CN117363542A - 一种用于高密度培养酒酒球菌的半合成培养基及其制备方法 - Google Patents

一种用于高密度培养酒酒球菌的半合成培养基及其制备方法 Download PDF

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刘树文
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Abstract

本发明涉及微生物发酵工程技术领域，具体涉及一种用于高密度培养酒酒球菌的半合成培养基及其制备方法。为了提高难培养葡萄酒乳酸菌‑酒酒球菌的生物量，本发明在传统ATB培养基的基础上，对酒酒球菌培养基进行了优化改良，采用L‑苹果酸和果糖两种营养物质来替代成分不明确且不稳定的番茄汁组分，并新增了微生物来源的可利用度更高的酵母蛋白胨组分，并对剩余组分的配比进行了细致地优化，本发明培养基用于培养酒酒球菌活菌数可达（7.82±0.06）×109 CFU/mL，相比传统ATB培养基提高了2.1倍。此外，发明人基于此优化改良的培养基对酒酒球菌高密度培养方法进行了优化，最终使得酒酒球菌的活菌数能够达到（2.25±0.27）×1010 CFU/mL，本发明培养基具有配制简便，配方成本低，质量稳定性高，普适性强等优点，可用于酒酒球菌常规培养及高密度培养。

Description

一种用于高密度培养酒酒球菌的半合成培养基及其制备方法
技术领域
本发明属于微生物发酵工程技术领域，具体涉及一种用于高密度培养酒酒球菌的半合成培养基及其制备方法。
背景技术
酒酒球菌主导的苹果酸-乳酸发酵(malolactic fermentation，MLF)是大多数红葡萄酒和少数白葡萄酒在酒精发酵(alcoholic fermentation，AF)后的重要工艺环节，该过程可降低葡萄酒酸度、增加香气复杂度、改善葡萄酒酸涩口感、增强葡萄酒微生物稳定性，进而提高葡萄酒的质量。依靠酿酒环境中存在的乳酸菌进行的自发MLF通常较难控制，一些情况下，甚至无法正常启动发酵，并且一旦其他的细菌(如片球菌属等)成为发酵过程的主导菌，还会给葡萄酒带来不愉悦的香气、过高的挥发酸和生物胺等。因此，接种高活性、高活菌数的商业发酵剂是保障MLF顺利启动完成的关键。
随着我国葡萄酒产业的不断发展，对本土优质葡萄酒的需求不断提升，我国葡萄酒企业对优质酒酒球菌发酵剂的需求也越来越大，然而目前我国葡萄酒企业使用的酒酒球菌发酵剂严重依赖进口，对本土发酵剂的开发缓慢，缺乏本土优良酒酒球菌发酵剂，导致我国葡萄酒同质化严重、本土风格不突出。
乳酸菌菌株的高密度细胞培养是生产直接大规模发酵剂的关键步骤，也是工业规模的关键挑战。乳酸菌高密度培养可以通过较低的培养体积和较短的培养周期获得较高的菌体密度，提高发酵速度和发酵效果，应用于生产实践中能够减少后续发酵剂的使用量，并控制设备投资，降低生产成本。在高密度培养中，乳酸菌菌体的生长代谢活动不仅与菌株自身的特异性有关，还与培养体系的底物组成、培养的条件和菌体自身的代谢产物有关，这些都可能成为限制因素影响菌体高密度培养。目前主要采用酸番茄汁(ATB)培养基来培养酒酒球菌，而ATB培养基中必不可少的不透明新鲜番茄汁由于批次间不稳定，组成成分复杂，元素不固定，制备繁琐，成为了高密度培养并且制备酒酒球菌发酵剂的一大难题。
因此，研发出组分透明，配制简便，能够取代传统ATB培养基大幅提高酒酒球菌菌体培养密度的培养基，扩大菌株的培养，解决制备菌株发酵剂的种种难关，开发本土优良菌株的优质发酵剂迫在眉睫，已成为国内科研人员亟须完成的任务。
发明内容
有鉴于此，本发明为解决传统ATB培养基不同批次差异性大、制作不易、并且不易保存的问题，提供一种酒酒球菌高密度培养的培养基及其制备方法。
