CN114350571B - 非动物源性培养基及用其培养嗜黏蛋白阿克曼氏菌的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种非动物源性培养基及用其培养嗜黏蛋白阿克曼氏菌的方法，非动物源性培养基包含5g/L‑12g/L N‑乙酰‑D‑氨基葡萄糖、25g/L‑40g/L大豆蛋白胨、12g/L‑20g/L酵母浸粉、2g/L‑5g/L磷酸二氢钾、1g/L‑4g/L碳酸钠以及水。采用该非动物源性培养基培养嗜黏蛋白阿克曼氏菌的过程中，嗜黏蛋白阿克曼氏菌增殖快。并且采用该非动物源性培养基培养的嗜黏蛋白阿克曼氏菌生长状态好，安全性好，易操作和控制，培养时长短，满足作为药用价值的工业要求。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种非动物源性培养基及用其培养嗜黏蛋白阿克曼氏菌的方法。
背景技术
嗜黏蛋白阿克曼氏菌(Akkermansia muciniphila，以下简称嗜黏蛋白阿克曼氏菌)隶属疣微菌门，是一种革兰氏阴性菌。嗜黏蛋白阿克曼氏菌广泛分布于人类和动物的肠道黏液层中，是肠道高丰度共生菌之一。嗜黏蛋白阿克曼氏菌是人体肠道中一种可降解黏蛋白的细菌，能够以黏蛋白作为唯一碳源、氮源和能量来源，并在酵解过程中产生乙酸盐、乙醇、丙酸盐和硫酸盐。经研究发现，嗜黏蛋白阿克曼氏菌与多种系统疾病如肥胖、糖尿病、免疫调节、酒精性脂肪肝和冠状动脉硬化等均有一定关联，其含量是衡量肠道微生态平衡的重要标志物微生物之一。由于近年对嗜黏蛋白阿克曼氏菌生理功能的一系列重要发现，尤其是在肿瘤免疫疗法中的重要作用，使其被誉为具有重大应用及开发价值的“二代益生菌(NGP)”——生物活体治疗性药物(LBP)的重要候选菌株，作为新型候选益生菌，嗜黏蛋白阿克曼氏菌的培养显得尤为重要。
传统的用于培养嗜黏蛋白阿克曼氏菌的培养基含有动物源成分，包括采用牛脑心浸液琼脂干粉和猪胃黏蛋白配制而成的培养基，以及哥伦比亚液体培养基(ColumbiaBroth,CB)和脑心浸液液体培养基(Brain Heart Infusion,BHI)。虽然培养的效果尚可，但是成本较高，而且脑心浸液琼脂干粉和猪胃黏蛋白都来自于动物组织或消化物，来源于动物的成分可能含有病毒、朊病毒或细菌来源的污染物，或含有抗敏原、抗原肽或其他不期望的成分，还可能会携带未知的病毒和其他危险成分，因此，动物源成分的培养基的安全性无法得到充分保障。
已经有文献报道(Plovier H,Everard A,Druart C,et al.A purified membraneprotein from Akkermansia muciniphila or the pasteurized bacterium improvesmetabolism in obese and diabetic mice.[J].Nature Medicine,2016,23(1):107)嗜黏蛋白阿克曼氏菌的合成培养基(非动物源)，其包括大豆蛋白胨、苏氨酸、葡萄糖和N-乙酰-D-氨基葡萄糖。但是用该文献报道的培养基进行嗜黏蛋白阿克曼氏菌的扩增培养，不能够快速增殖培养得到嗜黏蛋白阿克曼氏菌。另在现有非动物源培养基配方中，有研究报道将黏蛋白用氨基酸替代，但此方法获得的非动物源培养基配方成分种类复杂、嗜黏蛋白阿克曼氏菌生长缓慢。传统的用于嗜黏蛋白阿克曼氏菌培养的非动物源性培养基再例如：CN110079474A公开的培养嗜黏蛋白阿克曼氏菌的培养基该培养基利用特定氨基酸组合替代培养基中天然组成氮源(如蛋白胨、酵母抽提物等)，进而实现利用全单质培养基，利用该培养基不添加牛脑心浸液琼脂干粉和猪胃黏蛋白。CN109810931A公开的培养嗜黏蛋白阿克曼氏菌的培养基，以水为溶剂，每升包括：20-45mmol葡萄糖、12-32g大豆蛋白胨、3-8g苏氨酸、20-35mmol N-乙酰葡糖胺、4-6g氯化钠和2-3.5g磷酸氢二钠
然而，采用如上举例的传统的用于嗜黏蛋白阿克曼氏菌培养的非动物源性培养基，嗜黏蛋白阿克曼氏菌增殖慢，难以满足产业化需求。
发明内容
