FI84280B

FI84280B - Process for the submerged culture of Pseudomonas aeruginosa bacterial strains

Info

Publication number: FI84280B
Application number: FI863678A
Authority: FI
Inventors: Thomas C Montie; Friedrich Dorner; James L Mcdonel; Wolfgang Mundt
Original assignee: Immuno Ag
Priority date: 1985-01-14
Filing date: 1986-09-11
Publication date: 1991-07-31
Also published as: EP0211014B1; ES8706820A1; ES550832A0; AT384238B; DK421386D0; ATE56988T1; JPS62501330A; FI863678A; CA1273887A; WO1986004086A1; DK421386A; FI863678A0; DE3674502D1; CA1273887C; FI84280C; JPH07114690B2; EP0211014A1; ATA7385A

Abstract

Method for the immersed culture of Pseudomonas aeruginosa bacterial strains which produce H type antigens, wherein the culture is preferably carried out continuously in a synthetic aqueous medium containing a carbon source, mineral salts and a nitrogen source. As carbon source, a succinate or urea is used. The culture medium must be free of proteins and antigens. A bacterial biomass is obtained of which the physiological state remains constant throughout the culture and does not contain undesirable impurities such as degradation products from the medium.

Description

Menetelmä Pseudomonas aeruginosa-bakteerikantojen^A^j^öe-mlseksl submerssisestiMethod submersively for Pseudomonas aeruginosa bacterial strains

Keksinnön kohteena on menetelmä Pseudomonas aeruginosa-bak-teerikantojen viljelemiseksi submerssisesti eli pinnanalai-sesti Pseudomonadaceaen taksonomisesta heimosta.The invention relates to a method for submersively culturing Pseudomonas aeruginosa strains from the taxonomic family Pseudomonadaceae.

Pseudomonas aeruginosa-bakteeri on opportunistinen, patogeeninen taudinaiheuttaja, jota esiintyy usein sairaalainfektioissa, pääasiassa potilaissa, joilla on heikentynyt vastustuskyky, kuten palovammoista kärsivissä potilaissa, henkilöissä, jotka sairastavat kystistä fibroosia tai joilla on orgaanisia virhetoimintoja, ja syöpäpotilaissa. Antibiootit tehoavat vain rajoitetusti Pseudomonas-infektioihin resistenssin esiintymisen johdosta, mistä syystä pyritään käyttämään immunologisia menetelmiä Pseudomonas aeruginosan aiheuttamien infektioiden torjuntaan.Pseudomonas aeruginosa is an opportunistic, pathogenic pathogen that often occurs in nosocomial infections, mainly in patients with impaired immunity, such as patients with burns, people with cystic fibrosis, or those with organic malfunctions, and cancer. Antibiotics have only a limited effect due to the presence of resistance to Pseudomonas infections, which is why immunological methods are being used to control infections caused by Pseudomonas aeruginosa.

Infektioita voivat laukaista useat kannat, jotka tuottavat O-ryhmäantigeenejä ja H-antigeenejä. Ansorgin H-antigeeni-kaavion mukaisesti (Zbl. Bakt. Hyg. I. Abt. Orig. A 242, 228 - 238 (1978) käytettäessä epäsuoraa immunofluoresenssitek-niikkaa differentioidaan Pseudomonas aeruginosan kohdalla kompleksinen flagella-antigeeni a, jossa on osa-antigeenit ao/ ai, β2' a3* a4' 3a yhtenäinen flagella-antigeeni b. Osatekijät ao - 84 ovat itsenäisiä determinantteja, niin että tuloksena syntyy useita H-tyyppejä sisältävä flagellaarinen antigeenikaavio. O-ryhmillä ja H-tyypillä on vapaita yhdistelmiä .Infections can be triggered by several strains that produce O-group antigens and H-antigens. According to the Ansorg H-antigen diagram (Zbl. Bakt. Hyg. I. Abt. Orig. A 242, 228-238 (1978)), using indirect immunofluorescence techniques, a complex flagella antigen α with sub-antigens ao is differentiated at Pseudomonas aeruginosa. / ai, β2 'a3 * a4' 3a uniform flagella antigen b. The components ao to 84 are independent determinants, resulting in a flagellar antigen pattern containing multiple H-types, with O-groups and H-type having free combinations.

