BR112014014656B1 - Método de cultivo de bactérias para produção volumétrica superior de polioses capsulares em comparação com a fermentação em batelada - Google Patents

Abstract

resumo “processo inovador de cultivo de bactéria para aprimoramento de produtividade de polioses capsulares” a invenção refere-se à otimização de condições de cultura que utiliza diferentes soluções de alimentação e estratégias de alimentação para aprimorar a produção de polioses capsulares (cp). 1 / 1

Description

“MÉTODO DE CULTIVO DE BACTÉRIAS PARA PRODUÇÃO VOLUMÉTRICA SUPERIOR DE POLIOSES CAPSULARES EM COMPARAÇÃO COM A FERMENTAÇÃO EM BATELADA” Breve Descrição [0001 ] As polioses capsulares são imunógenos importantes encontrados na superfície de bactérias envolvidas em várias doenças bacterianas. Essa característica levou as mesmas a serem um componente importante no projeto de vacinas. As mesmas comprovaram sua utilidade em obter respostas imunológicas especialmente quando ligadas a proteínas carreadoras.

[0002] Tipicamente, as polioses capsulares são produzidas com o uso de cultura em batelada em meio complexo [Refer Shen et al. 2001 Vaccine 19: 850 a 61; Palazzi et al. 2004 J. Infect. Dis. 190:558 a 64; Merritt et al. 2000 J. Biotech. 81:189 a 97; Dassy & Fournier 1996 Infect. Immunol. 64:2.408 a 14; Suarez et al. (2001) Appl. Env. Microbiol. 67:969 a 71; Wicken et al. (1983) J. Bact. 153:84 a 92]. O controle estatístico de DO tradicional de alimentação de nutriente é simplesmente baseado no conceito de elevações/picos de DO (devido a uma redução de substrato de carbono ou cessação de consumo de oxigênio ou respiração) mediante limitação ou depleção de nutriente. O controle estatístico de DO tenta manter a cultura em um nível de DO constante dentro de um limite (o ponto de ajuste de DO) através do aumento da taxa de alimentação de nutriente quando DO se eleva acima do ponto de ajuste e da redução da taxa de alimentação de nutriente quando DO cai abaixo do ponto de ajuste. A estratégia de estatística de DO tipicamente funciona bem em meios definidos onde a depleção de nutriente resulta em elevação de DO rápida. Entretanto, o método de estatística de DO, muitas vezes, falha em meios suplementados com nutrientes complexos ricos tais como extrato de levedura, triptona, peptona, casaminoácido ou Hy-Soy. Os nutrientes complexos ricos têm a capacidade de suportar a respiração e a manutenção celular através de catabolismo de aminoácido de tal modo que o nível de DO permaneça baixo (isto é, sem picos de DO evidentes) mesmo sob limitação ou depleção de fonte de carbono.

[0003] Quando um meio complexo é usado para desenvolvimento de cultura, uma estratégia de estatística de pH pode ser mais adequada que a estatística de DO uma vez que a pH de cultura tende a aumenta logo que a fonte de carbono é esgotada. De uma maneira similar ao controle estatístico de DO, o método de estatística de pH mantém um pH da cultura constante a cerca do ponto de ajuste através do aumento da taxa de alimentação de nutriente conforme o pH se eleva acima do ponto de ajuste e da redução da taxa de alimentação de nutriente quando pH cai abaixo do ponto de ajuste. Entretanto, uma vez que a alteração em pH de cultura mediante a depleção de nutriente é menos responsiva a de DO, o controle de alimentação por estatística de pH pode ser relativamente letárgico quando comparado com a estatística de DO.

[0004] A maioria dos estudos usou sistemas de cultura em batelada nos quais a taxa de desenvolvimento, os níveis de nutriente e as concentrações metabólicas se alteram durante a cultivação. Em tais sistemas, a alteração de um fator resulta em alterações em outros fatores associados ao desenvolvimento que pode afetar as produtividades de maneira não prevista. As culturas contínuas permitem que o pesquisador separe e defina parâmetros que são interdependentes durante a cultura em desenvolvimento por batelada, tais como a taxa de desenvolvimento, concentrações de nutriente e produto e densidade celular. Durante a cultura contínua, o meio fresco é adicionado a uma cultura em uma taxa fixa e as células e o meio são removidos a uma taxa que mantém um volume de cultura constante.