基于以上技术问题，本发明的目的之一是提供一种非动物源性培养基，采用该非动物源性培养基培养嗜黏蛋白阿克曼氏菌的过程中，嗜黏蛋白阿克曼氏菌增殖快。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种非动物源性培养基，所述非动物源性培养基包含5g/L-12g/L N-乙酰-D-氨基葡萄糖、25g/L-40g/L大豆蛋白胨、12g/L-20g/L酵母浸粉、2g/L-5g/L磷酸二氢钾、1g/L-4g/L碳酸钠以及水。
在其中一个实施例中，所述非动物源性培养基还包含其他成分，所述其他成分为葡萄糖，或者，所述其他成分为葡萄糖，以及L-苏氨酸、氯化铵、吐温80、氯化钠和L-半胱氨酸盐酸盐中的一种或者多种。
在其中一个实施例中所述非动物源性培养基包含5g/L-12g/L N-乙酰-D-氨基葡萄糖、25g/L-40g/L大豆蛋白胨、12g/L-20g/L酵母浸粉、2g/L-5g/L磷酸二氢钾、1g/L-4g/L碳酸钠、1g/L-4g/L葡萄糖以及水。
在其中一个实施例中，所述非动物源性培养基包含5g/L-12g/L N-乙酰-D-氨基葡萄糖、25g/L-40g/L大豆蛋白胨、12g/L-20g/L酵母浸粉、2g/L-5g/L磷酸二氢钾、1g/L-4g/L碳酸钠、1g/L-4g/L葡萄糖、1g/L-4g/L L-苏氨酸、0.1g/L-1g/L氯化铵、0.5g/L-2g/L吐温80、2g/L-5g/L氯化钠、0.1g/L-1g/L L-半胱氨酸盐酸盐以及水。
一种嗜黏蛋白阿克曼氏菌的培养方法，所述培养方法包括将嗜黏蛋白阿克曼氏菌接种至所述的非动物源性培养基进行培养的步骤。
在其中一个实施例中，培养包括将嗜黏蛋白阿克曼氏菌接种至种子培养基中进行活化培养制备种子液的步骤，以及将所述种子液接种至发酵培养基中进行发酵培养的步骤；
所述种子培养基或/和所述发酵培养基为所述非动物源性培养基。
在其中一个实施例中，厌氧，发酵培养的温度为36℃-38℃，发酵培养的转速为50rpm-100rpm，发酵培养的时长为9h-24h。
在其中一个实施例中，发酵培养的接种浓度为1.0E+08CFU/mL-8.0E+08CFU/mL。
在其中一个实施例中，发酵培养采用补料分批发酵的方式。
在其中一个实施例中，补料分批发酵采用的补料物料包含N-乙酰-D-氨基葡萄糖。
在其中一个实施例中，补料分批发酵的次数为1次-3次，或/和，补料分批发酵的补料流速为1mL/min-2mL/min，补料分批发酵的补料物料浓度为90g/L-180g/L。
在其中一个实施例中，活化培养的条件包括：厌氧，活化培养的温度为36℃-38℃，活化培养为静态培养，活化培养的次数2次-3次，每次活化培养的时长为20h-30h。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明将适量的酵母浸粉和碳酸钠与N-乙酰-D-氨基葡萄糖、大豆蛋白胨、磷酸二氢钾搭配，形成非动物源性培养基培养，采用该非动物源性培养基培养嗜黏蛋白阿克曼氏菌的过程中，嗜黏蛋白阿克曼氏菌增殖快。并且采用该非动物源性培养基培养的嗜黏蛋白阿克曼氏菌生长状态好，安全性好，易操作和控制，培养时长短，满足作为药用价值的工业要求。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是实施例1培养基配方分离纯化的嗜黏蛋白阿克曼氏菌镜检结果；
图2是实施例2培养基配方分离纯化的嗜黏蛋白阿克曼氏菌镜检结果；
图3是实施例3培养基配方分离纯化的嗜黏蛋白阿克曼氏菌镜检结果；
图4是实施例4培养基配方分离纯化的嗜黏蛋白阿克曼氏菌镜检结果；
图5是实施例5培养基配方分离纯化的嗜黏蛋白阿克曼氏菌镜检结果；
图6是对比例1培养基配方分离纯化的嗜黏蛋白阿克曼氏菌镜检结果；
图7是对比例2培养基配方分离纯化的嗜黏蛋白阿克曼氏菌镜检结果；
图8是对比例3培养基配方分离纯化的嗜黏蛋白阿克曼氏菌镜检结果；
图9是对比例4培养基配方分离纯化的嗜黏蛋白阿克曼氏菌镜检结果；
图10是测试例3嗜黏蛋白阿克曼氏菌生长曲线结果；
图11是测试例4中对实施例1的培养基配方分离纯化的嗜黏蛋白阿克曼氏菌传代培养结果；
图12是测试例4中对实施例3的培养基配方分离纯化的嗜黏蛋白阿克曼氏菌传代培养结果；
图13是测试例4中对对比例1的培养基配方分离纯化的嗜黏蛋白阿克曼氏菌传代培养结果；