On jo tunnettua valmistaa Pseudomonas-infektioiden ennaltaehkäisemiseksi Pseudomonas-roketteita, jolloin lähtöaineina käytetään joko itse Pseudomonas aeruginosa-bakteerimassaa ja/tai viljelysuodoksia, joita saadaan kasvattamalla mikro-organismeja pintaviljelmissä tai submerssisesti kompleksisissa ravintoväliaineissa. Näissä kompleksisissa ravintovä-liaineissa on käytetty hiili- ja energialähteen (useimmiten hiilihydraattien) ja olennaisten ravintosuolojen lisäksi 2It is already known to prepare Pseudomonas vaccines for the prevention of Pseudomonas infections, using either Pseudomonas aeruginosa bacterial mass itself and / or culture filtrates obtained by growing microorganisms in surface cultures or submerged in complex nutrient media as starting materials. In addition to carbon and energy sources (mostly carbohydrates) and essential nutrient salts, these complex nutrients have been used in 2

8 4 2 S O8 4 2 S O

mitä erilaisimpia uutteita ja/tai eläin-, mikrobi- tai kas-viproteiinien hydrolysaatteja (niin kutsuttuja peptoneja). Tällaisten liuoksten täydennysaineiden tarkkaa koostumusta ei ole määritelty ja ne saattavat lisäksi vaihdella erästä toiseen. Ne sisältävät aminohappojen lisäksi myös epätäydel-lisesti hajaantuneita proteiiniosia ja niiden määrittelemättömiä komplekseja ja niiden oleellinen tehtävä on aminohappo- ja kasvuainetarpeen kattaminen. Viljelmän emäliuokset sisältävät tästä syystä aina runsaasti aineita, jotka eivät ole peräisin bakteereista, mikä on haitallista siksi, että Pseudomonas aeruginosan flagella(H)-antigeenin valmistamiseksi tarvitaan yhä useampia viljelyasteen mukaisesti säädettäviä erotusasteita, jotta flagella(H)-antigeeni voidaan vapauttaa mahdollisimman pitkälti ravintoväliaineesta peräisin olevista epäpuhtauksista.various extracts and / or hydrolysates of animal, microbial or plant proteins (so-called peptones). The exact composition of the excipients in such solutions has not been determined and may also vary from batch to batch. In addition to amino acids, they also contain incompletely degraded protein moieties and their undefined complexes, and their essential function is to cover the need for amino acids and growth agents. The culture broths therefore always contain a large amount of non-bacterial substances, which is detrimental because the production of Pseudomonas aeruginosa flagella (H) antigen requires an increasing number of culture-adjusted separation stages in order to release the flagella (H) antigen as much as possible from the nutrient medium. pollutants from.

Eräänä toisena tähänastisten erittäin suoritettavien viljelymenetelmien haittana on se, että bakteerit ovat alttiina jatkuvalle fysiologiselle muutokselle niiden inokulointi-ajankohdasta niiden viljelystä suoritettavaan erotushetkeen asti. Bakteeribiomassan tämän fysiologisen ja tästä syystä funktionaalisen differentoitumisen laukaiseva hetki johtuu itse solukasvusta ja ravintoväliaineen koostumuksen siten alunperin aiheutuneesta ajallisesta muutoksesta. Tämän spontaanin fysiologisen differentoitumisen näkyvä seuraus voidaan todeta yksinään jo "batch"-viljelmän kasvukäyrän erilaisissa vaiheissa. Toisaalta solumassan fysiologisen aktiviteetin ja toisaalta sen ympäristön välisen esitetyn suoran suhteen seurauksena liittyy siihen myös erilaisten intra- ja ekstrasellulääristen aineenvaihduntatuotteiden etusijalla oleva rikastuminen kasvuvaiheesta ja differentoitumisvai-heesta riippuen. "Batch"-viljelmän viljelyn emäliuokset sisältävät tästä syystä kaikkien ajallisesti yksittäisten differentoitumisvaiheiden aikana muodostuneiden aineenvaihduntatuotteiden integroidun seoksen.Another disadvantage of the highly performed culture methods to date is that the bacteria are subject to continuous physiological change from the time of their inoculation to the time of separation from their culture. The triggering moment for this physiological and therefore functional differentiation of bacterial biomass is due to the cell growth itself and thus to the initial change in the composition of the nutrient medium. The visible consequence of this spontaneous physiological differentiation can be seen alone at different stages of the growth curve of a "batch" culture. As a consequence of the shown direct relationship between the physiological activity of the cell mass and its environment, it is also associated with the preferential enrichment of various intracellular and extracellular metabolites, depending on the growth stage and the differentiation stage. The stock solutions of the "Batch" culture therefore contain an integrated mixture of all metabolites formed during the individual time steps of differentiation.

