JP2022550494A - 難培養性嫌気性微生物の高収率培養のための培地サプリメント及びそれを含む培地組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
植物ペプトン、酵母エキス、リン酸水素二カリウムを含む培地組成物であって、炭素源としてフルクトース及びラクトースを含み、サプリメントとしてN-アセチルヘキソサミン、L-アスパラギン酸及びL-システインのアミノ酸混合物及びコバラミンを含むことを特徴とする嫌気性微生物高収率培養用培地組成物に関する。
実施例1:培養培地でムチン代替成分組成の最適化
大豆カゼイン消化液体培地(Tryptic Soy Broth、TSB)をベースにムチンに代わる基質及び成分の最適な組み合わせを探索し、このために表1のようにそれぞれの準備された培地に0.1%v/vの割合でアッカーマンシア・ムシニフィラEB-AMDK19(KCTC 13761BP)菌株を接種した後、37℃、嫌気条件(90%N2、5%CO2、5%H2)で24~48時間培養し、光学密度(OD600)の変化を測定し、その結果を下記表1に示した。
動物由来成分または動物由来酵素が使用されて製造された成分を排除するため、植物ペプトンと酵母エキスに基づいて、本発明の培地サプリメントの嫌気性微生物培養性を試験した。
本実施例では、アッカーマンシア・ムシニフィラ菌株の培養培地にビタミンB群の添加による倍養性の改善の有無を確認した。嫌気性微生物の増殖に影響を及ぼす特定のビタミンを選別するためにビタミンB群に属するすべてのビタミンをそれぞれ個別に、またはB群複合体(B1、B2、B3、B5、B6、B7、B9、B10、B12)に対してテストを行った。
嫌気性微生物の高濃度培養に必要な必須構成成分及び最適の組み合わせを探索するため、アッカーマンシア・ムシニフィラ菌株を様々な成分の組み合わせを有する培地に同一条件で培養した後、その結果を下記表6に示した。
前記表2に記載された培地を用いて、培養菌株の種類を下記表7に記載されたように、異にしたことを除いては、実施例1と同様に行って0.1%v/vの割合でアッカーマンシア・ムシニフィラ菌株を接種した後、37℃、嫌気条件(90%N2、5%CO2、5%H2)で24~48時間培養し、光学密度(OD600)の変化を測定し、その結果を下記表7に示した。
培養菌株の種類を下記表8に記載されたように、異にしたことを除いては、実施例1と同様に行って0.1%v/vの割合でフィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ(Faecalibacterium prausnitzii)、アナエロスティペス・カカエ(Anaerostipes caccae)またはビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum)菌株を接種した後、37℃、嫌気条件(90%N2、5%CO2、5%H2)で24~48時間培養し、光学密度(OD600)の変化を測定し、その結果を下記表8に示した。対照のために培養性が優れていることが知られている対照培地でも培養し、本発明の培地における培養性と比較した。対照培地としてF.Prausnitziiは、脳心臓浸出培地(Brain Heart Infusion、BHI)に5g/L酵母エキス、1g/Lセロビオース及び1g/Lマルトースを補充した培地で同じ条件で培養した。A.caccaeは、TSB培地に5g/L酵母エキスを補充した培地で培養し、B.longumは、BLブロス培地で培養した。
図4に示すような嫌気性発酵システムを用いて、3L-スケールにおいて表2の培地で炭素源の種類を変更した培地を使用して下記表9の条件で培養を行っており、アッカーマンシア・ムシニフィラ菌株の成長曲線(growth curve)及びpHの変化を確認した。また、顕微鏡観察による菌数の変化と形態学的変化を確認して図5に示し、平板計数法(plate count method)を用いて生菌数を測定し、表10に示した。
フルクトースが含まれた本発明の培地で混合ガス(90%N2、5%CO2、5%H2)の代わりに、より経済的で工業化に適した水素を含まないガス{高純度窒素ガス(100%N2)または80%N2と20%CO2から構成された混合ガス}を用いて培養した結果、高純度窒素ガスの場合、既存の培養結果と比較して培養性が著しく劣ることが分かるが、80%N2と20%CO2から構成されたガスでは、培養性において大きな差はなかった(図8及び表10参照)。
Claims (13)
- N-アセチルヘキソサミン、L-アスパラギン酸、L-システイン及びコバラミンを含む、難培養性嫌気性微生物の高収率培養用培地サプリメント。
