MX2014007268A - Nuevo proceso para cultivar bacterias para el mejoramiento del rendimiento de las poliosas capsulares. - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a la optimización de las condiciones de cultivo que utiliza diferentes soluciones de alimentación y estrategias de alimentación para mejorar la producción de las poliosas capsulares (CP).

Description

NUEVO PROCESO PARA CULTIVAR BACTERIAS PARA EL MEJORAMIENTO DEL RENDIMIENTO DE LAS POLIOSAS CAPSULARES Antecedentes de la Invención Las poliosas capsulares son inmunógenos importantes encontrados sobre la superficie de las bacterias involucradas en diversas enfermedades bacterianas. Esta característica ha conducido a que éstas sean un componente importante en el diseño de vacunas. Estas han probado ser útiles en promover respuestas inmunitarias especialmente cuando están enlazadas a proteínas portadoras.

Típicamente, las poliosas capsulares son producidas utilizando el cultivo por lotes en medio complejo [Consultar Shen et al. 2001 Vaccine 19:850-61; Palazzi et al. 204 J. Infect. Dis. 190:558-64; Merritt et al. 2000 J. Biotech. 81:189-97; Dassy & Fournier 1996 Infect. Immunol . 64:2408-14; Suarez et al. (2001) Appl . Env. Microbiol . 67:969-71; Wicken et al. (1983) J. Bact . 153:84-92].

El control tradicional DO-stat de alimentación nutritiva está simplemente basado en el concepto de que la densidad óptica (DO) se eleva/se agrega (debido a una reducción del sustrato del carbono o el cese del consumo de oxígeno o la respiración) después de la limitación o agotamiento de los nutrientes. El control Do-stat intenta mantener el cultivo a un nivel de DO constante dentro de un Ref. 249412 límite (el punto de ajuste de DO) mediante el incremento de la velocidad de alimentación con nutrientes cuando la DO se eleva por arriba del punto de ajuste y se reduce la velocidad de alimentación de nutrientes cuando la DO cae por debajo del punto de ajuste. La estrategia DO-stat típicamente funciona bien en medios definidos donde el agotamiento de los nutrientes da como resultado la elevación rápida de la DO. No obstante, el método DO-stat frecuentemente falla en medios suplementados con nutrientes complejos ricos tales como extracto de levadura, triptona, peptona, casaminoácido, o Hy-Soy. Los nutrientes complejos ricos son capaces de apoyar el mantenimiento y la respiración celular a través del catabolismo de los aminoácidos tal que el nivel de DO permanece bajo (es decir, no hay picos aparentes de DO) incluso bajo limitación o agotamiento de la fuente de carbono .

Cuando es utilizado un medio complejo para el crecimiento del cultivo, una estrategia de pH-stat puede ser más adecuada que el DO-stat ya que el pH del cultivo tiende a incrementarse una vez que la fuente de carbono se agota. De una manera similar al control de DO-stat, el método pH-stat mantiene un pH de cultivo constante aproximadamente en el punto de ajuste, mediante el incremento de la velocidad de alimentación de los nutrientes conforme el pH se eleva por arriba del punto de ajuste y se reduce la velocidad de alimentación de los nutrientes cuando el pH cae por debajo del punto de ajuste. Sin embargo, ya que el cambio en el pH del cultivo después del agotamiento de los nutrientes responde menos que aquel de la DO, el control de la alimentación por pH-stat puede ser relativamente lento cuando se compara a DO-stat.

La mayoría de los estudios utilizaron sistemas de cultivo por lotes en los cuales la velocidad de crecimiento, los niveles de nutrientes y las concentraciones metabólicas cambian durante el cultivo. En tales sistemas, la alteración de un factor da como resultados cambios en otros factores asociados con el crecimiento, que pueden afectar los rendimientos de manera impredecible . Los cultivos continuos permiten que el investigador separe y defina los parámetros que son interdependientes durante el crecimiento de cultivo por lotes, tal como la velocidad de crecimiento, las concentraciones de nutrientes y de productos y la densidad celular. Durante el cultivo continuo, es agregado medio fresco a un cultivo a una velocidad fija y las células y el medio son retirados a una velocidad que mantiene un volumen de cultivo constante.

