法，与采用前述发酵培养基的普通发酵相 比，菌体产量有显著地提高。
作为本发明的优选方式，发酵培养至9±1小时时还以补料培养基2进行 补料，补料培养基2包括蛋白胨和酵母粉。
作为本发明的优选方式，在发酵起始至10±2小时控制溶氧在10～20％， 此后调节溶氧上升至30～50％。较佳地，在发酵终止前2～5小时(如3、4 小时)允许溶氧上升，或不再控制溶氧。
作为本发明的优选方式，补料培养基1的补料的速率为：初始速度10± 2ml/h(较佳地10±1ml/h)，之后每1±0.3小时(较佳地1±0.2小时或1±0.1 小时)增加5±1ml/h，直至速度30±5ml/h时不再增加；或，补料培养基2的 补料的速率为：初始速度60±10ml/h(较佳地，60±5ml/h、60±2ml/h)。
应理解，发酵过程中涉及的其它常规试剂也可被应用于本发明中，例如 消泡剂等。
应理解，发酵过程的前期，还包括种子培养，这可以采用一些常规的培 养条件。
作为本发明的优选方式，发酵液生物量检测标准为OD600，取样后立即 用紫外分光光度计测定反应体系在600nm的吸光值；空白对照是初始培养 基。
根据本发明的一个具体实施例，每升发酵培养基包括：酵母粉16g，蛋 白胨10g，磷酸二氢钾6.8g，氯化钠25g，葡萄糖3g，氢氧化钠2g；取种子 液按照10％的接种量接入发酵罐中进行分批发酵培养，于发酵6h左右，开 始以补料培养基1补料，补料速度为10ml/h，每隔1h增加5ml/h至30ml/h 后不增加至发酵结束；更优选地，于发酵9h左右，补料速度为60ml/h，持 续至发酵结束。
根据本发明的一个具体实施例，发酵初始发酵液pH为6.8，发酵过程控 制pH；所述补料分批发酵培养初始条件是在24℃，300rpm，通气为2vvm 下。
本发明的方法适用于多种发酵规模的应用，适用于工业规模生产。例如， 发酵规模为1～10000L；更佳地为5～5000L；如2000L，1000L，800L，500L， 200L，100L，80L，50L，30L等。
在发酵结束后，可直接收取菌液进行下一步疫苗制备。
本发明的新型发酵工艺，为大菱鲆弧菌灭活疫苗的大规模制备及应用奠 定了基础。本发明中包括的培养基原料易得、成本低、制备方法简单，培养 密度高，发酵工艺是建立在碳源代谢研究的基础上开发出的简单实用高效的 工艺。
与已有的培养技术相比，本发明的新型培养基在提供的补料发酵工艺下 能显著提升大菱鲆弧菌发酵最终生物量，有利于工业大规模培养大菱鲆弧菌， 填补了大菱鲆弧菌高密度培养方面的空白，也为大菱鲆弧菌的大规模制备及 应用奠定了基础。
在发酵结束后，可直接收取菌液进行下一步疫苗制备。
本发明的主要有益效果包括：
1.本发明所述的新型培养基成分原料易得，成本低，制备简单；
2.本发明培养大菱鲆弧菌终产量能达到OD600值达到或高于15，相对于 常用培养基的无法培养，显然实现了培养技术的大大进步；
3.本发明的发酵工艺控制简单，易于操作，效果明显，主要体现在补料 策略和菌体收集上，收集活菌省去了灭活步骤，降低了环境污染及人员危害， 在此发酵工艺下能大幅度提高菌体产量；
4.本发明提供的培养工艺培养大菱鲆弧菌Vibrio scophthalmi能达到 OD600值15以上，实现了高密度培养；
5.本发明的所述发酵工艺控制简单，易于操作，效果明显，主要体现在 补料策略和溶氧控制上，前期控制低速补糖结合底物能保证菌体在其后的阶 段快速生长。在适当的时期开始补氮能进一步提升菌体浓度。菌体生长前中 期控制DO在10～20％的较低水平，防止菌体生长过快过早自溶，但不让DO 太低以防止乙酸积累过多。在生长中后期提高DO水平有助于菌体快速扩增。 在此发酵工艺下能大幅度提高菌体产量且减少副产物生成。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于 说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实 验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第 三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1、培养基的初筛
大菱鲆弧菌Vibrio scophthalmi(华东理工大学阿华所提供，编号 MAVS001)。
商品化的培养基、本发明人前期研究过的培养基及上述“2、发酵培养基” 进行初步摇瓶培养实验，接种量1％。培养20小时，结果如表3。
表3
菌株状态
TSB培养基 培养基透明，无活菌
LB培养基 培养基透明，无活菌
TYB培养基 培养基透明，无活菌
2216E培养基 培养基浑浊，无活菌
