SU1449579A1 - Питательна среда дл выращивани АRтнRовастеR LUтеUS - продуцента рестриктазы AI и I - Google Patents

Description

(21) 4194876/28-13 (22) 13,02.87 (46) 07.01.89. Бкш. № 1

(71)Научно-производственное объединение Биолар и Всесоюзный научно- исследовательский институт молекул рной биологии

(72)Ю.Н.Бойков, В.Е.Репин, Н.А.Лож- ко, З.А. Виестуре и М.Я.Хейслере (53) 577.15(088.8)

.(56) Авторское свидетельство СССР № 1095642, кл. С 12 N 9/14, 1982.

Qreeh P.J., Heyneker H.L., Bolivar F. et. al. A generate method for the purification of restriction enzymes .- J. Nucl. Ac. Res. 1978, 5, № 7, p. 2373-2380.

(54) ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫРАП|И- ВАНИЯ ARTHROBACTER LUTEUS - ПРОДУ ЦЕНТА РЕСТРИКТАЗЫ Alul (57) Изобретение относитс  к биотехнологии , касаетс  состава питательных сред дл  выращивани  Arthrobac- ter luteus - продуцента рестриктазы Alul. Целью изобретени   вл етс  повышение выхода рестриктазы Alul и удешевление целевого продукта. Изобретение заключаетс  в том, что питательна  среда содержит в качестве источников аминного азота, витаминов и микроэлементов белковый гидролизат из рыбных отходов в количестве 45- 50 г/л, что обеспечивает создание высокоэффективной, питательной среды, в которой созданы услови  накоплени  рестриктазной активности и роста Arthrobacter luteus. Выход рестриктазы Alul возрастает до 10000- 15000 ед/г биомассы. 2 табл.

о 6

(Л

4 4 СЛ Kj

Изобретение относитс  к биотехно- лоЫи и касаетс  состава питательных дл  выращивани  Arthrob cter luteus - продуцента рестриктазы Alul

Цель изобретени  - повышение выхода рестриктазы Alul и удешевление целевого продукта.

Изобретение предусматривает ис. по|пьзование белкового гидролизата по|пученного из. отходов трески (голова и внутренности). В мозгу трески содержитс  7-9% белка от свежей ткани , в селезенках - 17-18%, почках - 16-17%, сердце - 16-18%. Кроме того, указанные отходы богаты витаминами (Bjy.-. , фолиевой кислотой, параамино- бе|нзойной кислотой, биотином), которые необходимы дл  нормального раз- бактерий.

Предлагаемое техническое решение

об

гспечивает повьшгение выхода рестэиктазы Alul с 80 ед/г биомассы до ЮРОО-15000 ед/г биомассы.

Морфологически Arthrobacter luteus 25

ыо

врем  развити  претерпевает изме

, т.е. молода  культура имеет фо|рму папочек, которые по мере обед- не|ни  среды питательными веществами и Обогащени  продуктами метаболизма постепенно переход т в форму кокков. Ко|ккообразные клетки Arthrobacter luteus прекращают биосинтез рестрик- тары Alu 1 . Введение в питательную среду белкового гидролизата из рыбны отходов способствует продлению лога- ритмической фазы роста и предотвращает раннее старение культуры.

I рН белкового гидролизата из рыб- Hbjx отходов 7,2-7,4. При растворении ег|о в воде рН не мен етс . Оптималь- нь|м рН дл  Arthrobacter luteus  вл емс  значение 7,2-7,4. Таким образом от падает необходимость при приготовлении питательной среды добавл ть 1 слоты или щелочи, которые отрицательно вли ют на биосинте рестриктазы Alu 1.

Пример 1. Питательна  среда

содержит, г/Л

Белковый гидролизат из рыбных отходов, полученных при переработке трески 50,0 Глицерин4,О

Вода, лДо 1,О

Культуру А. luteus ВКПМ-3670 предва|рительно адаптируют на сухом пита

0

0

5

0

5

тельном агаре в чашках Петри при 35- 37 С в течение 16-18 ч.

Инокул т готов т, пересева  культуру бактериологической петлей в ка- чалочные колбы (250 мл питательной среды данного состава в каждой) и размножают в услови х аэрации при 35-37°С в течение 14-16 ч. Посевной материал готов т из расчета 5% по отношению к объему питательной среды, загруженной в ферментатор.

Ферментацию культуры провод т на данной питательной среде при 35-37 с, при подаче воздуха 1 объем воздуха: :1 объем питательной среды, перемешивании 200-250 об/мин. Выращивают до оптической плотности суспензии клеток 0,9-1,2 опт. ед. (ФЭК, 550 нм, кювета 0,5 см), что соответствует поздней логарифмической фазе (по калибровочной кривой),

Выход биомассы 9,0 г/л культураль- ной жидкости.

Выделение фермента можно проводить двум  методами.