Keksinnön tarkoituksena on välttää nämä vaikeudet ja haitat ja sen tehtävänä on saada aikaan Pseudomonas aeruginosa-bak-The object of the invention is to avoid these difficulties and disadvantages and to provide Pseudomonas aeruginosa

8 4 2 S O8 4 2 S O

teerikantojen submerssinen viljelymenetelmä, joka tuottaa olennaisesti tähänastista paremmalla saannolla bakteeribio-massan antigeenien valmistamiseksi, joiden fysiologinen tila pysyy muuttumattomana koko viljelyaikana. Menetelmässä käytetään synteettistä ravintoväliainetta (elatusainetta), josta ei muodostu mitään ylimääräisiä epäpuhtauksia autoklavoi-taessa, ja joka mahdollistaa bakteeribiomassan helpomman kemiallisen viimeistelyn flagella-antigeeniksi.a submerged culture method for tera strains that produces a substantially better yield of bacterial biomass for the production of antigens whose physiological state remains unchanged throughout the culture period. The method uses a synthetic nutrient medium (medium) which does not form any additional impurities during autoclaving and which allows for easier chemical finishing of the bacterial biomass to the flagella antigen.

Tämä tehtävä ratkaistaan keksinnön mukaisesti siten, että seuraavia H-tyyppi-antigeeneja tuottavia kantojaThis object is solved according to the invention by the following strains producing H-type antigens

Kanta H-tyyppi 170001 (ATCC 33350) - b M-2 (ATCC 33349) - b 5940*) - a0, a2 5939*) - a0, a3 5933*) - a0, alt a2 1210 (ATCC 33354) - a0, a1# a2 170018 (ATCC 33356) - a0, a3, a4 *) Kannat on esitetty julkaisussa Zbl. Bakt.Strain H-type 170001 (ATCC 33350) - b M-2 (ATCC 33349) - b 5940 *) - a0, a2 5939 *) - a0, a3 5933 *) - a0, alt a2 1210 (ATCC 33354) - a0, a1 # a2 170018 (ATCC 33356) - a0, a3, a4 *) Strains are shown in Zbl. Bakt.

Hyg., I. Abt. Orig. A242, 228-238 (1978) ja ne ovat saatavissa Pariisissa sijaitsevasta Collection de 1'Institut Pasteur-nimisestä talletuslaitoksesta viljellään vesipitoisessa, antigeenivapaassa ja proteiiniva-paassa ravintoväliaineessa, joka sisältää typpilähteen ja mineraalisuoloja sekä hiililähteenä sukkinaattia tai virtsa-ainetta eli ureaa.Hyg., I. Abt. Orig. A242, 228-238 (1978) and are available from the Collection de 1'Institut Pasteur in Paris and are grown in an aqueous, antigen-free and protein-free nutrient medium containing a nitrogen source and mineral salts and a succinate or urea as a carbon source.

Mainittu hiililähde on osoittautunut erityisessä määrin kasvua edistäväksi.Said carbon source has proven to be particularly growth-promoting.