本发明为解决上述提出的问题所采用的技术方案为：一种用于高密度培养酒酒球菌的半合成培养基，其特征在于：所述培养基由以下组分组成：果糖12-15g/L、葡萄糖25-30g/L、酵母浸粉7-12g/L、酵母蛋白胨8-13g/L、硫酸镁0.1-0.4g/L、硫酸锰0.02-0.07g/L、L-半胱氨酸盐酸盐0.1-0.5g/L、L-苹果酸3-5g/L。
一种用于高密度培养酒酒球菌的半合成培养基的制备方法，其特征在于：
将上述果糖、葡萄糖、酵母浸粉、酵母蛋白胨、硫酸镁、硫酸锰、L-半胱氨酸盐酸盐、L-苹果酸加入蒸馏水中，超声溶解至澄清溶液，用蒸馏水进行定容，调节pH值至4.8-5.1，将培养基分装入清洗干净的三角瓶内，包上封口膜，包扎好，115℃高压灭菌20min。
进一步，pH调节采用NaOH或HCl。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
1、本发明培养基配方中通过增加一定量的果糖，酵母蛋白胨，L-苹果酸几项营养成分，代替番茄汁这一不稳定、不透明组分，克服传统配方的局限性，增加促生长因子，尽可能的将所培养的菌体密度提高到最大化，大幅提高了生产效率。
2、本发明半合成培养基组分透明、配制简单便捷效率高，适用于培养基的酒酒球菌高密度培养的最适条件，为后续苹果酸-乳酸发酵剂工业化生产提供理论和应用依据。
3、本发明具有普适性强的优点，适用于多数酒酒球菌的培养，且培养量均高于采用ATB培养基进行培养。
4、本发明半合成培养基能够实现高密度培养的目的，进行高密度培养时，活菌数在稳定期达到(2.25±0.27)×1010CFU/mL，是传统ATB培养基提高了5.59倍。
5、本发明大大降低目前依赖进口培养基的现状，而且培养基所需成本低，能够有效降低企业生产成本。
附图说明
图1为不同碳源对酒酒球菌SD-2a生长的影响；
图2为果糖和葡萄糖不同比例对酒酒球菌SD-2a生长的影响；
图3为不同氮源对酒酒球菌SD-2a生长的影响；
图4为酵母浸粉和酵母蛋白胨不同比例对酒酒球菌SD-2a生长的影响；
图5为Mg2+对酒酒球菌SD-2a生长的影响；
图6为Mn2+对酒酒球菌SD-2a生长的影响；
图7为L-苹果酸对酒酒球菌SD-2a生长的影响；
图8为L-半胱氨酸盐酸盐对酒酒球菌SD-2a生长的影响；
图9为响应面等高线和交互3D图；其中，
(A)为碳源添加量和氮源添加量的3D交互图；
(B)为碳源添加量和L-苹果酸添加量的3D交互图；
(C)为氮源添加量和L-苹果酸添加量的3D交互图；
(D)为碳源添加量和氮源添加量的等高线图；
(E)为碳源添加量和L-苹果酸添加量的等高线图；
(F)为氮源添加量和L-苹果酸添加量的等高线图；
图10为不同酒酒球菌在ATB培养基和该半合成培养基中的生长曲线；其中，
(A)酒酒球菌SD-2d；
(B)酒酒球菌HB-2b；
(C)酒酒球菌NX-4f；
(D)酒酒球菌XY22-3；
(E)酒酒球菌40B-13；
(F)酒酒球菌144-46；
(G)酒酒球菌b1；
(H)酒酒球菌31-DH；
图11为不同接种量对酒酒球菌SD-2a生长的影响；
图12为不同温度对酒酒球菌SD-2a生长的影响；
图13为不同初始pH对酒酒球菌SD-2a生长的影响；
图14为恒pH值对酒酒球菌SD-2a生长的影响；
图15为酒酒球菌SD-2a培养过程中残糖浓度和菌体密度变化曲线；
图16为补碳量对酒酒球菌SD-2a生长的影响；
图17为不同碳氮比对酒酒球菌SD-2a生长的影响；
图18为发酵罐高密度培养下酒酒球菌SD-2a的生长状况；
图19为不同培养基类型对酒酒球菌SD-2a生长的影。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明不仅仅局限于下面的实施例。
本发明培养基的研制过程：培养基的配方包括如下组分：如图1所示，在不同种类的碳源(果糖，葡萄糖，阿拉伯糖，半乳糖，核糖，蔗糖，木糖，甘露糖)中以10g/L的添加量选择最适的碳源，如图3所示，在不同种类的氮源中：植物类氮源(大豆蛋白胨)、动物类氮源(牛肉浸粉、蛋白胨、胰蛋白胨、酪蛋白胨)、微生物类氮源(酵母浸粉、酵母蛋白胨)中分别以15g/L的添加量筛选出最适氮源，其余组分暂时保持不变，微量元素添加量：硫酸镁设置为0.2g/L、硫酸锰分别设置为0.05g/L，促生长因子的添加量：L-半胱氨酸盐酸盐设置为0.5g/L、L-苹果酸设置为5g/L。