En el cultivo de perfusión, es agregado medio fresco a un cultivo a una velocidad fija y el medio gastado libre de células es retirado a una velocidad que mantiene un volumen de cultivo constante. Sin embargo, el cultivo continuo y de perfusión está propenso a problemas de estabilidad por tensión y contaminación, y es algo costoso debido a la alimentación continua del medio de los nutrientes. Por lo tanto, existe una necesidad para encontrar alternativas al cultivo continuo para la producción de alto rendimiento de polisacáridos capsulares, con el fin de superar los problemas con el cultivo continuo, que son citados anteriormente.

Un enfoque para superar los inconvenientes del cultivo continuo es ejemplificado en el documento WO 2007/052168. Un proceso de fermentación por lotes, de alimentación compleja ha sido desarrollado para mantener un ambiente nutricional y una velocidad de crecimiento favorables para la producción de cps . Este proceso combina las ventajas de las técnicas por lotes y continua, produciendo altas densidades celulares debido a la extensión de la fase de crecimiento exponencial y a las condiciones que controlan la adición de sustrato durante la fermentación. No obstante, la técnica de lote alimentado complejo utiliza la dotación lógica informática (software) con un algoritmo complejo para manejar la fermentación.

Otro procedimiento es descrito en WO 20100272755. Un método para cultivar las bacterias ha sido desarrollado, en donde el cultivo comprende dos adiciones instantáneas de extracto de levadura, seguidas por una adición lineal de una glucosa. Cada adición es iniciada a un nivel de OD designado. De este modo aquí, la adición lineal de una fuente de carbono sin un algoritmo es un mejoramiento sobre la fermentación del lote alimentado complejo, previo. No obstante, éste es un método muy tedioso que requiere medición continua de la O.D. Además, éste falla en considerar los requerimientos de cambio constantes (microambiente) del organismo.

La presente invención está basada en un hallazgo sorprendente y se refiere a un nuevo método de alimentación, en donde la velocidad de adición del medio de alimentación durante la fermentación por lote alimentado, es equivalente a la velocidad de adición de la mezcla de álcali para mantener un pH preestablecido, dando como resultado un incremento volumétrico en el rendimiento de CP en comparación a los métodos de fermentación por lotes, previamente existentes.

Sumario de la Invención La presente invención proporciona una nueva estrategia de fermentación por lote alimentado que da como resultado un incremento de 3 a 5 veces en la productividad de las poliosas capsulares, en comparación a la fermentación en el modo por lotes.

Particularmente, el presente método se refiere a un método de cultivo de bacterias capsuladas para la producción volumétrica más alta de las poliosas capsulares (CP) , en donde el método comprende (a) proporcionar un inoculo de una cepa de la bacteria que expresa la CP; (b) cultivar la cepa mediante fermentación a pH 7.2, en donde la velocidad de adición del medio de alimentación es equivalente a la velocidad de adición de la mezcla de álcali para mantener un pH preestablecido; (c) fermentar el medio de cultivo a 35-38°C bajo agitación a 50-150 RPM con una velocidad de flujo de aire de 0.1 a 0.5 wm.

Breve Descripción de las Figuras Figura 1: Polisacárido de Pneumococo de serotipo 1 (fermentación por lote alimentado) para diferentes métodos de alimentación.

Figura 2 : Rendimiento de polisacárido de neumococo serotipo 1 (lote alimentado) para diferentes proporciones de bases en la mezcla de álcali para el mantenimiento del pH.

Figura 3 : Rendimiento de polisacárido de pneumococo serotipo 1, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 19A, 19F y 23F por lote alimentado en comparación a la fermentación por lotes.

Descripción Detallada de la Invención La descripción proporciona un proceso para cultivar bacterias, en donde la velocidad de adición de la alimentación durante la fermentación por lote alimentado es equivalente a la velocidad de la adición de la mezcla de álcali para mantener un pH preestablecido.