[0005] Em cultura por perfusão, o meio fresco é adicionado a uma cultura em uma taxa fixa e o meio gasto livre de célula é removido a uma taxa que mantém um volume de cultura constante. Entretanto, a cultura contínua e por perfusão é propensa a problemas de estabilidade de cepa e contaminação e é um tanto quanto dispendiosa devido à alimentação contínua de meio e nutrientes. Portanto, há uma necessidade de encontrar alternativas para a cultura contínua para a produção de alta produtividade de polissacarídeos capsulares a fim de superar os problemas com cultura contínua que são mencionados acima.

[0006] Uma abordagem para superar as desvantagens de cultura contínua é exemplificada no documento WO 2007/052168. Um processo de fermentação de batelada alimentada complexo foi desenvolvido para manter um ambiente nutricional e uma taxa de desenvolvimento favoráveis à produção de cps. Esse processo combina as vantagens de técnicas de batelada e contínuas, que produzem densidades celulares altas devido à extensão da fase de desenvolvimento exponencial e a condições que controlam a adição de substrato durante a fermentação. Entretanto, a técnica de batelada alimentada complexa usa software com um algoritmo complexo para gerenciar a fermentação.

[0007] Uma outra abordagem é revelada no documento WO 20100272755. Um método para cultivar a bactéria foi desenvolvido, em que a cultivação compreende as adições instantâneas de extrato de levedura, seguida por uma adição linear de uma glicose. Cada adição é iniciada em um nível de OD designado. Dessa forma, a adição linear de uma fonte de carbono sem um algoritmo é um aprimoramento em comparação com a fermentação de batelada alimentada complexa anterior. Entretanto, esse é um método muito tedioso que requer medição contínua de O.D. Além disso, o mesmo falha na consideração dos requisitos de alteração constantes (microambiente) de organismo.

[0008] A presente invenção tem como base um achado surpreendente e se refere a um método de alimentação inovador, em que a taxa de adição de meio de alimentação durante a fermentação de batelada alimentada é equivalente à taxa de adição de mistura de álcali para manter um pH pré-definido que resulta em um aumento volumétrico em produtividade de CP em comparação com os métodos de fermentação por batelada existentes.

Sumário da Invenção [0009] A presente invenção fornece uma estratégia de fermentação de batelada alimentada que resulta em 3 a 5 vezes de aumento em produtividade de polioses capsulares em comparação com a fermentação de modo batelada.

[0010] Particularmente, o presente método se refere a um método de cultivo de bactérias encapsuladas para a produção volumétrica superior de polioses capsulares (CP), em que o dito método compreende (a) fornecer um inóculo de uma cepa de bactéria que expressa a CP; (b) cultivar a cepa por fermentação com pH 7,2, em que a taxa de adição de meio de alimentação é equivalente à taxa de adição de mistura de álcali para manter um pH pré-definido; c) fermentar o meio de cultura entre 35 e 38 °C mediante agitação em 50 a 150 RPM com uma taxa de fluxo de ar de 0,1 a 0,5vvm.

Breve Descrição de Desenhos [0011] Figura 1: polissacarídeo pneumocócico serotipo 1 (fermentação de batelada alimentada) para métodos de alimentação diferentes.

[0012] Figura 2: produtividade de polissacarídeo Pneumocócico serotipo 1 (batelada alimentada) para diferentes razões de bases em mistura álcali para manter pH.

[0013] Figura 3: produtividade de polissacarídeo pneumocócico serotipo 1, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 19A, 19F e 23F de batelada alimentada em comparação com fermentação por batelada.

Descrição Detalhada da Invenção [0014] A revelação fornece um processo de cultivo de bactéria, em que a taxa de adição de alimentação durante a fermentação de batelada alimentada é equivalente à taxa de adição de mistura de álcali para manter um pH pré-definido.