经过优选的实施方式，所述培养基的配方包括如下组分：如图2，图4所示，选用对菌体吸收有利得果糖和葡萄糖作为碳源，酵母浸粉和酵母蛋白胨作为氮源，但对具体果糖和葡萄糖的比例(1:1，1:2，2:1，1:3，3:1)，酵母浸粉和酵母蛋白胨的比例(1:1，1:2，2:1，1:3，3:1)，以及碳氮总量(20-80g/L)和碳氮比(3:1，2:1，1:1，1:2，1:3)还需要进一步优化，如图5，图6所示，微量元素：硫酸镁0-1.0g/L，硫酸锰0-0.11g/L，如图7，图8所示，生长因子：L-半胱氨酸盐酸盐0-1.1g/L，L-苹果酸0-8g/L，在确定一种组分的含量时，其余组分含量均保持为初始值。
作为一种更为优选的实施方式，所述培养基的配方包括如下组分：碳源：果糖13.33g/L、葡萄糖26.67g/L，氮源：酵母浸粉10g/L、酵母蛋白胨10g/L，微量元素：硫酸镁0.2g/L，硫酸锰0.05g/L，
生长因子：L-半胱氨酸盐酸盐0.3g/L，L-苹果酸4g/L。
为了进一步优化培养基成分，根据单因素的优化结果，选出了对菌株生长影响最为显著的三个因素碳源、氮源和L-苹果酸，如图9所示，采用CCD试验设计法以及响应面曲面分析法，所述培养基的配方包括如下组分：碳源：果糖13.57g/L，葡萄糖27.13g/L，氮源：酵母浸粉9.67g/L，酵母蛋白胨9.67g/L，微量元素：硫酸镁0.2g/L，硫酸锰0.05g/L，生长因子：L-半胱氨酸盐酸盐0.3g/L，L-苹果酸3.314g/L。
如图10所示，为了说明该培养基的普适性，发明人通过对菌株库中随机挑选野生型、诱变型以及商业菌共6株酒酒球菌采用该培养基进行培养，所测定的酒酒球菌在该培养基中生长状况均为良好。
如图11-13所示，优选的，该发明培养基静态培养酒酒球菌的条件为：5％的接种量，温度为26℃，初始pH为4.8，厌氧培养。
如图14-17所示，进一步优选的，该发明培养基高密度培养酒酒球菌的条件为：设置恒定的pH值范围为4.8-5.1，确定108h为补料的时间节点，采取分批补料的方式，在补料时间节点通过流加20g/L碳源(葡萄糖与果糖2﹕1)和2g/L的氮源(酵母浸粉与酵母蛋白胨1﹕1)。
配制方法：将复合培养基各组分加入水中，超声溶解至澄清溶液，调节pH值为4.8，115℃高压灭菌15min。
实施例一：
一种用于高密度培养酒酒球菌的半合成培养基，由以下组分组成：果糖12g/L、葡萄糖25g/L、酵母浸粉7g/L、酵母蛋白胨8g/L、硫酸镁0.1g/L、硫酸锰0.02g/L、L-半胱氨酸盐酸盐0.1g/L、L-苹果酸3g/L。
上述培养基的制备方法为：
称取上述配方加入少量蒸馏水中，超声溶解至澄清溶液，用蒸馏水进行定容，通过2M的NaOH或HCl调节pH值至4.8-5.1，将培养基分装入清洗干净的三角瓶内，包上封口膜，包扎好，115℃高压灭菌20min。
实施例二：
一种用于高密度培养酒酒球菌的半合成培养基，由以下组分组成：果糖13.57g/L、葡萄糖27.13g/L、酵母浸粉9.67g/L、酵母蛋白胨9.67g/L、硫酸镁0.2g/L、硫酸锰0.05g/L、L-半胱氨酸盐酸盐0.3g/L、L-苹果酸3.314g/L。
制备方法同上。
实施例三：
一种用于高密度培养酒酒球菌的半合成培养基，由以下组分组成：果糖15g/L、葡萄糖30g/L、酵母浸粉12g/L、酵母蛋白胨13g/L、硫酸镁0.4g/L、硫酸锰0.07g/L、L-半胱氨酸盐酸盐0.5g/L、L-苹果酸5g/L。
制备方法同上。
本发明的复合培养基各成分作用原理如下：
果糖，葡萄糖：提供碳源；
酵母浸粉，酵母蛋白胨：提供氮源，维生素和氨基酸；