图14是测试例4中对对比例4的培养基配方分离纯化的嗜黏蛋白阿克曼氏菌传代培养结果。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更详细的描述。但是，应当理解，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式或实施例。相反地，提供这些实施方式或实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式或实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”的可选范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。
本发明中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。
本发明中涉及的百分比含量，如无特别说明，对于固液混合和固相-固相混合均指质量百分比，对于液相-液相混合指体积百分比。
本发明中涉及的百分比浓度，如无特别说明，均指终浓度。所述终浓度，指添加成分在添加该成分后的体系中的占比。
第一方面，本发明提供一种非动物源性培养基，所述非动物源性培养基包含5g/L-12g/L N-乙酰-D-氨基葡萄糖、25g/L-40g/L大豆蛋白胨、12g/L-20g/L酵母浸粉、2g/L-5g/L磷酸二氢钾、1g/L-4g/L碳酸钠以及水。
本发明将适量的酵母浸粉和碳酸钠与N-乙酰-D-氨基葡萄糖、大豆蛋白胨、磷酸二氢钾搭配，形成非动物源性培养基培养，采用该非动物源性培养基培养嗜黏蛋白阿克曼氏菌的过程中，嗜黏蛋白阿克曼氏菌增殖快。并且采用该非动物源性培养基培养的嗜黏蛋白阿克曼氏菌生长状态好，安全性好，易操作和控制，培养时长短，满足作为药用价值的工业要求。另外，采用本发明的非动物源性培养基培养嗜黏蛋白阿克曼氏菌，活菌数高、菌株活力高、传代稳定性好，并可放大进行工业化生产。
在其中一个示例中，所述非动物源性培养基还包含其他成分，所述其他成分为葡萄糖，或者，所述其他成分为葡萄糖，以及L-苏氨酸、氯化铵、吐温80、氯化钠和L-半胱氨酸盐酸盐中的一种或者多种。例如所述非动物源性培养基还包含葡萄糖，以及L-苏氨酸、氯化铵、吐温80、氯化钠和L-半胱氨酸盐酸盐中的2种、3种、4种、5种。
在其中一个示例中，所述非动物源性培养基包含5g/L-12g/L N-乙酰-D-氨基葡萄糖、25g/L-40g/L大豆蛋白胨、12g/L-20g/L酵母浸粉、2g/L-5g/L磷酸二氢钾、1g/L-4g/L碳酸钠、1g/L-4g/L葡萄糖以及水。
在其中一个示例中，所述非动物源性培养基包含5g/L-12g/L N-乙酰-D-氨基葡萄糖、25g/L-40g/L大豆蛋白胨、12g/L-20g/L酵母浸粉、2g/L-5g/L磷酸二氢钾、1g/L-4g/L碳酸钠、1g/L-4g/L葡萄糖、1g/L-4g/L L-苏氨酸、0.1g/L-1g/L氯化铵、0.5g/L-2g/L吐温80、2g/L-5g/L氯化钠、0.1g/L-1g/L L-半胱氨酸盐酸盐以及水。
本发明所述非动物源性培养基中，各成分的浓度为使用过程中的浓度。
第二方面，本发明提供一种嗜黏蛋白阿克曼氏菌的培养方法，所述培养方法包括将嗜黏蛋白阿克曼氏菌接种至所述的非动物源性培养基进行培养的步骤。
在其中一个示例中，培养包括将嗜黏蛋白阿克曼氏菌接种至种子培养基中进行活化培养制备种子液的步骤，以及将所述种子液接种至发酵培养基中进行发酵培养的步骤；
所述种子培养基或/和所述发酵培养基为所述非动物源性培养基。
在其中一个示例中，厌氧，发酵培养的温度为36℃-38℃，发酵培养的转速为50rpm-100rpm，发酵培养的时长为9h-24h。发酵培养的温度例如为36℃、36.5℃、37℃、37.5℃、38℃，发酵培养的转速例如为50rpm、60rpm、70rpm、80rpm、90rpm、100rpm，发酵培养的时长例如为9h、10h、11h、12h、13h、14h、15h、16h、17h、18h、19h、20h、21h、22h。
在其中一个示例中，发酵培养的接种浓度为1.0E+08CFU/mL-8.0E+08CFU/mL。
在其中一个示例中，发酵培养采用补料分批发酵的方式。