[0015] Um outro aspecto da presente invenção é que a mistura álcali que consiste em NaOH e Na2CO3 em uma razão específica pode ser usada para a) manter pH pré-definido & b) obter produtividade de poliose capsular superior. O uso de apenas Na2CO3 pode fornecer meio adequado para desenvolvimento bem como controle de pH, entretanto, a condição limitante de Na2CO3 pode fornecer uma condição de estresse para produzir polioses capsulares e requisito superior de quantidade de Na2CO3. Por conseguinte, quando a mistura de NaOH e Na2CO3 é usada para manter o pH, o desenvolvimento pode ser menor com produtividade de poliose específica superior bem como com produtividade volumétrica superior devido a menos quantidade de consumo de álcali.

[0016] Como o presente processo, quando a glicose é convertida em ácido lático e o pH começa a diminuir, o mesmo pode ser mantido pela mistura de adição de álcali com adição de glicose simultânea para suplementar a glicose esgotada nos meios.

[0017] Em uma modalidade preferencial da presente invenção, os componentes de alimentação de fermentação podem compreender um dentre pelo menos uma fonte de carbono, pelo menos uma fonte de nitrogênio, pelo menos uma fonte de magnésio que pode ser alimentada na fermentação por batelada em uma densidade celular particular a uma taxa de alimentação equivalente à taxa de adição de mistura de álcali.

[0018] Uma modalidade da presente invenção é que a dita mistura álcali contém pelo menos dias bases selecionadas a partir do grupo que consiste em hidróxido de sódio, carbonato de sódio, bicarbonato de sódio, hidróxido de potássio, carbonato de potássio e hidróxido de cálcio. Ademais, uma razão designada de hidróxido de sódio e de carbonato de sódio é selecionada para alcançar uma produção volumétrica superior de CP.

[0019] A razão designada de hidróxido de sódio para carbonato de sódio pode ser entre 1:1 e 4:1. De acordo com a presente invenção, NaOH intensifica adicionalmente a produtividade de CP quando é usado com Na2CO3 como mistura para manter o pH. Apenas Na2CO3 fornece meio adequado para desenvolvimento quando é usado para manter o pH. Entretanto, a condição limitante de Na2CO3 fornece uma condição de estresse para produzir polioses capsulares. Quando a mistura de NaOH e Na2CO3 é usada para manter o pH, o desenvolvimento é menor, mas a produtividade de CP aumenta.

[0020] De preferência, a invenção fornece um método de cultura de Streptococcus em cultura de batelada alimentada, em que uma produtividade de CP alta é produzida. De preferência, a produtividade de cps do meio de cultura é entre 900 e 2.000 mg/l ou mais. Dessa forma, esse método de batelada alimentada permite a produção de CP em um aumento de produtividade volumétrica entre 150 e 350% em comparação com a cultura em batelada. Em alguns casos, a produtividade pode ser pelo menos duas vezes a quantidade produzida com o uso de cultura em batelada, com mais preferência 4 vezes a quantidade produzida com o uso de cultura em batelada.

[0021] Uma outra modalidade da presente invenção é que o dito meio de alimentação pode compreender pelo menos uma fonte de carbono, pelo menos uma fonte de nitrogênio, pelo menos um sal e pelo menos um aminoácido.

[0022] De preferência, a dita fonte de carbono é glicose. A fonte de nitrogênio pode ser selecionada a partir de autolisados de levedura, base de nitrogênio de levedura, peptonas, triptona, casaminoácidos, farinha de fava de soja, Hy-Soy, extrato de levedura e caldo de soja tríptico. O sal pode ser selecionado a partir de sulfato de potássio, cloreto de cálcio, cloreto de magnésio, sulfato de magnésio e misturas dos mesmos.

[0023] Como na presente invenção, o meio de alimentação pode compreender ingredientes (gm/l), glicose dentro de uma faixa de 100 a 500, sulfato de magnésio dentro de uma faixa de 1 a 7,5, Hy-Soy dentro de uma faixa de 40 a 150, extrato de levedura dentro de uma faixa de 5 a 50, tiamina clorídrica dentro de uma faixa de 0,002 a 0,005, cisteína dentro de uma faixa de 0,2 a 0,5, cloreto de cálcio dentro de uma faixa de 0,2 a 0,5.

[0024] Ademais, o meio de alimentação pode compreender ingredientes (gm/l), glicose dentro de uma faixa de 100 a 500, extrato de levedura dentro de uma faixa de 5 a 50, tiamina clorídrica dentro de uma faixa de 0,002 a 0,005, cisteína dentro de uma faixa de 0,2 a 0,5, cloreto de cálcio dentro de uma faixa de 0,2 a 0,5.