Otro aspecto más de la presente invención es que la mezcla de álcali que consiste de NaOH y carbonato de sodio en una proporción específica puede ser utilizada para a) mantener el pH preestablecido y b) obtener un más alto rendimiento de la poliosa capsular. El uso únicamente de carbonato de sodio puede proporcionar el medio adecuado para el crecimiento así como el control del pH, sin embargo la condición limitante del carbonato de sodio puede proporcionar una condición de tensión o estrés para elaborar las poliosas capsulares y más alto requerimiento de la cantidad de carbonato de sodio. Por lo tanto, cuando la mezcla de hidróxido de sodio y carbonato de sodio es utilizada para mantener el pH, el crecimiento puede ser menor con la productividad más alta de la poliosa específica, así como con la mayor productividad volumétrica debido a menor cantidad del consumo de álcali.

De acuerdo al presente proceso, cuando la gloucosa es convertida a ácido láctico y el pH comienza a descender, éste puede ser mantenido por la adición de la mezcla de álcali con la adición simultánea de glucosa para suplementar la glucosa agotada en el medio.

En una modalidad preferida de la presente invención, los componentes de la alimentación de fermentación pueden comprender al menos una fuente de carbono, al menos una fuente de nitrógeno, al menos una fuente de magnesio que puede ser alimentada la fermentación por lotes a una densidad celular particular, a una velocidad de alimentación equivalente a la velocidad de adición de la mezcla de álcali.

Una modalidad de la presente invención es que, la mezcla de álcali contiene al menos dos bases seleccionadas del grupo que consiste de hidróxido de sodio, carbonato de sodio, bicarbonato de sodio, hidróxido de potasio, carbonato de potasio e hidróxido de calcio. También, una proporción designada de hidróxido de sodio y carbonato de sodio es seleccionada para alcanzar una producción volumétrica más alta de CP.

La proporción designada de hidróxido de sodio al carbonato de sodio puede estar entre 1:1 y 4:1.

De acuerdo a la presente invención, el hidróxido de sodio aumentó adicionalmente la productividad de la CP cuando se utilizó con carbonato de sodio como mezcla para mantener el pH. Únicamente el carbonato de sodio proporcionó el medio adecuado para el crecimiento, cuando se utilizó para el mantenimiento del pH. No obstante, la condición limitante del carbonato de sodio proporcionó una condición de agresión o estrés para elaborar las poliosas capsulares. Cuando la mezcla de hidróxido de sodio y carbonato de sodio fue utilizada para mantener el pH, el crecimiento fue menor pero la productividad de CP se incrementó.

Preferentemente, la invención proporciona un método de cultivo de Streptococcus en cultivo de lote alimentado, en donde es producido un alto rendimiento de la CP.

Preferentemente, el rendimiento de las CPS a partir del medio de cultivo está entre 900 y 2000 mg/L o más. De este modo, este método de lote alimentado permite la producción de CP a un incremento del rendimiento volumétrico entre 150 y 350 % en comparación con el cultivo por lotes. En algunos casos, el rendimiento puede ser al menos dos veces la cantidad producida utilizando el cultivo por lotes, más preferentemente 4 veces la cantidad producida utilizando el cultivo por lotes.

Otra modalidad más de la presente invención es que el medio de alimentación puede comprender al menos una fuente de carbono, al menos una fuente de nitrógeno, al menos una sal y al menos un aminoácido.

Preferentemente, la fuente de carbono es glucosa. La fuente de nitrógeno puede ser seleccionada de autolisados de levadura, base de nitrógeno de levadura, peptonas, triptona, casaminoácidos , harina de soja, Hy-Soy, extracto de levadura y caldo de soja tripticaseína . La sal puede ser seleccionada de sulfato de potasio, cloruro de calcio, cloruro de magnesio, sulfato de magnesio y mezclas de los mismos .

De acuerdo a la presente invención el medio de alimentación puede comprender ingredientes (gm/1) , glucosa dentro de un intervalo de 100-500, sulfato de magnesio dentro de un intervalo de 1-7.5, Hy-soja dentro de un intervalo de 40 a 150, extracto de levadura dentro de un intervalo de 5 a 50, clorhidrato de tiamina dentro de un intervalo de 0.002-0.005, cisteína dentro de un intervalo de 0.2 a 0.5, cloruro de calcio dentro de un intervalo de 0.2 a 0.5.

