CN104080904B - 培养细菌以提高荚膜多糖产率的新方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及培养条件的优化，其利用不同的进料溶液和供料策略来提高荚膜多糖(CP)生产。

Description

培养细菌以提高荚膜多糖产率的新方法

简述：

荚膜多糖是在细菌表面发现的各种细菌疾病中所涉及的重要免疫原。这一特征导致它们成为疫苗设计中的重要成分。已经证明了它们在引发免疫响应中是有用的，尤其是结合载体蛋白时。

通常，使用在复合培养基中的分批培养来生产荚膜多糖[参考Shen等，2001Vaccine 19:850-61；Palazzi等2004 J.Infect.Dis.190:558-64；Merritt等，2000J.Biotech.81:189-97；Dassy&Fournier1996 Infect.Immunol.64:2408-14；Suarez等(2001)Appl.Env.Microbiol.67:969-71；Wicken等(1983)J.Bact.153:84-92]。传统的营养素供料的DO-stat控制只是简单地基于营养素限制或耗尽时的DO升高/尖峰的概念(由于碳基质的减少或氧消耗或呼吸的停止)。所述DO-stat控制试图当DO升至高于设定点时通过提高营养素进料速率以及当DO降至低于设定点时通过降低营养素进料速率使培养物维持在限度内的恒定DO水平(DO设定点)。DO-stat策略通常适用于确定成分培养基，其中营养素耗尽导致快速的DO升高。然而，DO-stat方法在补充了丰富的复合营养素的培养基中常常失败，所述复合营养素如酵母提取物、胰蛋白胨、蛋白胨、酪蛋白氨基酸或Hy-Soy。丰富的复合营养素能够通过氨基酸分解代谢来支持细胞维持和呼吸，使得DO水平保持低的(即，没有明显的DO尖峰)，甚至于在碳源限制或耗尽的情况下。

当将复合培养基用于培养物生长时，pH-stat策略可能比DO-stat更合适，因为一旦碳源被耗尽，培养物pH趋于升高。以与DO-stat控制相似的方式，该pH-stat方法通过在pH升至高于设定点时提高营养素进料速率以及当pH降至低于设定点时降低营养素进料速率来维持恒定培养物pH大约在设定点。然而，由于营养素耗尽时培养物pH 的变化的响应性低于DO，因此当与DO-stat相比时，通过pH-stat的供料控制相对缓慢。

大部分研究使用了分批培养系统，其中生长速率、营养素水平和代谢浓度在培养过程中发生变化。在这样的系统中，一个因素的改变会导致与生长相关的其他因素的变化，这会不可预知地影响产率。连续培养允许研究者分离和限定分批培养生长过程中互相依赖的参数，如生长速率、营养素以及产物浓度和细胞密度。在连续培养过程中，将新鲜培养基以固定的速率加入到培养物中，并且以维持恒定培养体积的速率移出细胞和培养基。

在灌注培养中，将新鲜培养基以固定速率加入到培养物中，并且以维持恒定培养体积的速率移出无细胞的用过的培养基。然而，连续和灌注培养易于产生菌株稳定性问题和污染，并且由于培养基和营养素的连续进料，其费用稍高。因此，为了克服上述与连续培养相关的问题，需要寻找一种用于高产率生产荚膜多糖的连续培养的备选方案。

WO 2007/052168中例示了一种克服了连续培养缺陷的方法。已经研发了一种复合补料分批发酵方法以维持对cps生产有利的营养环境和生长速率。这种方法结合了分批和连续技术的优点，由于指数生长期的延长以及发酵过程中控制基质添加的条件，产生了高细胞密度。然而，该复合补料分批技术使用带有复杂算法的软件来操纵发酵。

另一种方法公开于WO 20100272755中。研发了一种用于培养细菌的方法，其中所述培养包括两次瞬时的酵母提取物添加，接着葡萄糖的线性添加。每次添加在指定的OD水平下开始。因此，不需要算法的碳源的线性添加是优于之前的复合补料分批发酵的改进。然而，这是一种非常繁重的方法，需要连续测量O.D.。此外，其未能考虑生物体的恒定变化需求(微环境)。

本发明是基于令人惊讶的发现并且涉及一种新的供料方法，其中补料分批发酵过程中的进料培养基添加的速率等于用于维持预定pH的碱混合物添加的速率，导致与之前现有的分批发酵方法相比，CP产率的体积增加。