在其中一个示例中，补料分批发酵采用的补料物料包含N-乙酰-D-氨基葡萄糖。
在其中一个示例中，补料分批发酵的补料次数为1次-3次。例如1次、2次、3次。
在其中一个示例中，补料分批发酵的补料流速为1mL/min-2mL/min(例如1mL/min、1.5mL/min、2mL/min)，补料分批发酵的所述补料物料的终浓度为90g/L-180g/L。
在其中一个示例中，厌氧，活化培养的温度为36℃-38℃，活化培养为静态培养，活化培养的次数2次-3次，每次活化培养的时长为20h-30h。活化培养的温度例如为36℃、36.5℃、37℃、37.5℃、38℃。本发明所述的活化是逐级活化，活化1次制备一级种子液，一级种子液经第2次活化制备二级种子液，以此类推。
下面结合具体实施例对本发明进行进一步的阐述。
实施例1
1、培养基及其制备
非动物源性培养基包含水以及5g/L N-乙酰-D-氨基葡萄糖、27g/L大豆蛋白胨、15g/L酵母浸粉、3g/L无水磷酸二氢钾和2g/L碳酸钠。
将所述成分和水混合后，溶解完成，高温灭菌。
2、阿克曼氏菌的培养
(1)将阿克曼氏菌的菌种子按照2％(v/v)比例接种至10mL非动物源性培养基中，其接种浓度为2.0E+08CFU/mL，在以三元气体(5％CO2/10％H2/85％N2)作为厌氧保护气下，37±1℃厌氧静态培养24h，得一级种子液；
(2)将镜检合格的一级种子液按照2％(v/v)比例接种至200mL非动物源性培养基中，其接种浓度为5.0E+08CFU/mL，在以三元气体(5％CO2/10％H2/85％N2)作为厌氧保护气下，37±1℃厌氧培养20h，培养结束后得二级种子液；
(3)在发酵罐中加入非动物源性培养基，厌氧保护气为二元混合气(7％CO2/93％N2)，按照6％(v/v)比例接种二级种子液，其接种浓度为8.0E+08CFU/mL，37±1℃，厌氧搅拌100rpm平均培养13.7h。
实施例2
1、培养基及其制备
非动物源性培养基包含水以及8g/L N-乙酰-D-氨基葡萄糖、40g/L大豆蛋白胨、20g/L酵母浸粉、2g/L无水磷酸二氢钾、2g/L碳酸钠和2g/L无水葡萄糖。
将上述成分和水混合后，溶解完成，高温灭菌。
2、阿克曼氏菌的培养
(1)将阿克曼氏菌的菌种子按照2％(v/v)比例接种至10mL非动物源性培养基中，其接种浓度为3.6E+08CFU/mL，在以三元气体(5％CO2/10％H2/85％N2)作为厌氧保护气下，37±1℃厌氧静态培养24h，得一级种子液；
(2)将镜检合格的一级种子液按照2％(v/v)比例接种至200mL非动物源性培养基中，其接种浓度为6.0E+08CFU/mL，在以三元气体(5％CO2/10％H2/85％N2)作为厌氧保护气下，37±1℃厌氧培养21h，培养结束后得二级种子液；
(3)在发酵罐中加入非动物源性培养基，厌氧保护气为二元混合气(7％CO2/93％N2)，按照6％(v/v)比例接种二级种子液，其接种浓度为7.4E+08CFU/mL，37±1℃，厌氧搅拌100rpm培养14.3h。
实施例3
1、培养基及其制备
非动物源性培养基包含水以及5g/L N-乙酰-D-氨基葡萄糖、25g/L大豆蛋白胨、14g/L酵母浸粉、2g/L无水磷酸二氢钾、1g/L无水碳酸钠、4g/L无水葡萄糖、1g/L L-苏氨酸、1g/L氯化铵、2g/L吐温80、5g/L氯化钠和0.1g/L L-半胱氨酸盐酸盐。
将上述成分和水混合后，溶解完成，高温灭菌。
2、阿克曼氏菌的培养
(1)将阿克曼氏菌的菌种子按照2％(v/v)比例接种至10mL非动物源性培养基中，其接种浓度为1.6E+08CFU/mL，在以三元气体(5％CO2/10％H2/85％N2)作为厌氧保护气下，37±1℃厌氧静态培养23h，得一级种子液；
(2)将镜检合格的一级种子液按照2％(v/v)比例接种至200mL非动物源性培养基中，其接种浓度为5.6E+08CFU/mL，在以三元气体(5％CO2/10％H2/85％N2)作为厌氧保护气下，37±1℃厌氧培养20h，培养结束后得二级种子液；
(3)在发酵罐中加入非动物源性培养基，厌氧保护气为二元混合气(7％CO2/93％N2)，按照6％(v/v)比例接种二级种子液，其接种浓度为7.8E+08CFU/mL，37±1℃，厌氧搅拌100rpm培养14.0h。
