JPS62501330A - シュ−ドモナス・アエルギノサ細菌株を溶液中で増殖させる方法 - Google Patents

シュ−ドモナス・アエルギノサ細菌株を溶液中で増殖させる方法

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JPS62501330A JP61500682A JP50068286A JPS62501330A JP S62501330 A JPS62501330 A JP S62501330A JP 61500682 A JP61500682 A JP 61500682A JP 50068286 A JP50068286 A JP 50068286A JP S62501330 A JPS62501330 A JP S62501330A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 シュードモナス・アエルギノサ細菌 株を溶液中で増殖させる方法 本発明は分類学上、シュードモナダシアエ(Pseudomonadaceae  )族に属するシュードモナス・アエルギノサ(Pseudomonas ae ruginosa )細菌株を溶液中で増殖させる方法に関するものである。
シュードモナス・アエルギノサ細菌は、主に免疫防衛、能が低下しでいる患者( 例えば、火傷を負っている患者、のう飽性線維症の患者、または欠損性器官機能 患者、および癌患者)においで院内感染を引き起こすことの多い、条件的病原菌 である。耐性が生じるために、緑膿菌感染に対し、抗生物質は限られた範囲でし か活性を持たないので、シュードモナス・アエルギノサに起因する感染症に対し では、免疫学的方法を用いて対抗する試みがなされできた。
感染は〇一群抗原およびH一群抗原を生成する種々の菌株によって、ひき起こさ れる。間接的免疫螢光法を用いたアンソルグ(Ansorg ) (ZBj、B aKt、 Hyg。
1、Abt 、Orig、A 242.228−238(1978))によるH −抗原のパターンによると、シュードモナス・アエルギノサに関しでは、部分抗 原(aob ai、a2 、 a 4)を有する、複合的なべん毛の抗原でる。
部分因子であるa。−a4 は、独立した抗原決定基であり、それ故、いくつか のI−(−型を有するべん毛抗原のパターンが生じる。〇一群とH−型とは自由 に組み合せをつくる。(改行)緑膿菌感染に対する予防用ワクチンの製造法は既 知であり、シュードモナス・アエルギノサを表面培養、または混合栄養培地溶液 中で液中培養することにより増殖させで得た該細菌の細菌塊(集団)および/ま たは、培養沖過物を出発原料としで使用する。これらの混合栄養培地に関しては 、炭素およびエネルギー源(主に炭水化物)および必須栄養塩類の他に、種々の 抽出物および/または、動物性たんばく質、微生物たんばく質、または植物性た ん白質の氷解物(いわゆるペプトン)を用いた。このような栄養溶液補充物の組 成は厳密に定めでおらず、ロフトごとに変えることができる。栄養溶液補充物は 。
アミノ酸の他に不完全に分解したたん白質フラグメントおよびその不確定な混合 物をも含み、実質上、アミノ酸と成長促進物質に対する需要を償うことができる 。
それ故、培養上清は常に、非微生物起源の物質に豊んでいるが、このことは、培 養段階の後、免疫原性を有するべん毛抗原から栄養培地に由来する不純物をでき る限り除くことを目的とするいくつかの分離工程を常に必要とするので、シュー ドモナス・アエルギノサのべん毛(11)抗原の調製にとっては不利である。
さらに、従来、用いられでいたロフトまたはバッチ内で増殖させる方法は、細菌 が、その接種時から、培養物からの分離に至る間、連続的な生理学的変化の条件 下におかれることとなるのでこれもまた、不利である。この細菌生物量の生理学 的変異、すなわち0機能上の変異の引き金となるのは、細胞増殖そのもの、およ び、細菌の増殖による栄養培地の組成の一時的な変化である。この突発的な生理 学的変化の明らかな結果としで、バッチ培養の増殖曲線には、常に数種類の相が 認められる。1方の細胞塊の生理学的活性と他方の細胞集団周囲の環境との間に 前記の直接的な関係が存在する結果、それと関連しで、成長期および分化期に応 じで好ましい量の細胞内外の種々の代謝産物が豊富に得られる。それ故、バッチ 培養の培養上清は、一時的に個々の分化期においで生成されたすべでの代謝産物 を統合した混合物を含むことになる。
本発明は、これらの困難さ、および不都合さを避けることを目的とし、従来より も高収率で、培養の全期間中、生理学的状態が一定である、抗原回収用の細菌生 物量を得るために、シュードモナス・アエルギノサ株を液中で増殖させる方法で あって1人工栄養媒質中に、加圧滅菌による余分な不純物の生じないものを使用 すると共に、べん毛抗原のための細菌生物量の化学的後処理をより容易ならしめ る方法を提供することを目的とするものである。
本発明の目的は、以下に示すH型抗原生産株を、抗原を含まず、たん白質を含ま ず、窒素源を含み、炭素源としてのコハク酸塩または尿素を含むと共に、無機塩 類を含んでいる水性栄養培地中で培養することにより達成される。
言及した炭素源は特に成長を促進することが証明されでいる。
菌株 H−型 1170001− b M −2−b 25940 − ao、a2 35939 − ao、a3 45933 − aOl ”1 * ”21210 ”−”o+ al + ” 216990 a o 、 a□、a□ 5170018 ao、 a3. a4170001.5940.5939.5 933 および170018株に対しでは、アンソルグ(Ansorg)による 分類を用いる。M−2,1210および16990株のH−血清型における位置 付けは、型による分類でなく、分子量の比較検査および、モンテイら(Mont ieet al )による血清学的交差反応に基づいで行なう。