También, el medio de alimentación puede comprender los ingredientes (gm/1) , glucosa dentro de un intervalo de 100-500, extracto de levadura dentro de un intervalo de 5 a 50, clorhidrato de tiamina dentro de un intervalo de 0.002 a 0.005, cisteína dentro de un intervalo de 0.2 a 0.5, cloruro de calcio dentro de un intervalo de 0.2 a 0.5.

Alternativamente, el medio de alimentación puede comprender los ingredientes (gm/1) , de glucosa dentro de un intervalo de 100 a 500, sulfato de magnesio dentro de un intervalo de 0.5 a 7.5, Hy-soja dentro de un intervalo de 40-150 y extracto de levadura dentro de un intervalo de 5 a 50.

Una modalidad preferida de la presente invención es aquella en el que el medio de alimentación puede comprender los ingredientes (gm/1) , de glucosa dentro de un intervalo de 100 a 200, sulfato de magnesio dentro de un intervalo de 1 a 3, Hy-Soja dentro de un intervalo de 50 a 150 y extracto de levadura dentro de un intervalo de 15 a 15.

De acuerdo a la presente invención, el nuevo proceso de lote alimentado puede ser utilizado para preparar las poliosas capsulares seleccionadas del grupo que consiste de Escherichia coli, Francisella tularensis, Haemophilus influenzae, Klebsiella, Moraxella catarrhalis, Neisseria meningitidis grupos A, C, W135 Y y X, Porphyromonas gingivalis, Pseudomonas aeruginosa, Burkholderia cepacia, Salmonella typphi, Salmonella typhimurium, Salmonella paratyphi, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri , Shigella sonnei, Vibrio cholera, Esterococcis faecalis, Enterococcus faecium, Streptocuccus del Grupo A, Streptococcus del Grupo B, Mycobacterium tuberculosis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis y Streptococcus pneumoniae.

EJEMPLOS Ej emplo 1 Evaluación del Método de alimentación para la optimización del desarrollo del lote alimentado para S. Pneumoniae Serotipo 1: Diferentes métodos de alimentación fueron evaluados para la alimentación. El método DO-stat no fue aplicable para la fermentación de S. Pneumoniae . Ya que S. Pneumoniae es una bacteria microaerofílica únicamente fue requerida aireación superficial durante el proceso de fermentación. Después del crecimiento parcial de S. Pneumoniae en el termentador durante la fermentación en el modo por lotes, el oxígeno disuelto estuvo alrededor de cero.

Cinco diferentes métodos de alimentación fueron intentados para la fermentación por lote alimentado. 1. Método de pH stat : La alimentación de pH stat fue controlada por un punto de ajuste del pH en donde, cuando el pH del cultivo se eleva por arriba del pH establecido, la fuente de carbono fue agregada al medio y cuando el pH del cultivo cae por debajo del pH establecido, la alimentación del carbono se detiene. 2. Método de alimentación a velocidad constante: En este método, 1 litro de alimentación concentrada se administró a 4.2 ml/m por 4 horas en 1.6 litros de medio de cultivo . 3. Método de alimentación exponencial: La velocidad de alimentación puede ser iniciada con 1 ml/m e incrementada con la OD. La velocidad de alimentación fue incrementada por 0.5 ml/m para el incremento de una unidad en la OD. 4. Concentración constante de glucosa: se intentó mantener la concentración de glucosa residual alrededor de 0.5 g/1 durante la fermentación de lote alimentado. 5. El método de alimentación dependiente del pH: En este método el pH fue mantenido con carbonato de sodio. La glucosa fue agregada por la glucosa agotada en el medio a una velocidad de modo que el carbonato de sodio fue alimentado en el medio para mantener el pH.

El termentador NBS Bioflo 115 y Bioengineering AG fue utilizado para todos estos experimentos. El presente estudio fue llevado a cabo en el modelo de termentador NBS Bioflo 115 de 3 Litros y éste fue elevado de escala a un Fermentador Bioengineering AG de 30 Litros. El aumento de escala adicional pudo ser llevado a cabo en el fermentador Bioengineering de 450L. Se utilizaron 200 gramo/litro de glucosa y 5 gramo/litro de sulfato de magnesio como los medios de alimentación para toda la fermentación por lote alimentado. La condición de fermentación fue la misma para todos los experimentos de lote alimentado. El pH fue mantenido con solución al 20 % de carbonato de sodio durante el proceso de fermentación.