实施例4
1、培养基及其制备
非动物源性培养基包含水以及5g/L N-乙酰-D-氨基葡萄糖、25g/L大豆蛋白胨、14g/L酵母浸粉、2g/L无水磷酸二氢钾、1g/L无水碳酸钠、4g/L无水葡萄糖、1g/L L-苏氨酸、1g/L氯化铵、2g/L吐温80、5g/L氯化钠和0.1g/L L-半胱氨酸盐酸盐。
将上述各成分和水混合后，溶解完成，高温灭菌。
2、阿克曼氏菌的培养
(1)将阿克曼氏菌的菌种子按照2％(v/v)比例接种至10mL非动物源性培养基中，其接种浓度为2.6E+08CFU/mL在以三元气体(5％CO2/10％H2/85％N2)作为厌氧保护气下，37±1℃厌氧静态培养27h，得一级种子液；
(2)将镜检合格的一级种子液按照2％(v/v)比例接种至200mL非动物源性培养基中，其接种浓度为4.8E+08CFU/mL，在以三元气体(5％CO2/10％H2/85％N2)作为厌氧保护气下，37±1℃厌氧培养21h，培养结束后得二级种子液；
(3)在发酵罐中加入非动物源性培养基，厌氧保护气为二元混合气(7％CO2/93％N2)，按照6％(v/v)比例接种二级种子液，其接种浓度为6.8E+08CFU/mL，37±1℃，厌氧搅拌100rpm，过程中进行N-乙酰-D-氨基葡萄糖补料，补料分三次，每次50mL，N-乙酰-D-氨基葡萄糖的补料浓度分别为90g/L、135g/L和180g/L，控制补料速度约1.0mL/min，补料约0.5h内完成，厌氧培养19h。
表1、补料N-乙酰-D-氨基葡萄糖实验安排
| 组数 | 补料N-乙酰-D-氨基葡萄糖浓度 | 补料体积 |
| F1 | 0g/L(生理盐水) | 50mL |
| F2 | 90.0g/L | 50mL |
| F3 | 135.0g/L | 50mL |
| F4 | 180.0g/L | 50mL |
实施例5
本实施例是实施例3的变化例，相对于实施例3的变化之处主要在于非动物源性培养基的配方，本实施例非动物源性培养基包含12g/L N-乙酰-D-氨基葡萄糖、40g/L大豆蛋白胨、20g/L酵母浸粉、5g/L磷酸二氢钾、4g/L碳酸钠、1g/L葡萄糖、4g/L L-苏氨酸、0.1g/L氯化铵、0.5g/L吐温80、2g/L氯化钠、1g/L L-半胱氨酸盐酸盐以及水。
表2、实施例非动物源性培养基配方汇总
对比例1
1、培养基及其制备
培养基包含水以及如下浓度的各成分：脑心浸液肉汤培养液(BHI)，配方为10.0g/L胰蛋白胨、17.5g/L牛心浸粉、5.0g/L氯化钠、2.0g/L葡萄糖。
将所述培养基成分和水混合后，溶解完成，高温灭菌。
2、本对比例1培养嗜黏蛋白阿克曼氏菌的具体步骤如下：
(1)将嗜黏蛋白阿克曼氏菌的菌种子按照2％(v/v)比例接种至10mL培养基中，其接种浓度为2.0E+08CFU/mL，在以三元气体(5％CO2/10％H2/85％N2)作为厌氧保护气下，37±1℃厌氧静态培养24h，得一级种子液；
(2)将镜检合格的一级种子液按照2％(v/v)比例接种至200mL培养基中，其接种浓度为5.0E+08CFU/mL，在以三元气体(5％CO2/10％H2/85％N2)作为厌氧保护气下，37±1℃厌氧培养22h，培养结束后得二级种子液；
(3)在发酵罐中加入培养基，厌氧保护气为二元混合气(7％CO2/93％N2)，按照6％(v/v)比例接种二级种子液，其接种浓度为8.0E+08CFU/mL，37℃，厌氧搅拌100rpm培养13.2h。
对比例2
对比例1是实施例1的对比例，相对于实施例1的差别主要包括非动物源性培养基配方不同，具体地，对比例1的非动物源性培养基包含水以及5g/L N-乙酰-D-氨基葡萄糖、27g/L大豆蛋白胨、15g/L酵母浸粉、3g/L无水磷酸二氢钾和0g/L碳酸钠。
对比例3
对比例1是实施例1的对比例，相对于实施例1的差别主要包括无动物源性培养基配方不同，具体地，对比例1的非动物源性培养基包含水以及5g/L N-乙酰-D-氨基葡萄糖、27g/L大豆蛋白胨、15g/L酵母浸粉、3g/L无水磷酸二氢钾和2g/L碳酸氢钠。
对比例4
对比例1是实施例1的对比例，相对于实施例1的差别主要包括非动物源性培养基配方不同，具体地，对比例1的无动物源性培养基包含水以及5g/L N-乙酰-D-氨基葡萄糖、27g/L大豆蛋白胨、15g/L酵母浸粉、3g/L无水磷酸二氢钾和5g/L碳酸钠。