株は連続培養するのが好ましい。
さらに好ましい操作方法では、株をタービドスタティック(濁度一定)に培養す ることができ、その栄養培地の酸素含量を5〜20%、好ましくは約10%とし 、細胞密度を2−3 X 109 細胞/dに保ち、基質、希釈率を、新しい栄 養培地を補うことにより、0.1μ〜0.3μに維持することができる。
本発明に係るシュードモナス・アエルギノサ細菌株の培養は、攪拌下、「開放型 培養」で、通気下、増殖を最大にし、べん毛を生成させるような方法で行う。
栄養基質は、培養物の成育速度または、培養物が到達した平衡状態に応じて供給 する。新しい栄養培地の供給の調節または制御は、培養物の成長に比例した/f ラメーター、好ましくは細胞密度の一時的な変化に応じで行なう。しかし、また 、培養物の成長に比例する他のパラメーター(例えば、呼吸活性、CO2産生、 水素イオン濃度の変化、炭素源濃度の変化、呼吸指数、窒素消費量、酸素消費量 、および熱状態(heat tone))を用いてもよい。また、新しい栄養培 地の供給は、生成された“抗原量に応じで行なってもよい。
本発明に係る連続生育(増殖)法においでは、新しく栄養培地を供給するのと同 時に、培養溶液を成育容器から引き出すので、成長と生理学的活性との間、特に 、一方では細胞の形成、他方では細胞の周囲の環境との間に、正確に定義でき、 いつでも再生しうる流動平衡状態が調節され、これは、実際上、無制限期間、維 持され得る。
栄養培地としては、たん白質を含まない人工培地を用い、それは、物理化学的お よび化学的に、定性および定量的に決定しつる成分のみをもっばら含んでいる。
すべての必須要素を含む無機栄養溶液が適しでいる。
細菌の発酵的生産のための本発明に係る好ましい方法においては、培養物の希釈 率(μ)、従って、培養物の生理学的活性を、成長パラメーターに応じて、好ま しくは瞬時の培養物の細胞濃度に応じで、外部から調節する連続培養のタービド スタット(濁度一定)の原理を適用できると同様に、培養物の生理学的活性を、 基質、特にエネルギー源としての炭素を制限することにより調節する連続培養の ケモスタット(化学的一定)原理をも適応できる。
タービドスタット連続培養を用いるのが好ましい。
細菌の増殖を最大にするためには、温度およびpH値も、また重要である。すな わち、成育中においでは、温度は20〜35℃、好ましくは30℃、そして、p H値は6.6〜7.5、好ましくは7.0に維持するのが適切である。
詳細には、タービドスタットの操作方法を用いる本発明方法では、発酵槽内で、 最初、栄養培地に細菌株を接種し、対数的最終相において前記の細胞濃度(2− 3X 10’ 細胞/fnl)に達するまで、前記の条件を維持しで続行する。
この状態に達すると、すぐに、細菌懸濁液を発酵槽から連続的に引き出し、連続 的に新しい栄養培地溶液で置換する。その希釈率は0.3μ以上でない方がよく 、0.1〜0.2μであることが好ましい0 後、湿細胞(1,5〜2.Og//)、が得られるが、これは、遠心分離する前 においで、チンダル(Tynda I 1 )の方法による5 901mにおけ る懸濁液の濁度、0.5〜0.7に相当する。
本発明に係る方法を、以下に実施例を挙げてさらに詳しく説明する。
実施例: 以下に示す組成の栄養溶液を用いた。
コハク酸2ナトリウム 4.05 g/l。
リン酸1水棗殉リウム 7 g/!。
リン酸2水素カリウム 3 g/l、 リン酸水素アンモニウム 1 g/l。
硫酸マグネシウム・7HOO,05g/l。
塩化第2鉄 0.0025 g/i。
pHを7,0に調節し、温度を30℃にした。その栄養溶液にシュードモナス・ アエルギノサM−2株を接種し、発酵槽(151)内に入れた。発酵期間(96 時間)の間、栄養培地(1401)を通し、空気の流速は10%PO2(酸素分 圧)に達した。希釈率は0゜1μであった。流れが平衡状態に達した後の細胞密 度は2−3 X 109細胞/mtとなった。
同じ条件下において、170001株および1210株を培養した。培養条件、 すなわち、希釈率、酸素分圧(%)および、遠心分離(15,OOOXg)を2 回行なった後の湿重量で表わした細胞収量(g//)を以下の表中に示す。さら に、遠心分離を行なう前の懸濁液の濁度を示す。
国際調査報告 ANNEX To T?j INTERNAτ1ONAf、5EARCHREP ORT 0NGB−A−120163812108/70 None

Claims (4)

    【特許請求の範囲】
  1. 1.分類学上、シュードモナダシァエ族に属するシユードモナス・アエルギノサ 細菌株を液中で培養する方法であって、以下のH−型抗原産生株:▲数式、化学 式、表等があります▼ を、抗原を含まず、たん白質を含まず、炭素源として、コハク酸塩または尿素を 含むと共に、窒素源および無機塩類を含んでいる水性栄養培地中で増殖させるこ とを特徴とする方法。
  2. 2.培養を連続的方法で行なうことを特徴とする第1項に記載の方法。
  3. 3.濁度一定的に増殖させ、栄養培地中の酸素含量を5〜20%、好ましくは約 10%とし、細胞密度を2−3×109細胞/mlに維持し、新らしい栄養培地 を補充して、基質希釈率を0.1μ〜0.3μに維持することを特徴とする第1 項または第2項のいずれかに記載の方法。
  4. 4.増殖期間中、温度を20−35℃、好ましくは30℃に維持し、pHを6. 5〜7.5、好ましくは7.0に維持することを特徴とする第1項に記載の方法 。
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