发明概述：

本发明提供了一种新的补料分批发酵策略，导致与分批模式发酵相比，荚膜多糖生产力提高3至5倍。

特别地，本发明的方法涉及一种培养用于较高体积生产荚膜多糖(CP)的荚膜细菌的方法，其中所述方法包括(a)提供表达CP的细菌菌株的接种物；(b)通过在pH7.2下发酵来培养所述菌株，其中进料培养基添加的速率等于用于维持预定pH的碱混合物添加的速率；c)在50-150RPM搅拌下在35-38℃下，使用0.1-0.5vvm的空气流速发酵培养基。

附图简述：

图1：用于不同供料方法的肺炎球菌血清型1多糖(补料分批发酵)。

图2：针对用于维持pH的碱混合物中不同比例的碱的肺炎球菌血清型1多糖产率(补料分批)。

图3：与分批发酵相比，通过补料分批的肺炎球菌血清型1、5、6A、6B、7F、9V、14、19A、19F和23F多糖产率。

发明详述：

本发明公开内容提供了一种细菌培养方法，其中在补料分批发酵过程中的进料速率等于用于维持预定pH的碱混合物添加的速率。

本发明的另一个方面是由特定比例的NaOH和Na2CO3组成的碱混合物可以用于a)维持预定pH&b)获得较高的荚膜多糖产率。只使用Na2CO3可以提供合适的用于生长以及pH控制的培养基，然而Na2CO3的限制条件可以提供应激条件，以形成荚膜多糖和较高的Na2CO3含量的需求。因此，当将NaOH和Na2CO3的混合物用于维持pH时，由于较少的碱消耗量，生长可能较差，但具有较高的特定的多糖生产力以及较高的体积生产力。

按照本发明的方法，当葡萄糖转化成乳酸并且pH开始降低时，可以通过碱混合物添加来维持，同时添加葡萄糖以补充培养基中耗尽的葡萄糖。

在本发明的优选实施方案中，发酵进料组分可以包含至少一种碳源、至少一种氮源、至少一种镁源，所述组分可以在特定的细胞密度下以等于碱混合物添加的进料速率加入到分批发酵中。

本发明的一个实施方案在于，所述碱混合物含有至少两种选自氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钾、碳酸钾和氢氧化钙的碱。此外，选择指定比例的氢氧化钠和碳酸钠来获得较高的CP的体积生产。

氢氧化钠与碳酸钠的指定比例可以为1:1至4:1。

根据本发明，当将NaOH与Na2CO3一起作为混合物用于维持pH时，其进一步增强CP的生产力。当只将Na2CO3用于维持pH时，其提供用于生长的合适培养基。然而，Na2CO3的限制条件提供了形成荚膜多糖的应激条件。当将NaOH和Na2CO3的混合物用于维持pH时，生长较差，但提高了CP生产力。

优选地，本发明提供了一种在补料分批培养中培养链球菌的方法，其中产生了高产率的CP。优选地，来自培养基的cps的产率为900至2000mg/L或更高。因此，与分批培养相比，这种补料分批方法允许以150至350％的体积产率增加来生产CP。在一些情况下，产率至少为使用分批培养产生的量的两倍，更优选是使用分批培养产生的量的4倍。

本发明的另一个实施方案在于所述进料培养基可以包含至少一种碳源、至少一种氮源、至少一种盐和至少一种氨基酸。

优选地，所述碳源是葡萄糖。所述氮源可以选自酵母自溶产物、酵母氮碱、蛋白胨、胰蛋白胨、酪蛋白氨基酸、大豆粉、Hy-Soy、酵母提取物和胰蛋白酶大豆液体培养基。所述盐可以选自硫酸钾、氯化钙、氯化镁、硫酸镁及其混合物。

按照本发明的方法，所述进料培养基可以包含以下成分(gm/l)：100-500范围内的葡萄糖、1-7.5范围内的硫酸镁、40-150范围内的 Hy-soya、5-50范围内的酵母提取物、0.002-0.005范围内的盐酸硫胺素、0.2-0.5范围内的半胱氨酸、0.2-0.5范围内的氯化钙。

此外，所述进料培养基可以包含以下成分(gm/l)：100-500范围内的葡萄糖、5-50范围内的酵母提取物、0.002-0.005范围的盐酸硫胺素、0.2-0.5范围内的半胱氨酸、0.2-0.5范围内的氯化钙。

或者，所述进料培养基可以包含以下成分(gm/l)：100-500范围内的葡萄糖、0.5-7.5范围内的硫酸镁、40-150范围内的Hy-soya和5-50范围内的酵母提取物。

本发明的优选实施方案在于所述进料培养基可以包含以下成分(gm/l)：100-200范围内的葡萄糖、1-3范围内的硫酸镁、50-150范围内的Hy-soya和15-25范围内的酵母提取物。