Метод 1. 10 г биомассы бактерий Arthrobacter luteus ВКПМ В-3670 размораживают и суспендируют в 20 мл рабочего буфера (0,01 М трис-НС1, рН 7,,6; 0,01 М 2 меркаптоэтанол),

К 30 МП суспензии добавл ют 5 мл 8%-ного раствора  ичного масла в толуоле . Отношение  ичного масла к толуолу 1,,0. Во врем  разрушени  клеток температуру сз спензии поддерживают на уровне С. Обрабатьюают суспензию ультразвуком 5-10 с, 2- 3 раза.

Отработанную ультразвуком микробную массу .центрифугирзтот на центрифуге High .speed (10000...Х g, 30 мин).

После центрифугировани  отбирают водный слой и нанос т колонку с фос- фоцеллюлозой (V 40 см), уравновешенную рабочим буфером.

Фракции, содержащие рестриктазу Alul, подвергают дальнейшей очистке с помощью колоночной хроматографии на гепарин-сефарозе.

Активные фракции диализируют против 1 л диализной смеси в течение 12 ч..

I

Состав диализной смеси: глицерин

50%, трис-HCl 10 мМ, рН 7,4, КС1 50 мМ.

1449579

Дл  определени  активности рест- риктазы Alul используют метод электрофореза в геле.

За единицу активности рестриктазы Alul принимают количество фермента, достаточное , дл  полного расщеплени  1 мкг ДНК фага за 1 ч при 37°С. Выход рестриктазы Alu 150000 ед/

Глицерин

Вода, лДо

Выращивание биомассы. Адаптац культуры, инокул цию посевного м риала, ферментацию культуры пров аналогично примеру 1,

Выход биомассы 8,0 г/л культу ной жидкости, выход рестриктазы

4 о п j /

, - V-M, лчидлииги, ВЫХОД рестриктазы lnnT 15000 ед/ш1, выход 12500 ед/г биомассы, 100000 ед/л оиии ед/г бипм ггм.„,.„.л.

15000 ед/г биомассы.

Метод 2. Размороженную биомассу бактерий Arthrobacter luteus ВКПМ В-3670 (50 г) суспендируют в 100 мл 10 мМ трис-НС буфера, рН 7,2, содержащем 10 мМ 2-мерк-аптоэтанол, 1 мМ азид натри , 1 мМ трилон Б (буфер А) и довод т этим же буфером до объема 150 мл. К суспензии добавл ют 1,5 мп 10%-ного тритона Х-100 и 150 мг ли- аоцима. Лизис провод т 1 ч при посто нном перемешивании. Дальнейшее фракционирование лизата провод т в системе двухфазного разделени .

Полученный лизат добавл ют к смеси , состо щей из 37,0 мл 15%-ного водного раствора декстрана Т-500, 56 мл 30%-ного .. водного раствора полиэтилен гликол  и 35 мл 4,0 М хлористого натри  (рН смеси 6,5). Тщательно перемешивают в течение 15 мин и центрифугируют на центрифуге High speed (20000 х g, 20 мин). Верхнюю ПЭГ-фазу объемом 120 мл, содержащую фермент, отбирают, разбавл ют двукратным объемом буфера А, добавл ют тритон Х-100 (0,1%) и нанос т на колонку с фосфоцеллюлозой, уравновешенную буфером А, содержапщм 0,1%-ный тритон Х-100 (буфер Б). Фермент элюи- Q руют 0-1,0 М линейнь1М градиентом концентрации натри  хлористого в буфере Б. Фракции, содержащие рестриктазу Alul, концентрируют диализом против буфера Б, содержащего 55%-ный глицерин .

Выход рестриктазы Alul 525000/ /50 МП, активность 10500 ед/мл, выход рестриктазы Alul 10500 ед/г биомассы;

30

культуральной жидкости.

П р и М е р 3. Питательна  сре содержит, г/л:

Белковый гидролизат из 15- рыбных отходов, полученных при переработке трески45,0

Глицерин3 О

Вода, лДо

20 Выращивание биомассы. Адаптаци культуры, инокулдцию посевного ма риала, ферментацию культуры про во аналогично примеру 1.

Выход биомассы 7,0 г/л культур 25 ной жидкости, выход рестриктазы A 10000 ед/л биомассы, 700000 ед/л культзфальной жидкости.

П р и М. е р 4.(иллюстрирует за дельные значени  параметров). Пит тельна  среда содержит, г/л: Белковый гидролизат из рыбных отходов, получаемы при переработке трески 45 Глицерин2

Вода, лДо 1

Вьфащивание биомассы. Адаптацию культуры, инокул цию посевного мат риала, ферментацию культуры провод аналогично примеру 1.

Выход биомассы 3,0 г/л культура ной жидкости, выход,.рестриктазы Ai 5500 ед/г биомассы, 16500 ед/л кул туральной жидкости.

П р и М е р 5 (иллюстрирует зап 45 дельные значени  параметров). Пита тельна  среда содержит, г/л: Белковьш гидролизат из рыбных отходов, полученных при переработке трески Глицерин Вода, л

35

52,5 .5 До 1,

По данным электрофореза препарат фермента не содержит детектируемых . примесей неспецифических эндонуклеаз.