[0025] Alternativamente, o dito meio de alimentação pode compreender ingredientes (gm/l), glicose dentro de uma faixa de 100 a 500, sulfato de magnésio dentro de uma faixa de 0,5 a 7,5, Hy-Soy dentro de uma faixa de 40 a 150 e extrato de levedura dentro de uma faixa de 5 a 50.

[0026] Uma modalidade preferencial da presente invenção é que o meio de alimentação pode compreender ingredientes (gm/l), glicose dentro de uma faixa de 100 a 200, sulfato de magnésio dentro de uma faixa de 1 a 3, Hy-Soy dentro de uma faixa de 50 a 150 e extrato de levedura dentro de uma faixa de 15 a 25 [0027] De acordo com a presente invenção, o dito processo de batelada alimentada inovador pode ser utilizado para preparar polioses capsulares selecionadas a partir do grupo que consiste em Escherichia coli, Francisella tularensis, Haemophilus influenzae, Klebsiella, Moraxella catarrhalis, Neisseria meningitidis, grupos A,C, Wi35 Y e X, Porphyromonas gingivalis, Pseudomonas aeruginosa, Burkholderia cepacia, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Salmonella paratyphi, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Vibrio cholera, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Streptococcus Grupo A, Streptococcus Grupo B, Mycobacterium tuberculosis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis e Streptococcus pneumoniae.

EXEMPLOS

[0028] Exemplo 1 - Avaliação de Método de Alimentação para Otimização de Desenvolvimento Alimentado por Batelada para S. Pneumoniae Serotipo 1: [0029] Diferentes métodos de alimentação foram avaliados em relação à alimentação. O método de estatística de DO não foi aplicável para fermentação de S. Pneumoniae. Como a S. Pneumoniae é uma bactéria microaerofílica, apenas a aeração de superfície foi requerida durante o processo de fermentação. Após o desenvolvimento parcial de S. Pneumoniae no fermentador durante a fermentação de modo batelada, o oxigênio dissolvido foi em tomo de zero.

[0030] Cinco métodos de alimentação diferentes foram tentados para fermentação de batelada alimentada.

[0031] 1. Método de estatística de pH: a alimentação estatística de pH foi controlada por um ponto de pH definido em que, quando o pH da cultura se eleva acima do pH definido, a fonte de carbono foi adicionada ao meio e quando o pH da cultura cai abaixo do pH definido, a alimentação de carbono é interrompida.

[0032] 2. Método de alimentação de taxa constante: nesse método, a alimentação concentrada foi dada a 4,2ml/m por 4 h em 1,6 I de cultura de caldo.

[0033] 3. Método de alimentação exponencial: a taxa de alimentação foi iniciada com 1 ml/m e aumentou com OD. A taxa de alimentação foi aumentada em 0,5 ml/m para aumento de 1 unidade em OD.

[0034] 4. Concentração de glicose constante: tentou-se manter a concentração de glicose residual em tomo de 0,5 g/l durante a fermentação de batelada alimentada.

[0035] 5. Método de alimentação dependente de pH: nesse método, o pH foi mantido com Na2CO3. A glicose foi adicionada à glicose esgotada nos meios na taxa que Na2CO3 foi alimentados nos meios para manter o pH.

[0036] O fermentador NBS Bioflo 115 e Bioengineering AG foi usado para todos esses experimentos. O presente estudo foi executado no modelo de fermentador NBS Bioflo 115 de 3 I e foi aumentado para o fermentador Bioengineering AG de 30 I. O aumento adicional pode ser executado no fermentador Bioengineering de 450 I. Os 200 g/l de glicose e os 5 g/l de MgSO4 foram usados como meios de alimentação para toda fermentação de batelada alimentada. A condição de fermentação foi igual para todos os experimentos de batelada alimentada. O pH foi mantido com solução de Na2CO3 a 20% durante o processo de fermentação.

[0037] Os seguintes parâmetros foram mantidos durante a fermentação de batelada alimentada. Temperatura (36,5 + 0,5), pH (7,1 + 0,2), RPM-100, Fluxo de ar (aeração de superfície) -0,5 vvm.