Los siguientes parámetros fueron mantenidos durante la fermentación por lote alimentado. Temperatura (36.5 ± 0.5). pH (7.1 ± 0.2), RPM-100, Airflow (aireación superficial) -0.5 wm.

Tabla 1: Rendimiento de CP del serotipo 1 para diferentes métodos de alimentación Ejemplo 2 Optimización del medio de alimentación para la fermentación por lote alimentado de S. Pneumoniae Serotipo 1 CP Se utilizaron los siguientes medios diferentes para la alimentación durante la fermentación: 1. Glucosa - 200 g/1 2. Glucosa (200 g /l) , MgS04 (2.5 g/1) 3. Glucosa - 200 g/1, MgS04 - 2.5 g/1, Extracto de levadura - 25 g/1. 4. Glucosa - 100 g/1, gS04 - 5 g/1, Extracto de levadura - 15 g/1 Hy-soja - 50 g/1 5. Glucosa - 200 g/1, MgS04 - 2.5 g/1, Extracto de levadura - 25 g/1 Hy-soja - 100 g/1 6. Glucosa - 200 g/1, MgS0 - 2.5 g/1, Extracto de levadura - 25 g/1 Hy-soja - 100 g/1 Clorhidrato de tiamina 0.02 g/1, cloruro de calcio bihidratado - 0.02 g/1, Cisteína - 0.2 g/1. 7. Glucosa - 100 g/1, MgS04 - 1 g/1, Extracto de levadura - 10 g/1 Hy-soja - 40 g/1 Clorhidrato de tiamina -0.04 g/1, cloruro de calcio bihidratado - 0.04 g/1, Cisteína - 0.4 g/1 Todas las condiciones de fermentación fueron mantenidas como se mencionó anteriormente. El método de alimentación dependiente del pH fue utilizado para la fermentación por lote alimentado, alimentando todos los lotes. El 4o medio de alimentación fue utilizado para los experimentos de lote alimentado, adicionales.

Tabla 2 : Rendimiento de CP del serotipo 1 para diferentes composiciones del medio de alimentación Ejemplo 3 La mezcla de álcali utilizada para mantener el pH El hidróxido de sodio aumentó adicionalmente la productividad de CP cuando se utilizó con carbonato de sodio como la mezcla para mantener el pH. Únicamente el carbonato de sodio proporcionó el medio adecuado para el crecimiento cuando éste fue utilizado para mantener el pH. La condición limitante del carbonato de sodio fue la provisión de una condición de agresión o estrés para elaborar la CP. Cuando la mezcla de hidróxido de sodio y carbonato de sodio fue utilizada para mantener el pH, el crecimiento fue menor pero la productividad de CP se incrementó. El hidróxido de sodio al 8 % y el carbonato de sodio al 20 % fueron utilizados en la proporción de 1:1, 2:1, 3:1 y 4:1. La composición 3 del medio de alimentación en el ejemplo 2 fue utilizada como la alimentación para los siguientes lotes alimentados.

Tabla 3: La mezcla de álcali utilizada para mantener el pH para la fermentación por lote alimentado de S. Pneumoniae Serotipo 1 Ejemplo 4 Diferentes serotipos de S. Pneumoniae fueron intentados con la condición de lote alimentado, optimizada.

Para el serotipo 1, se utilizaron las condiciones de lote alimentado para otro serotipo también. La siguiente condición fue tomada en consideración corriendo la fermentación por lote alimentado. 1. El método de alimentación dependiente del pH 2. La mezcla de álcali utilizado 3. El medio de alimentación optimizado 4. Otras fermentaciones fueron similares como se mencionó anteriormente.

Los serotipos 1, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 19A, 19F y 23F fueron utilizados empleando nuevas condiciones optimizadas del proceso de lote alimentado.

Tabla 4: Rendimiento de CP en la fermentación por lote alimentado para diferentes serotipos De este método, el método de lote alimentado de la presente invención da como resultado incremento volumétrico en el rendimiento de CP en el intervalo de 150 a 350 %, en donde el rendimiento de CP final está en el intervalo de 900 y 2000 mg/1.