П р и М е р 2. Питательна  среда содержит, г/л:

Белковьй гидролизат из рыбных отходов, получен- .ных при переработке трески 47 5

Глицерин3 5 о

Вода, лДо До

Выращивание биомассы. Адаптацию культуры, инокул цию посевного материала , ферментацию культуры провод т аналогично примеру 1,

Выход биомассы 8,0 г/л культураль- ной жидкости, выход рестриктазы Alul

4 о п j /

лчидлииги, ВЫХОД рестриктазы 12500 ед/г биомассы, 100000 ед/л „,.„.л.

лчидлииги, ВЫХОД рестриктазы 12500 ед/г биомассы, 100000 ед/л „,.„.л.

Q

30

культуральной жидкости.

П р и М е р 3. Питательна  среда содержит, г/л:

Белковый гидролизат из 15- рыбных отходов, полученных при переработке трески45,0

Глицерин3 О

Вода, лДо

20 Выращивание биомассы. Адаптацию культуры, инокулдцию посевного материала , ферментацию культуры про воддт аналогично примеру 1.

Выход биомассы 7,0 г/л культураль- 25 ной жидкости, выход рестриктазы Alul 10000 ед/л биомассы, 700000 ед/л культзфальной жидкости.

П р и М. е р 4.(иллюстрирует запредельные значени  параметров). Питательна  среда содержит, г/л: Белковый гидролизат из рыбных отходов, получаемы при переработке трески 45,5 Глицерин2 5

Вода, лДо 1, о

Вьфащивание биомассы. Адаптацию культуры, инокул цию посевного материала , ферментацию культуры провод т аналогично примеру 1.

Выход биомассы 3,0 г/л культуральной жидкости, выход,.рестриктазы Aiul 5500 ед/г биомассы, 16500 ед/л культуральной жидкости.

П р и М е р 5 (иллюстрирует запре- 45 дельные значени  параметров). Питательна  среда содержит, г/л: Белковьш гидролизат из рыбных отходов, полученных при переработке трески Глицерин Вода, л

35

0

52,5 .5 До 1,0

Выращивание биомассы. Адаптацию gg культуры, инокул цию посевного материала , ферментацию культ.уры провод т аналогично примеру 1.

Выход биомассы 3,5 г/л культуральной жидкости, выход рестриктазы Alul,

lA

5000 ед/r биомассы, 17500 ед/л куль- тур|альной жрщкостй.

Данные выращивани  штаммов - продуцентов рестриктазы Alul на .предла- гаеИой питательной среде приведены в т|абл. 1.

Данные вьфащивани  штаммов - про- (гнтов рестриктазы Alu1 на известДУ .Ц ной таб.

i|i. 2.

Из табл. 1 И 2 видно, что при выращивании различных штаммов - прсду- цен

питательной среде приведены в

Claims (1)

1. РОВ рестриктазы Alul на предлагаемой питат(2льной среде происходит уве- 15 лич эние выхода . би-омассы и рестрик- тази по сравнению с результатами, по- лучгнными с использованием известной ср-еды. Формула изобретени  20

   Питательна  среда дл  выраа1ивани  Artl.robacter luteus - продуцента ре495796

   стриктазы Alul, содержаща  в качест-, ве источника углерода гтгицернн, источники аминного азота, витаминов, микроэлементов и воду, отличающа с  тем, что, с целью повышени  выхода рестриктазы Alul и удешевлени  целевого продукта, в питат тельную среду ввод т в качестве источников аминного азота, витаминов и микроэлементов белковый гидролизат из рыбных отходов, полученных при переработке трески, при следующем соотношении компонентов, г/л среды:

   10

   Белковый гидролизат из рыбных отходов, полученных при переработке трески45,0-50,0

   Глицерин . 3,0-4,0 .Вода, лДо 1,0

   Artihrobacter lu-Белковый гидролкг

   teuis ВКПМ В-3670зат из рыбных отIходов 45,0-50,0

   Artprobacter lu-Глицерин 3,0-4,0

   tevss ВКГШ В-1810Вода, до 1,0 д

   Artjhrobacter luteuis ВКПМ. В-1777

   Arthrobacter lu- Триптон 11,0 г/л teius ВКПМ В-3670 дрожжевой экстракт

   22,5 г/л

   Arthrobacter lu- 1М КдНР04 51 мл, tevs ВКШ- В-1810 1М 15,7 мл Arthrobacter lu- Глицерин 4,0 мл, tens ВКга-1 В-1777 Вода до 1,0 л

   ВНШШИ Заказ 6934/28

   Произв.-полигр. пр-тне, г. Ужгород, ул. Проектна , 4

   Белковый гидролизат из рыбных отходов, полученных при переработке трески45,0-50,0

   Глицерин . 3,0-4,0 .Вода, лДо 1,0

   Таблица 1

   10000- 15000

   70000- 135000

   7000-8000 28000- 40000

   3000-4000 12000- 20000

   Таблица2

   6300-7500 23625-33750 4000-5000 8000-12500 1500-2000 3000-5000

   Тираж 520 Подписное