L-苹果酸：提供碳源，低pH环境，产生质子动力；
L-半胱氨酸盐酸盐：防御有害物质和增加活力的一种氨基酸；
硫酸镁，硫酸锰：促生长因子，可作用于微生物细胞膜某受体，使休眠状态的菌落迅速感知外界适宜的生长环境，快速生长；
液体培养基的配方如下表1所示：
表1培养基的组分及含量
培养基的配制方法如下(以配制1L培养基为例)：
S1、将表1中的组分按照表1中的量进行称量，加入少量蒸馏水并超声促进溶解，混匀，用蒸馏水定容至1L，待所有试剂溶解后，用2M的HCl调pH至4.8；将培养基分装入清洗干净的三角瓶内，包上封口膜，包扎好，115℃灭菌20min。
所配制的培养基应置于阴凉干燥处保存，保存期为2个月。
标准菌株验证
使用酒酒球菌SD-2a进行标准验证，以2％的接种量接入表1中所有的培养基中，在26℃下恒温培养菌体生长至稳定期。为了评价本发明培养基与其他培养基对酒酒球菌生长的影响，本发明采用吸光值菌密度检测法，将培养液以空白培养基调零，稀释2-10倍后测定该培养液于600nm下的吸光值，该值为菌密度值，菌株活菌数测定方法采用稀释涂布平板法计算活菌数。稳定期的菌体量对比情况如表2所示：
表2：酒酒球菌SD-2a在ATB培养基与本发明培养基上的生长情况
编号 培养基 菌体密度(OD600)
1 ATB培养基 1.85
2 半合成单因素优化培养基 2.04
3 半合成碳氮含量及比例优化培养基 3.15
4 实施例二半合成响应面优化培养基 3.90
实验结果：如图8及图19所示，酒酒球菌SD-2a在本发明培养基中培养达到稳定期时的菌体密度均大于在ATB培养基中培养的菌体密度；经过两次对本发明培养基成分含量的优化，在其中培养的酒酒球菌SD-2a在达到稳定期的菌体密度均有所提升。说明经过配比优化本发明培养基成分及含量非常适合于酒酒球菌生长。
多种菌株验证
为了说明实施例二培养基的普适性，通过对菌株库中随机挑选野生型、诱变型以及商业菌共8株酒酒球菌，对本发明优化过的培养基进行标准验证，接种量为2％，26℃恒温静置培养，以ATB培养基为对照组，测定达到稳定期时的活菌数，进行比较分析，结果如表3所示。
表3：不同酒酒球菌在ATB培养基与本发明培养基中的生长情况
结果分析：在该发明培养基中所有菌株较ATB培养基活菌数均有不同程度的提高，表明该优化培养对酒酒球菌菌株促生长作用明显，且具有普适性。与此同时，不同菌株之间增殖效果具有较为明显的不同，可能是由于不同菌株对营养物质的需求有差异。该发明培养基能为不同酒酒球菌提供较为良好的生长代谢营养环境，可起到增殖作用，同时该培养基具有良好普适性，可达到代替ATB培养基的目的。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干改进和变换，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种用于高密度培养酒酒球菌的半合成培养基，其特征在于：所述培养基由以下组分组成：果糖 12-15 g/L、葡萄糖25-30 g/L、酵母浸粉 7-12 g/L、酵母蛋白胨 8-13 g/L、硫酸镁 0.1-0.4 g/L、硫酸锰0.02-0.07 g/L、L-半胱氨酸盐酸盐 0.1-0.5 g/L、L-苹果酸3-5g/L。
2.根据权利要求1所述的一种用于高密度培养酒酒球菌的半合成培养基的制备方法，其特征在于：
将上述果糖、葡萄糖、酵母浸粉、酵母蛋白胨、硫酸镁、硫酸锰、 L-半胱氨酸盐酸盐、L-苹果酸加入蒸馏水中，超声溶解至澄清溶液，用蒸馏水进行定容，调节pH值至4.8-5.1，将培养基分装入清洗干净的三角瓶内，包上封口膜，包扎好，115℃高压灭菌20 min。
3.根据权利要求2所述的一种用于高密度培养酒酒球菌的半合成培养基的制备方法，所述的pH调节采用 NaOH或HCl。
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