Tabela 1: Produtividade de CP de Serotipo 1 para Diferentes Métodos de A imentação [0038] Exemplo 2 - Otimização de Meios para Fermentação de Batelada Alimentada de CP de Pneumoniae Serotipo 1 [0039] Os seguintes meios diferentes foram usados para a alimentação durante a fermentação: [0040] 1. Glicose - 200g/l [0041 ] 2. Glicose - (200g/l), MgSO4 (2,5 g/l) [0042] 3. Glicose - 200 g/l, MgSO4 - 2,5 g/l, Extrato de levedura - 25g/l.

[0043] 4. Glicose - 100 g/l, MgSO4 - 5 g/l, Extrato de levedura - 15 g/l, Hy-Soy - 50 g/l [0044] 5. Glicose - 200g/l, MgSO4 - 2,5 g/l, Extrato de levedura - 25 g/l, Hy-Soy -100 g/l [0045] 6. Glicose - 200g/l, MgSO4 - 2,5g/l, Extrato de levedura - 25 g/l, Hy-Soy-100 g/l, Tiamina clorídrica - 0,02 g/l, CaCI2.2H2O - 0.0,02 g/l, Cisteína - 0,2 g/l.

[0046] 7. Glicose - 100 g/l, MgSO4 - 1 g/l, Extrato de levedura - 10 g/l, Hy-Soy - 40g/l, Tiamina clorídrica - 0,04 g/l, Cacl2.2H2O - 0,04 g/l, Cisteína - 0,4 g/l [0047] Todas as condições de fermentação foram mantidas conforme mencionado acima. O método de alimentação dependente de pH foi usado para a alimentação de fermentação de batelada alimentada para todas as bateladas. O quarto meio de alimentação foi utilizado para experimentos alimentados por batelada adicionais.

Tabela 2: Produtividade de CP de Serotipo 1 para Diferentes Composições de Meios de Alimentação [0048] Exemplo 3 - Mistura de Álcali Usada para Manter o pH

[0049] O NaOH intensifica adicionalmente a produtividade de CP quando usado com Na2CO3 como mistura para manter o pH. Apenas Na2CO3 fornece meio para desenvolvimento adequado quando usado para manter o pH. A condição limitante de Na2CO3 fornece uma condição de estresse para produzir CP. Quando a mistura de NaOH e Na2CO3 foi usada para manter pH, o desenvolvimento foi menor, mas a produtividade de CP foi aumentada. NaOH a 8% e Na2CO3 a 20% foram usados na razão de 1:1,2:1, 3:1 e 4:1. A composição dos meios de alimentação 3 no Exemplo 2 foi usada como alimentação para as seguintes alimentações por batelada.

Tabela 3: Mistura de Álcali Usado para Manter o pH para Fermentação de Batelada Alimentada de S. Pneumoniae Serotipo 1 [0050] Exemplo 4 - Diferentes Serotipo de S. Pneumoniae Tentados com Condição de Batelada Alimentada Otimizada.

[0051] Para o serotipo 1, as condições de batelada alimentada foram usadas para outro serotipo. As seguintes condições foram levadas em consideração na execução da fermentação de batelada alimentada.

[0052] 1. Método de Alimentação Dependente de pH

[0053] 2. Mistura de Álcali Usado [0054] 3. Meios de Alimentação Otimizados [0055] 4. Outras fermentações foram similares conforme mencionado acima [0056] Os serotipos 1, 5, 6A, 6B, IF, 9V, 14, 19A, 19F e 23F foram usados com o uso de novas condições otimizadas de processo de batelada alimentada.

Tabela 4: Produtividade de CP em Fermentação de Batelada Alimentada para Diferentes Serotipos__________________________________________________________ [0057] Dessa forma, o método alimentado por batelada da presente invenção resulta no aumento volumétrico em produtividade de CP na faixa de 150 a 350%, em que a produtividade final de CP se situa na faixa entre 900 e 2.000 mg/l.