对上述实施例1至实施例5和对比例1至对比例4的无动物源性培养基及培养方法培养的嗜黏蛋白阿克曼氏菌进行检测。
测试例1、嗜黏蛋白阿克曼氏菌培养液检测
1、检验对象：实施例1-5及对比例1-4的培养基配方所得培养物。
2、实验方法：
1)形态对比：对上述培养物进行分离纯化，镜检。
2)OD600值检测：对上述培养物使用纯化水稀释至合适浓度，用纯水做对照，用紫外分光光度计测600nm的光密度值(1cm光程)。
3)活菌数检测：取上述培养物，分别以BHI按0.5mL+4.5mL稀释体系进行10倍系列稀释，准确吸取最终稀释度的菌液100μl，均匀涂布于N-乙酰-D-氨基葡萄糖氯化血红素BHA平皿上，每个稀释度共做3个平皿，同时做1个阴性对照，正置放于37℃的厌氧手套箱内(5％CO2/10％H2/85％N2)培养，培养约48-96h后观察每个平皿的菌落生长情况，并计数。根据3个平皿菌落数之和按下列公式计算活菌数。
活菌数(CFU/mL)＝菌落数之和/3×10×最终稀释度
4)活力测定：对上述培养物进行分离纯化，按下述步骤进行检验。
①制备活力管：称取脱脂奶粉11g加入89mL蒸馏水，搅拌10-15min使之充分溶解，溶解后静置1h后用双层纱布过滤，除去不溶物。然后将溶液分装试管10mL，盖上塞子密封。采用间歇三次灭菌：第一次灭菌90℃-95℃水浴灭菌20min，取出自然冷却至室温然后放置于4℃-6℃冰箱保存。第二天进行第二次灭菌，方法同第一次灭菌，取出自然冷却至室温然后放置于4℃-6℃冰箱保存。第三天进行第三次灭菌，方法同第一次灭菌，取出自然冷却至室温然后放置于4℃-6℃冰箱保存备用。
制得的脱脂奶粉溶液要求：比重1.033-1.034；酸度≤20°T；温度为20℃。
②活力测定
接种：接种前将活力管预热至37℃，在灭菌的活力管中加入3％(v/v)的上述培养物。接种操作要求在超净台完成，操作过程为无菌操作，使用接种吸管必须经过灭菌。
发酵：在恒温37℃进行发酵培养3.5h。
测酸：发酵培养3.5h后，立即取出活力管进行酸度测定。用移液管移取10mL样品至100mL三角瓶中，用20mL纯净水将移液管润洗干净后，一并倒入100mL三角瓶中，加入3滴0.5％酚酞，开始滴定。用0.1mo1/mL NaOH标准溶液滴定至微红色，并在30s内不退色。消耗的0.1mol/mL NaOH标准溶液毫升数乘以10，即为酸度。
计算：菌种活力＝0.087×消耗氢氧化钠毫升数。
分别对对比例1-2和实施例1-3中嗜黏蛋白阿克曼氏菌非动物源性培养基进行OD600值、活菌数和菌活力检测。
3、实验结果
1)形态对比：
实施例1-实施例5所述非动物源培养基所得培养物的镜检结果如图1-图5所示，对比例1-对比例4的培养基所得培养物的镜检结果如图6-图9所示。结合图1-图5和图6可知：对比例1、实施例1-5所得培养物所含嗜黏蛋白阿克曼氏菌的形态均为革兰氏阴性、球状或短杆状，且形态均一，这种形态接近嗜黏蛋白阿克曼氏菌的正常形态；结合图7-图9可知：对比例2-对比例4所得培养物所含嗜黏蛋白阿克曼氏菌的形态呈革兰氏阴性、长杆状或链状，且形态不均一。嗜黏蛋白阿克曼氏菌的形态呈球状或短杆状、形态均一，说明生长状态较佳，呈长杆状、形态不均一说明生长状态不佳。可见，由镜检结果可知：实施例1-实施例5所述非动物源性培养基培养嗜黏蛋白阿克曼氏菌的效果与对比例1一致，均适合嗜黏蛋白阿克曼氏菌的生长。
2)OD600值、活菌数和菌活力检测，结果如下表3。
表3、对比例1-4及实施例1-5培养基培养嗜黏蛋白阿克曼氏菌所得培养物检测结果
由表3结果可知，采用本发明实施例1-实施例3和实施例5所述配方培养嗜黏蛋白阿克曼氏菌，菌活力高，培养时长短，仅为13.7-14.3h；相对于对比例1所述BHI培养基，其OD600值分别平均提高51.12％、52.90％、44.96％和49.79％，活菌数分别提高43.19％、47.04％、51.34％和44.09％。
采用本发明实施例4所述补料工艺培养嗜黏蛋白阿克曼氏菌，较实施例3培养效果，其发酵时长延长5.0h，OD600值提高43.44％，活菌数提高34.64％。