根据本发明，所述新的补料分批方法可以用于制备选自大肠杆菌(Escherichiacoli)、土拉热弗朗西斯氏菌(Francisella tularensis)、流感嗜血菌(Haemophilusinfluenzae)、克雷伯氏菌(Klebsiella)、粘膜炎莫拉菌(Moraxella catarrhalis)、脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)组A，C，W₁₃₅Y和X、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurim)、副伤寒沙门氏菌(Salmonella paratyphi)、痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)、弗氏志贺氏菌(Shigella flexneri)、索氏志贺氏菌(Shigellasonnei)、霍乱弧菌(Vibrio cholera)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、A组链球菌(Streptococcus)、B组链球菌、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)和肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的荚膜多糖。

实施例

实施例1

用于肺炎链球菌(S.Pneumoniae)血清型1的补料分批研发优化的进料方法的评价

针对供料，评价了不同的进料方法。DO-stat方法不适用于肺炎链球菌发酵。因为肺炎链球菌是一种微嗜气性细菌，在发酵过程中只需要表面通风。在肺炎链球菌在分批模式发酵过程中在发酵罐中部分生长后，溶解氧大约为零。

尝试了五种不同的供料方法用于补料分批发酵。

1.pH stat方法：通过设定pH点来控制pH stat进料，其中当培养物的pH升至高于设定-pH时，将所述碳源加入到培养基中，而当培养物的pH降至低于设定-pH时，停止所述碳进料。

2.恒定速率供料方法：在这种方法中，在1.6l液体培养基培养中，以4.2ml/m给予了11种浓缩的补料，持续4小时。

3.指数供料方法：进料速率从1ml/m开始，并且随着OD提高。对于1单位OD的增量，进料速率提高0.5ml/m。

4.恒定的葡萄糖浓度：在补料分批发酵过程中，尝试将残留的葡萄糖浓度维持在大约0.5g/l。

5.pH依赖性供料方法：在这种方法中，用Na2CO3维持pH。对于培养基中耗尽的葡萄糖，以为了维持pH在培养基中进料Na2CO3的速率添加葡萄糖

将NBS Bioflo 115和Bioengineering AG发酵罐用于所有这些实验。本研究在3 LNBS Bioflo 115发酵罐模式下进行，并且扩大至30LBioengineering AG发酵罐。进一步的扩大可以在450L Bioengineering发酵罐中进行。将200g/l葡萄糖和5g/l MgSO4用作用于所有补料分批发酵的进料培养基。所有补料分批实验的发酵条件相同。在发酵过程中，用20％Na2CO3维持pH。

在补料分批发酵过程中维持以下参数。温度(36.5±0.5)、(pH7.1±0.2)、RPM-100、气流(表面通气)-0.5vvm。

表1：不同供料方法的血清型1的CP产率

供料方法	CP产率(mg/l)
		无进料	210
pH stat方法	170
		恒定速率供料方法	198
指数供料方法	180
		恒定的葡萄糖浓度	160
pH依赖性供料方法	260

实施例2

用于肺炎链球菌血清型1 CP的补料分批发酵的进料培养基优化

将以下的不同培养基用于发酵过程中的供料：

1.葡萄糖-200g/l

2.葡萄糖(200g/l)、MgSO4(2.5g/l)

3.葡萄糖-200g/l、MgSO4-2.5g/l、酵母提取物-25g/l。

4.葡萄糖-100g/l、MgSO4-5g/l、酵母提取物-15g/l、Hy-soya-50g/l

5.葡萄糖-200g/l、MgSO4-2.5g/l、酵母提取物-25g/l、Hy-soya-100g/l

6.葡萄糖-200g/l、MgSO4-2.5g/l、酵母提取物-25g/l、Hy-soya-100g/l、盐酸硫胺素-0.02g/l、Cacl2.2H2O-0.0.02g/l、半胱氨酸-0.2g/l。

7.葡萄糖-100g/l、MgSO4-1g/l、酵母提取物-10g/l、Hy-soya-40g/l、盐酸硫胺素-0.04g/l、Cacl2.2H2O-0.04g/l、半胱氨酸-0.4g/l。

如上所述，维持所有发酵条件。对于所有批次，将pH依赖性供料方法用于补料分批发酵供料。将第4种进料培养基用于进一步的补料分批实验。

表2：针对不同进料培养基组合物的血清型1的CP产率

不同的进料培养基组合物	荚膜多糖产率(mg/l)
		1	265
2	385
		3	460
4	420
		5	400
6	375
		7	352

实施例3

用于维持pH的碱混合物

当与Na2CO3一起用作用于维持pH的混合物时，NaOH进一步增强了CP的生产力。用于维持pH时，Na2CO3只提供用于生长的合适培养基。Na2CO3的限制条件提供了形成CP的应激条件。将NaOH和Na2CO3的混合物用于维持pH时，生长较差，但CP生产力提高了。以1:1、2:1、3:1和4:1的比例使用了8％NaOH和20％Na2CO3。将实施例2中的进料培养基组成3用作用于以下补料分批的进料。