此外，本发明人也反复以实验室的一些经验培养基进行培养，但也难于 成功实现较高密度地培养大菱鲆弧菌。因此，大菱鲆弧菌为一种不容易人工 培养，对于培养条件要求高的菌株。
实施例2、发酵培养基
1、生物反应器
使用的生物反应器为上海迪必尔生物工程有限公司生产的3联平行生物 反应器。
2、发酵培养基
称取酵母粉32g，蛋白胨20g，磷酸二氢钾13.6g，氯化钠50g，氢氧化 钠4g，用部分去离子水溶解，混合定容至2L，装罐后加入消泡剂1ml；灭菌； 葡萄糖单独灭菌，接种前按3g/L浓度加入前者。
3、发酵培养
挑取单菌落接种至装有上述培养基的摇瓶中，28℃、200rpm摇床发酵培 养14h，获得一级种子液；取上述种子液按照2％的接种量接入装有上述培养 基的摇瓶中20h获得二级种子液。
取所述种子液按照10％的接种量接入所述培养基中进行发酵培养，控制 初始pH在6.8±0.1之间，过程用25％氨水控制pH，联动转速通气控制溶氧 基本在20～50％之间(在发酵终止前允许溶氧上升)。
此工艺下发酵12h结束，发酵过程中生物量在发酵8h达到最大，OD600达到6.5左右。发酵过程曲线见图1。
实施例3、发酵过程补料(补糖)分批发酵
1、生物反应器
本实验室使用的生物反应器为上海迪必尔生物工程有限公司生产的3联 平行生物反应器。
2、培养基配制
称取酵母粉32g，蛋白胨20g，磷酸二氢钾13.6g，氯化钠50g，氢氧化 钠4g，用部分去离子水溶解，混合定容至2L，装罐后加入消泡剂1ml；灭菌； 葡萄糖单独灭菌，接种前按3g/L浓度加入前者。
3、补料配制
补料1：称取葡萄糖300g，用去离子水溶解，定容至1L，单独灭菌。
4、发酵培养
挑取单菌落接种至装有上述培养基的摇瓶中，28℃、200rpm摇床发酵培 养14h，获得一级种子液；取上述种子液按照2％的接种量接入装有上述培养 基的摇瓶中20h获得二级种子液。
取所述种子液按照10％的接种量接入所述培养基中进行发酵培养，控制 初始pH在6.8±0.1之间(过程用25％氨水控制pH)，溶氧在20～50％之间。 于发酵6h菌体开始向发酵体系中添加补料1，补料速度为10ml/h，每隔1h 增加5ml/h至30ml/h后不增加至发酵结束。
通过调节搅拌转速和通气量控制溶氧，发酵0～10h左右，溶氧控制在 10～20％，当发酵约10h后，控制溶氧基本上在30～50％之间(在发酵终止前 允许溶氧上升)。此工艺下发酵18～20h结束，发酵过程中于12h达到最高 OD600 17.86、后续不再显著增加。因此，这一方法下发酵持续时间能够显著 增加。发酵过程曲线见图2。
实施例4、发酵过程补料(补糖+氮源)分批发酵
1、生物反应器
使用的生物反应器为上海迪必尔生物工程有限公司生产的3联平行生物 反应器。
2、培养基配制
称取酵母粉32g，蛋白胨20g，磷酸二氢钾13.6g，氯化钠50g，葡萄糖6g，氢氧化钠4g，用部分去离子水溶解，混合定容至2L，装罐后加入消泡 剂1ml；灭菌；葡萄糖单独灭菌，接种前按3g/L浓度加入前者。
3、补料配制
补料1：称取葡萄糖300g，用去离子水溶解，定容至1L，单独灭菌。
补料2：称取蛋白胨50g，酵母粉80g，用去离子水溶解，定容至1L， 单独灭菌。
4、发酵培养
挑取单菌落接种至装有上述培养基的摇瓶中，28℃、200rpm摇床发酵培 养14h，获得一级种子液，取上述种子液按照2％的接种量接入装有上述培养 基的摇瓶中20h获得二级种子液。
取所述种子液按照10％的接种量接入所述培养基中进行发酵培养，控制 初始pH在6.8±0.1之间(过程用25％氨水控制pH)，溶氧在30～50％之间。
于发酵6h开始向发酵体系中添加补料1，补料速度为10ml/h，每隔1h 增加5ml/h至30ml/h后不增加至发酵结束。于发酵9h开始向发酵体系中添 加补料2，补料速度为60ml/h，持续至发酵结束。通过调节搅拌转速和通气 量控制溶氧，控制溶氧基本在30～50％之间(在发酵终止前允许溶氧上升)。
此工艺下发酵18h结束，发酵过程中于16h达到最高OD600 19.72。这一 方法下发酵持续时间能够进一步增加。发酵过程曲线见图3。
实施例5、发酵过程补料分批发酵
1、生物反应器
使用的生物反应器为上海迪必尔生物工程有限公司生产的3联平行生物 反应器。
2、培养基配制
称取酵母粉32g，蛋白胨20g，磷酸二氢钾13.6g，氯化钠50g，葡萄糖 6g，氢氧化钠4g，用部分去离子水溶解，混合定容至2L，装罐后加入消泡 剂1ml；灭菌；葡萄糖单独灭菌，接种前按3g/L浓度加入前者。
3、补料配制
补料1：称取葡萄糖300g，用去离子水溶解，定容至1L，单独灭菌。