对比例2-对比例4中所述配方培养嗜黏蛋白阿克曼氏菌，培养时长平均分别为28.3h、25.2和24.4h，较实施例1(13.7h)，分别延长106.57％、83.94％和78.10％，OD600值分别为1.298、2.485和2.648，较实施例1(3.314)，OD600值分别降低60.83％、25.02％和20.10％，活菌数分别为8.64E+08CFU/ml、1.58E+09CFU/ml和3.85E+09CFU/ml，较实施例1(5.33E+09CFU/ml)，活菌数分别降低83.79％、70.36％和27.77％。
可见，实施例1-实施例3和实施例5所述非动物源培养基配方培养嗜黏蛋白阿克曼氏菌，其时长短、所得培养物OD600值和活菌数更高、所得的菌活力更高。实施例4所述培养方法培养嗜黏蛋白阿克曼氏菌，可进一步提高其活菌数。
测试例2、培养基配方的安全性比较
1)检验对象：实施例1-实施例5及对比例1-对比例4培养基配方所得培养物。
2)取样：取9-24h所得培养液进行杂菌检测。
采用上述方法，用对比例1-对比例4及实施例1-实施例5培养基配方制备嗜黏蛋白阿克曼氏菌发酵培养液，对上述培养液进行杂菌检测，检测结果如下表4。
表4、嗜黏蛋白阿克曼氏菌发酵培养液中杂菌检测结果
根据表4中数据结果可知，实施例1-5和对比例2-4所述非动物源培养基配方所得培养液中的杂菌数远少于对例1中所述BHI培养基，其安全性显著优于BHI培养基。
测试例3、补料N-乙酰-D-氨基葡萄糖对嗜黏蛋白阿克曼氏菌培养效果的影响
1)培养基配方：实施例4。
2)OD600值检测：对上述培养物使用纯化水稀释至合适浓度，用纯水做对照，用紫外分光光度计测600nm的光密度值。
由图10结果可知：与补料0g/L浓度N-乙酰-D-氨基葡萄糖实验组相比，补料90g/L、135g/L和180g/L浓度N-乙酰-D-氨基葡萄糖后，对数生长期均由15h延长至19h，OD600值由3.179分别增至4.674、4.792和4.214，增长率分别为47.03％、50.74％和32.56％，但三者增长率无明显差异。
性能测试4、嗜黏蛋白阿克曼氏菌传代稳定性效果
1)培养基配方：实施例1、实施例3、对比例1以及对比例4。
2)培养方法：同上。分别将实施例1、实施例3、对比例1以及对比例4的培养12h的发酵液(第一代)按照6％(v/v)比例接种至装有培养基的1L发酵罐中，其接种浓度为4.20E+09CFU/mL，厌氧保护气为二元混合气(7％CO2/93％N2)，37±1℃，厌氧搅拌100rpm培养12.0h，连续传代培养10代。
3)检测：按测试1所述检测方法进行OD600、活菌数和菌活力测定。
4)实验结果：
OD600值、活菌数和菌活力检测，结果如图11、图12、图13及图14。
由图11可知：连续传代培养10代后，采用实施例1的培养基进行嗜黏蛋白阿克曼氏菌传代培养，各代所得培养物OD600值稳定为3.267-3.489左右，活菌数稳定为4.08E+09CFU/mL-5.58E+09CFU/mL，菌活力稳定为0.90-0.92。
由图12可知：连续传代培养10代后，采用实施例3的培养基进行嗜黏蛋白阿克曼氏菌传代培养，各代所得培养物OD600值稳定为3.002-3.210，活菌数稳定为3.90E+09CFU/mL-5.10E+09CFU/mL，菌活力稳定为0.90-0.92。
而图13和图14的嗜黏蛋白阿克曼氏菌传代稳定性较差，特别是传代到第6代的OD600值、活菌数和菌活力均发生较大幅度的下降，并且传代活性持续下降。
由此可知，采用本发明培养基培养嗜黏蛋白阿克曼氏菌，进行传代培养，其OD600值、活菌数和菌活力均保持在较为稳定的水平，传代稳定性良好。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
应当理解，本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或者有限的试验得到的技术方案，均在本发明所述附权利要求的保护范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。
Claims (11)
1.一种非动物源性培养基，其特征在于，所述非动物源性培养基包含：