表3：用于肺炎链球菌血清型1的补料分批发酵的pH维持的碱混合物

	CP产率(mg/l)	OD(590nm)X10
			20％Na2CO3	440	154
20％Na2CO3+8％NaOH(1:1)	650	145
			20％Na2CO3+8％NaOH(2:1)	590	148
20％Na2CO3+8％NaOH(3:1)	430	145
			20％Na2CO3+8％NaOH(1:2)	705	125
20％Na2CO3+8％NaOH(1:3)	900	105

实施例4

用优化的补料分批条件试验肺炎链球菌的不同血清型

将用于血清型1的补料分批条件也用于其他血清型。考虑以下条件来运行补料分批发酵。

1.pH依赖性供料方法

2.所用的碱混合物

3.优化的进料培养基

4.其他发酵与上述相似

使用新的优化的补料分批方法的条件，使用了血清型1、5、6A、6B、7F、9V、14、19A、19F和23F。

表4：用于不同血清型的补料分批发酵的CP产率

因此，本发明的补料分批导致CP产率的体积增加150至350％，其中最终的CP产率范围为900至2000mg/l。

本领域技术人员将清楚本发明不限于之前说明性的实施例的详细 内容并且本发明可以具体表现为其他特定形式，而没有脱离其基本属性，并且因此期望本发明的实施方案和实施例在所有方面中都被认为是说明性的，而非限制性的，参照所附权利要求，而非前面的描述，并且因此旨在其中包括权利要求等价含义和范围内的所有变化。

Claims (7)

1.培养用于较高体积生产荚膜多糖(CP)的荚膜细菌的方法，其中所述方法包括：

(a)提供表达该CP的细菌菌株的接种物；

(b)通过在pH7.2下发酵来培养所述菌株，其中进料培养基添加的速率等于用于维持预定pH的碱混合物添加的速率；

(c)在50-150RPM搅拌下在35-38℃下，使用0.1-0.5vvm的空气流速发酵所述培养基；

其中所述细菌生长于补料分批培养物中，其中所述进料培养基包含至少一种碳源、至少一种氮源、至少一种镁源；

其中所述碳源是100-200gm/l范围内的葡萄糖；

其中与分批或连续培养条件相比，通过补料分批培养的CP产率的体积增加在150至400％之间；

其中通过补料分批的CP产率在900mg/l和2000mg/l之间；

其中所述碱混合物包含体积比为3:1的氢氧化钠和碳酸钠；

其中氢氧化钠的浓度为8％w/v；

其中碳酸钠的浓度为20％w/v；

其中所述细菌为肺炎链球菌。

2.根据权利要求1的方法，其中所述进料培养基可以包含至少一种碳源、至少一种氮源、至少一种镁源和至少一种氨基酸。

3.根据权利要求2的方法，其中所述氮源由以下的三种或更少组成：酵母自溶产物、酵母氮碱、蛋白胨、胰蛋白胨、酪蛋白氨基酸、大豆粉、Hy-Soy、酵母提取物和胰蛋白酶大豆液体培养基。

4.根据权利要求2的方法，其中所述镁源可以选自氯化镁、硫酸镁及其混合物。

5.根据权利要求1或2的方法，其中所述进料培养基可以包含以下成分：100-200gm/l范围内的葡萄糖、1-7.5gm/l范围内的硫酸镁、40-150gm/l范围内的Hy-soy、5-50gm/l范围内的酵母提取物、0.002-0.005gm/l范围内的盐酸硫胺素、0.2-0.5gm/l范围内的半胱氨酸、0.2-0.5gm/l范围内的氯化钙。

6.根据权利要求1或2的方法，其中所述进料培养基可以包含以下成分：100-200gm/l范围内的葡萄糖、5-50gm/l范围内的酵母提取物、0.002-0.005gm/l范围内的盐酸硫胺素、0.2-0.5gm/l范围内的半胱氨酸、0.2-0.5gm/l范围内的氯化钙。

7.根据权利要求1或2的方法，其中所述进料培养基可以包含以下成分：100-200gm/l范围内的葡萄糖、1-3gm/l范围内的硫酸镁、50-150gm/l范围内的Hy-soy和15-25gm/l范围内的酵母提取物。