Kannoissa 170001, 5940, 5939, 5933 ja 170018 käytetään An-sorgin nimitystä. Tyypittömien kantojen M-2 ja 1210 luokittelu vastaavaksi H-serotyypiksi tapahtui Montien et ai:n mukaisten molekyylipainojen vertailututkimusten ja serologisten ristireaktioiden perusteella.Strains 170001, 5940, 5939, 5933 and 170018 are referred to as An-sorghum. The classification of atypical strains M-2 and 1210 as the corresponding H serotype was based on comparative molecular weight studies and serological cross-reactions according to Montien et al.

4 842804,84280

Mieluummin suoritetaan kantojen viljely jatkuvatoimisesti.Preferably, the cultivation of the strains is carried out continuously.

Erään edullisen suoritusmuodon mukaisesti kasvatus voi tapahtua turbidostaattisesti, jolloin ravintoväliaineen happipitoisuus on 5 - 20 etenkin n. 10 %, solutiheys pidetään arvossa 2 - 3 x 109 solua/ml ja substraatin laimennus-määrä pidetään arvossa 0,1 My - 0,3 My lisäämällä tuoretta ravintoväliainetta.According to a preferred embodiment, the growth can take place turbidostatically, the oxygen content of the nutrient medium being 5 to 20, in particular about 10%, the cell density being kept at 2 to 3 x 10 9 cells / ml and the dilution of the substrate being kept at 0.1 My to 0.3 My by adding fresh nutrient medium.

Pseudomonas aeruginosa-bakteerikantojen keksinnön mukainen viljely tapahtuu sekoittamalla ja ilmastamalla "avointa" viljelmää siten, että ne saatetaan maksimaaliseen kasvuun ja flagellien muodostukseen. Ravintosubstraatin syöttö suoritetaan viljelmän kasvumäärän tai vastaavasti viljelmän saavuttaman tasapainotilan mukaan. Tuoreen ravintoväliaineen syötön säätö tai vastaavasti ohjaus tapahtuu viljelmän kasvun suhteen verrannollisesta parametrin, sopivimmin solutiheyden ajallisen muutoksen mukaisesti. Kuitenkin voidaan käyttää myös muita parametrejä, jotka ovat verrannollisia viljelmän kehityksen suhteen, kuten hengitysaktiivisuus, C02~tuotanto, vetyionikonsentraation muutos, hiililähdekonsentraation muutos, respiraatio-osamäärä, typpikulutus, happikulutus ja lämpöefekti. Edelleen voi tuoreen ravintoväliaineen syötön säätö tapahtuu muodostuneen antigeenin määrästä riippuvaisena .The cultivation of Pseudomonas aeruginosa strains according to the invention takes place by mixing and aerating an "open" culture so as to bring them to maximum growth and flagellar formation. The feeding of the nutrient substrate is carried out according to the growth rate of the culture or the equilibrium state reached by the culture, respectively. The adjustment or control of the supply of fresh nutrient medium is proportional to the growth of the culture according to a parameter, preferably a change in cell density over time. However, other parameters that are proportional to the development of the culture can also be used, such as respiratory activity, CO 2 production, change in hydrogen ion concentration, change in carbon source concentration, respiration quotient, nitrogen consumption, oxygen consumption, and thermal effect. Furthermore, the supply of fresh nutrient medium can be adjusted depending on the amount of antigen formed.

Keksinnön mukaisessa yhtäjaksoisessa kasvatusmenetelmässä poistetaan samanaikaisesti tuoreen ravintoväliaineen syötön kanssa viljelynestettä viljelyastiasta, niin että kasvun ja fysiologisen aktiivisuuden, etenkin toisaalta solujen muodostuksen ja toisaalta solujen ympäristön välille säätyy tarkoin määriteltävä ja aina toistettava virtaustasapainoti-la, joka voidaan säilyttää käytännöllisesti katsoen ajallisesti rajattomasti.In the continuous growth method according to the invention, the culture medium is removed from the culture vessel at the same time as the fresh nutrient medium, so that a well-defined and always reproducible flow equilibrium is established between growth and physiological activity, especially cell formation and cell environment.