5g/L-12g/L N-乙酰-D-氨基葡萄糖、
25g/L-40g/L大豆蛋白胨、
12g/L-20g/L酵母浸粉、
2g/L-5g/L磷酸二氢钾、
1g/L-4g/L碳酸钠、以及水。
2.根据权利要求1所述的非动物源性培养基，其特征在于，所述非动物源性培养基还包含其他成分；
所述其他成分为葡萄糖，或者，
所述其他成分为葡萄糖，以及L-苏氨酸、氯化铵、吐温80、氯化钠和L-半胱氨酸盐酸盐中的一种或者多种。
3.根据权利要求1或者2所述的非动物源性培养基，其特征在于，所述非动物源性培养基包含：
5g/L-12g/L N-乙酰-D-氨基葡萄糖、
25g/L-40g/L大豆蛋白胨、
12g/L-20g/L酵母浸粉、
2g/L-5g/L磷酸二氢钾、
1g/L-4g/L碳酸钠、
1g/L-4g/L葡萄糖以及水；或，
所述非动物源性培养基包含：
5g/L-12g/L N-乙酰-D-氨基葡萄糖、
25g/L-40g/L大豆蛋白胨、
12g/L-20g/L酵母浸粉、
2g/L-5g/L磷酸二氢钾、
1g/L-4g/L碳酸钠、
1g/L-4g/L葡萄糖、
1g/L-4g/L L-苏氨酸、
0.1g/L-1g/L氯化铵、
0.5g/L-2g/L吐温80、
2g/L-5g/L氯化钠、
0.1g/L-1g/L L-半胱氨酸盐酸盐以及水。
4.根据权利要求1或2所述的非动物源性培养基，其特征在于，
(1)所述非动物源性培养基由以下组分组成：5g/L N-乙酰-D-氨基葡萄糖、
27g/L大豆蛋白胨、
15g/L酵母浸粉、
3g/L磷酸二氢钾、
2g/L碳酸钠以及水；
(2)所述非动物源性培养基由以下组分组成：8g/L N-乙酰-D-氨基葡萄糖、
40g/L大豆蛋白胨、
20g/L酵母浸粉、
2g/L磷酸二氢钾、
2g/L碳酸钠、
2g/L葡萄糖以及水；
(3)所述非动物源性培养基由以下组分组成：5g/L N-乙酰-D-氨基葡萄糖、
25g/L大豆蛋白胨、
14g/L酵母浸粉、
2g/L磷酸二氢钾、
1g/L碳酸钠、
4g/L葡萄糖、
1g/L L-苏氨酸、
1g/L氯化铵、
2g/L吐温80、
5g/L氯化钠、
0.1g/L L-半胱氨酸盐酸盐以及水；或者
(4)所述非动物源性培养基由以下组分组成：
12g/L N-乙酰-D-氨基葡萄糖、
40g/L大豆蛋白胨、
20g/L酵母浸粉、
5g/L磷酸二氢钾、
4g/L碳酸钠、
1g/L葡萄糖、
4g/L L-苏氨酸、
0.1g/L氯化铵、
0.5g/L吐温80、
2g/L氯化钠、
1g/L L-半胱氨酸盐酸盐以及水。
5.一种嗜黏蛋白阿克曼氏菌的培养方法，其特征在于，所述培养方法包括将嗜黏蛋白阿克曼氏菌接种至权利要求1至4任一项所述的非动物源性培养基进行培养的步骤。
6.根据权利要求5所述的嗜黏蛋白阿克曼氏菌的培养方法，其特征在于，培养包括将嗜黏蛋白阿克曼氏菌接种至种子培养基中进行活化培养制备种子液的步骤，以及将所述种子液接种至发酵培养基中进行发酵培养的步骤；
所述种子培养基或/和所述发酵培养基为所述非动物源性培养基。
7.根据权利要求6所述的嗜黏蛋白阿克曼氏菌的培养方法，其特征在于，发酵培养的条件包括：厌氧，发酵培养的温度为36℃-38℃，发酵培养的转速为50rpm-100rpm，发酵培养的时长为9h-24h；
或/和，发酵培养的接种浓度为1.0E+08CFU/mL-8.0E+08CFU/mL。
8.根据权利要求6或者7所述的嗜黏蛋白阿克曼氏菌的培养方法，其特征在于，发酵培养采用补料分批发酵的方式。
9.根据权利要求8所述的嗜黏蛋白阿克曼氏菌的培养方法，其特征在于，补料分批发酵采用的补料物料包含N-乙酰-D-氨基葡萄糖。
10.根据权利要求9所述的嗜黏蛋白阿克曼氏菌的培养方法，其特征在于，补料分批发酵的次数为1次-3次，或/和，补料分批发酵的补料流速为1mL/min-2mL/min，补料分批发酵的补料物料浓度为90g/L-180g/L。
11.根据权利要求6、7、9和10中任一项所述的嗜黏蛋白阿克曼氏菌的培养方法，其特征在于，活化培养的条件包括：厌氧，活化培养的温度为36℃-38℃，活化培养为静态培养，活化培养的次数2次-3次，每次活化培养的时长为20h-30h。
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