补料2：称取蛋白胨50g，酵母粉80g，用去离子水溶解，定容至1L， 单独灭菌。
4、发酵培养
挑取单菌落接种至装有上述培养基的摇瓶中，28℃、200rpm摇床发酵培 养14h，获得一级种子液；取上述种子液按照2％的接种量接入装有上述培养 基的摇瓶中20h获得二级种子液。
取所述种子液按照10％的接种量接入所述培养基中进行发酵培养，控制 初始pH在6.8±0.1之间(过程用25％氨水控制pH)。于发酵6h开始向发酵体 系中添加补料1，补料速度为10ml/h，每隔1h增加5ml/h，至30ml/h后不增 加至发酵结束。于发酵9h开始向发酵体系中添加补料2，补料速度为60ml/h， 持续至发酵结束。
通过调节搅拌转速和通气量控制溶氧，发酵0～10h左右，溶氧基本上控 制在10～20％，发酵约10h后，控制溶氧基本上在30～50％之间(在发酵终止 前允许溶氧上升)。此工艺下发酵18～20h结束，发酵过程中于16h达到最高 OD600 22.91。发酵过程曲线见图4。
综上所述，本发明中的新型培养基原料易得、成本低、制备方法简单、 培养密度高。与未经优化的初始培养方式相比，优化后的新型培养基及培养 策略(补料和/或溶氧调控策略)下能显著提升大菱鲆弧菌Vibrio scophthalmi 发酵最终生物量，有利于工业大规模培养大菱鲆弧菌Vibrio scophthalmi，填 补了大菱鲆弧菌Vibrio scophthalmi高密度培养方面的空白，也为大菱鲆弧菌 灭活疫苗的大规模制备及应用奠定了基础。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文 献被单独引用作为参考那样。此外应理解，以上所述的是本发明的具体实施 例及所运用的技术原理，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术 人员可以对本发明作各种改动或修改而不背离本发明的精神与范围，这些等 价形式同样落在本发明的范围内。

Claims (10)

1.一种高密度培养大菱鲆弧菌的方法，其特征在于，包括：
(1)利用培养基发酵培养大菱鲆弧菌，所述培养基包括：酵母粉、蛋白胨、磷酸二氢钾、氯化钠、葡萄糖、氢氧化钠；和
(2)发酵培养至6±1小时时以补料培养基1进行补料，补料培养基1包括葡萄糖。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，发酵培养至9±1小时时还以补料培养基2进行补料，补料培养基2包括蛋白胨和酵母粉；和/或
在发酵起始至10±2小时控制溶氧在10～20％，此后调节溶氧上升至30～50％。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括步骤：
(3)在发酵培养至15～24小时、或在OD600达到16～30时，发酵结束。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(1)中，所述的培养基包括：
Figure FDA0002962614950000011
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(2)中，所述的补料培养基1包括：
葡萄糖：250～350g/L；
或，所述的补料培养基2包括：
蛋白胨：30～70g/L；
酵母粉：60～100g/L。
6.如权利要求1或5所述的方法，其特征在于，(2)中，
补料培养基1的补料的速率为：初始速度10±2ml/h，之后每1±0.3小时增加5±1ml/h，直至速度30±5ml/h时不再增加；或。
补料培养基2的补料的速率为：初始速度60±10ml/h。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，发酵过程中，以氨水调节pH值；较佳地，所述氨水为10～50％(w/v)氨水。
8.一种用于进行大菱鲆弧菌高密度培养的培养基或培养基组合，其特征在于，所述的培养基包括：
Figure FDA0002962614950000021
9.如权利要求8所述，其特征在于，其为培养基组合，其包括：
包装1，其中装有培养基：
Figure FDA0002962614950000022
包装2，其中装有补料培养基1：
葡萄糖：250～350g/L；
和/或，包装3，其中装有补料培养基2：
蛋白胨：30～70g/L；
酵母粉：60～100g/L。
10.权利要求8～9任一所述的培养基或培养基组合、或权利要求1～7任一所述的方法的应用，用于进行大菱鲆弧菌高密度培养。
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