[0058] Será evidente para aqueles elementos versados na técnica que a invenção não é limitada aos detalhes dos exemplos ilustrativos anteriores e que a presente invenção pode ser incorporada em outras formas específicas sem que se afaste dos atributos oficiais da mesma e, portanto, é desejado que as presentes modalidades e os exemplos sejam considerados em todos os aspectos como ilustrativos e não restritivos, deve ser feita referência às reivindicações anexas, em vez da descrição anterior, e todas as alterações que se enquadram no significa e na faixa de equivalência das reivindicações são, portanto, destinadas a ser abrangidas pelo presente documento.

REIVINDICAÇÕES

Claims (15)

1. Método de cultivo de bactérias encapsuladas para produção volumétrica superior de polioses capsulares (CP) em comparação com a fermentação em batelada, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito método compreende (a) fornecer um inóculo de uma cepa de bactéria que expressa a CP; (b) cultivar a cepa por fermentação a pH 7,2, em que a taxa de adição de meio de alimentação é equivalente à taxa de adição de mistura de álcali para manter um pH pré-definido, em que a dita mistura de álcali contém carbonato de sódio; (c) fermentar o meio de cultura de 35 a 38 °C mediante agitação de 50 a 150 RPM com uma taxa de fluxo de ar de 0,1 a 0,5 vvm, em que as bactérias são cultivadas em cultura de batelada alimentada.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o aumento volumétrico em produtividade de CP por cultura de batelada alimentada está entre 150 e 400% em comparação com condições de cultura contínua ou de batelada.

3. Método, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que a produtividade de CP por batelada alimentada está entre 900 mg/L e 2000 mg/L.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o meio de alimentação pode compreender pelo menos uma fonte de carbono, pelo menos uma fonte de nitrogênio, pelo menos um sal e pelo menos um aminoácido.

5. Método, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita fonte de carbono é glicose.

6. Método, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita fonte de nitrogênio consiste em três ou menos dentre a seguinte lista: autolisados de levedura, base de nitrogênio de levedura, peptonas, triptona, casaminoácidos, farinha de fava de soja, Hy-Soy, extrato de levedura e caldo de soja tríptico.

7. Método, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito sal pode ser selecionado a partir de sulfato de potássio, cloreto de cálcio, cloreto de magnésio, sulfato de magnésio e misturas dos mesmos.

8. Método, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que o meio de alimentação pode compreender ingredientes (gm/L), glicose dentro de uma faixa de 100 a 500, sulfato de magnésio dentro de uma faixa de 1 a 7,5, Hy-Soy dentro de uma faixa de 40 a 150, extrato de levedura dentro de uma faixa de 5 a 50, tiamina clorídrica dentro de uma faixa de 0,002 a 0,005, cisteína dentro de uma faixa de 0,2 a 0,5, cloreto de cálcio dentro de uma faixa de 0,2 a 0,5.

9. Método, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que o meio de alimentação pode compreender ingredientes (gm/L), glicose dentro de uma faixa de 100 a 500, extrato de levedura dentro de uma faixa de 5 a 50, tiamina clorídrica dentro de uma faixa de 0,002 a 0,005, cisteína dentro de uma faixa de 0,2 a 0,5, cloreto de cálcio dentro de uma faixa de 0,2 a 0,5.

10 . Método, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que o meio de alimentação pode compreender ingredientes (gm/L), glicose dentro de uma faixa de 100 a 200, sulfato de magnésio dentro de uma faixa de 1 a 3, Hy-Soy dentro de uma faixa de 50 a 150 e extrato de levedura dentro de uma faixa de 15 a 25.

11 . Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita mistura álcali, em adição ao carbonato de sódio, contém pelo menos uma base selecionada a partir do grupo que consiste em hidróxido de sódio, bicarbonato de sódio, hidróxido de potássio, carbonato de potássio e hidróxido de cálcio.

12 . Método, de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADO pelo fato de que uma razão designada de hidróxido de sódio e carbonato de sódio é selecionada para alcançar uma produção volumétrica superior de CP.

13 . Método, de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADO pelo fato de que a concentração de hidróxido de sódio é entre 1,5 e 3,0 M.

14 . Método, de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADO pelo fato de que a concentração de carbonato de sódio é entre 10 e 20% (p/v).

15 . Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita bactéria é selecionada a partir de Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Staphylococcus aureus, Haemophilus influenzae, Streptococcus Grupo A e Streptococcus Grupo B.