Será evidente para aquellos expertos en la técnica que la invención no está limitada a los detalles de los ejemplos ilustrativos anteriores, y que la presente invención puede ser ejemplificada en otras formas específicas sin apartarse de los atributos esenciales de la misma, y por lo tanto se desea que las presentes modalidades y los ejemplos sean considerados en todos los aspectos como ilustrativos y no restrictivos, haciéndose referencia a las reivindicaciones anexas, en vez de a la descripción anterior, y todos los cambios que entren dentro del significado e intervalo de equivalencia de las reivindicaciones se pretende por lo tanto que sean abarcados en la presente.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (17)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Un método para cultivar bacterias capsuladas para la producción volumétrica mayor de poliosas capsulares (CP) , caracterizado porque comprende (a) proporcionar un inoculo de una cepa de las bacterias que expresan la CP; (b) cultivar la cepa mediante fermentación a pH 7.2, en donde la velocidad de adición del medio de alimentación es equivalente a la velocidad de adición de la mezcla de álcali para mantener un pH preestablecido; c) fermentar el medio de cultivo a 35-38°C bajo agitación a 50-150 (RPM) con una velocidad de flujo de aire de 0.1-0.5 wm.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las bacterias son desarrolladas en el cultivo de lote alimentado.

3. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el incremento volumétrico en el rendimiento de la CP por el cultivo de lote alimentado es entre 150 a 400%, en comparación a las condiciones de cultivo por lotes o continuo.

4. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el rendimiento de la CP por el lote alimentado está entre 900 mg/litro y 2000 mg/litro.

5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el medio de alimentación puede comprender al menos una de una fuente de carbono, al menos una fuente de nitrógeno, al menos una sal y al menos un aminoácido.

6. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la fuente de carbono es glucosa.

7. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la fuente de nitrógeno consiste de tres o menos de la siguiente lista: autolisados de levadura, bases de nitrógeno de levadura, peptonas, triptona, casaminoácidos , harina de soja, Hy-Soja, extracto de levadura y caldo de soja tripticaseína .

8. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la sal puede ser seleccionada de sulfato de potasio, cloruro de calcio, cloruro de magnesio, sulfato de magnesio y mezclas de los mismos.

9. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el medio de alimentación puede comprender los ingredientes (gramo/litro) , de glucosa dentro de un intervalo de 100 a 500, sulfato de magnesio dentro de un intervalo de 1 - 7.5, Hy-Soja dentro de un intervalo de 40 a 150, extracto de levadura dentro de un intervalo de 5 a 50, Clorhidrato de tiamina dentro de un intervalo de 0.002 a 0.005, cisteína dentro de un intervalo de 0.2 - 0.5, cloruro de calcio dentro de un intervalo de 0.2 a 0.5.

10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el medio de alimentación puede comprender los ingredientes (gramo/litro) de glucosa dentro de un intervalo de 100 a 500, sulfato de magnesio dentro de un intervalo de 5 a 50, clorhidrato de tiamina dentro de un intervalo de 0.002 a 0.005, cisteína dentro de un intervalo de 0.2 - 0.5, cloruro de calcio dentro de un intervalo de 0.2 a 0.5.

11. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el medio de alimentación puede comprender los ingredientes (gramo/litro) de glucosa dentro de un intervalo de 100 a 200, sulfato de magnesio dentro de un intervalo de 1 a 3 , Hy-soja dentro de un intervalo de 50 -150, y extracto de levadura dentro de un intervalo de 15-25.

12. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la mezcla de álcali contiene al menos dos bases seleccionadas del grupo que consiste de hidróxido de sodio, carbonato de sodio, bicarbonato de sodio, hidróxido de potasio, carbonato de potasio e hidróxido de calcio.

13. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque una proporción designada del hidróxido de calcio y del carbonato de sodio es seleccionada para lograr una más alta producción volumétrica de CP.

14. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque la proporción está entre 1:4 y 4:1.

15. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque la concentración del hidróxido de sodio está entre 1.5 y 3.0 M.

16. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque la concentración del carbonato de sodio está entre 10 y 20 % (p/v) .

17. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la bacteria se selecciona de Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Staphylococcus aureus, Haemophilus influenzae, Streptococcus del Grupo A y Streptococcus del Grupo B.