- 前記培地サプリメントは、N-アセチルヘキソサミン5g/L、L-アスパラギン酸8g/L、L-システイン0.5g/L及びコバラミン0.0001~0.005g/Lを含むことを特徴とする、請求項1に記載の難培養性嫌気性微生物の高収率培養用培地サプリメント。
- 前記嫌気性微生物は、絶対-嫌気性微生物であることを特徴とする、請求項1に記載の難培養性嫌気性微生物の高収率培養用培地サプリメント。
- 前記嫌気性微生物は、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ(Faecalibacterium prausnitzii)、アナエロスティペス・カカエ(Anaerostipes caccae)、アッカーマンシア・ムシニフィラ(Akkermansia muciniphila)、ブチリシコッカス・プリセコルム(Butyricicoccus pullicaecorum)、ロゼブリア・イヌリニボランス(Roseburia inulinivorans)、ロゼブリア・ホミニス(Roseburia hominis)、またはビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum)であることを特徴とする、請求項3に記載の難培養性嫌気性微生物の高収率培養用培地サプリメント。
- 植物ペプトン、酵母エキス、リン酸水素二カリウムを含む培地組成物であって、炭素源としてフルクトースとラクトースを含み、サプリメントとしてN-アセチルヘキソサミン、L-アスパラギン酸とL-システインのアミノ酸混合物及びコバラミンを含むことを特徴とする嫌気性微生物の高収率培養用培地組成物。
- 前記嫌気性微生物は、絶対-嫌気性微生物であることを特徴とする、請求項5に記載の難培養性嫌気性微生物の高収率培養用培地組成物。
- 前記嫌気性微生物は、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ(Faecalibacterium prausnitzii)、アナエロスティペス・カカエ(Anaerostipes caccae)、アッカーマンシア・ムシニフィラ(Akkermansia muciniphila)、ブチリシコッカス・プリセコルム(Butyricicoccus pullicaecorum)、ロゼブリア・イヌリニボランス(Roseburia inulinivorans)、ロゼブリア・ホミニス(Roseburia hominis)、またはビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum)であることを特徴とする、請求項5に記載の難培養性嫌気性微生物の高収率培養用培地組成物。
- 前記培地組成物は、植物ペプトン20g/L、酵母エキス10g/L、リン酸水素二カリウム2.5g/L、フルクトース2.5g/L、ラクトース2.5g/L、N-アセチルヘキソサミン5g/L、L-アスパラギン酸8g/L、L-システイン0.5g/L、及びコバラミン0.0001~0.005g/Lを含有することを特徴とする、請求項5に記載の難培養性嫌気性微生物の高収率培養用培地組成物。
- 前記植物ペプトンは、大豆ペプトン(soy peptone)、小麦ペプトン(wheat peptone)、綿ペプトン(cotton peptone)、エンドウペプトン(pea peptone)、ソラマメペプトン(broadbean peptone)、ルピンペプトン(lupin peptone)、及びジャガイモペプトン(potato peptone)から構成されたグループから選ばれることを特徴とする、請求項5に記載の難培養性嫌気性微生物の高収率培養用培地組成物。
- 前記培地組成物は、炭素源としてフルクトースの代わりにマルトースを含むか、またはフルクトースに加えてマルトースをさらに含むことを特徴とする、請求項5に記載の難培養性嫌気性微生物の高収率培養用培地組成物。
- 請求項5~請求項10のいずれか一項に記載の培地組成物に嫌気性微生物を接種し、嫌気性条件下で増殖させることを特徴とする、難培養性嫌気性微生物の高収率培養方法。
- 前記培養段階は、pH 6.6~7.0、培養温度35~39℃、攪拌速度40~50rpm、窒素飽和度80~90%、二酸化炭素飽和度5~20%及び水素飽和度0~5%で行うことを特徴とする、請求項11に記載の難培養性嫌気性微生物の高収率培養方法。
- 培養された嫌気性微生物が平板計数法によって測定される生菌数1010CFU/mL以上の細胞密度に到達することを特徴とする、請求項11に記載の難培養性嫌気性微生物の高収率培養方法。
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