Ravintoväliaineena käytetään synteettistä proteiinivapaata väliainetta, joka sisältää yksinomaan kemiallisesti sekä fysikokemiallisesti kvalitatiivisesti ja kvantitatiivisesti 5 84280 määriteltäviä aineosia. Tähän tarkoitukseen soveltuu epäorgaaninen ravintoliuos, joka sisältää kaikki olenaiset elementit.The nutrient medium used is a synthetic protein-free medium containing exclusively chemically and physico-chemically 5 84280 constituents to be determined qualitatively and quantitatively. An inorganic nutrient solution containing all the essential elements is suitable for this purpose.

Eräässä edullisessa keksinnön mukaisessa menetelmässä voidaan käyttää tauti-itiöiden fermentatiiviseen valmistukseen sekä jatkuvatoimisen viljelyn kemostaattista periaatetta, jossa viljelmän fysiologista aktiivisuutta säädetään rajoittavalla substraatilla, mieluummin hiili- ja energialähteen substraatilla, että jatkuvatoimisen viljelyn turbidostaat-tista periaatetta, jossa laimennusnopeutta (My) ja siten viljelmän fysiologista aktiivisuutta säädetään ulkoisesti kasvuparametrin, mieluummin viljelmän hetkellisen solutihey-den avulla.In a preferred method according to the invention, the chemostatic principle of continuous culture can be used for the fermentative production of disease spores, in which the physiological activity of the culture is controlled by a limiting substrate, preferably a carbon and energy source substrate, and the turbidostatic principle of continuous culture. the activity is externally controlled by a growth parameter, preferably the instantaneous cell density of the culture.

Edullisesti käytetään turbidostaattista jatkuvatoimista viljelyä.Preferably, turbidostatic continuous culture is used.

Maksimaalisen bakteerikasvun edistämiseksi myös lämpötilat tai vastaavasti pH-arvo ovat tärkeitä; siten on tarkoituksenmukaista noudattaa viljelyn aikana 20 - 35eC:n, sopivim-min 30"C:n lämpötilaa ja pH-arvoa 6,5 - 7,5, sopivimmin 7,0.Temperatures or pH, respectively, are also important to promote maximal bacterial growth; thus it is expedient to observe a temperature of 20 to 35 ° C, preferably 30 ° C and a pH of 6.5 to 7.5, preferably 7.0, during cultivation.

yksityiskohtaisesti keksinnön mukainen menetelmä suoritetaan turbidostaattisesti fermentaattorissa siten, että ensin ra-vintoväliaine ympätään bakteerikannalla ja työskennellään noudattaen esitettyjä olosuhteita, kunnes on saavutettu esitetty solutiheys, 2 - 3 x 109 solua/ml, logaritmisessa loppuvaiheessa. Heti kun asianlaita on näin, fermentaattorista poistetaan jatkuvasti bakteerisuspensiota ja se korvataan jatkuvasti tuoreella ravintoliuoksella. Laimennusmäärä ei saa tarkoituksenmukaisesti olla yli 0,3 My, mieluummin 0,1 -0,2.in detail, the process according to the invention is carried out turbidostatically in a fermenter, in which the nutrient medium is first inoculated with the bacterial strain and worked under the conditions described until the indicated cell density of 2-3 x 109 cells / ml is reached in the logarithmic final stage. As soon as this is the case, the bacterial suspension is continuously removed from the fermenter and replaced continuously with fresh nutrient solution. The amount of dilution should not expediently exceed 0.3 My, preferably 0.1 -0.2.

Esitetyissä olosuhteissa virtaustasapainotilan saavuttamisen jälkeen saadaan 1,5 - 2,0 g/1 märkiä soluja, mikä vastaa suspension sameusarvoa 0,5 - 0,7 Tyndallin menetelmän mukaisesti ennen linkoamista 590 nmrssä.Under the conditions shown, after reaching equilibrium, 1.5 to 2.0 g / l of wet cells are obtained, which corresponds to a turbidity value of the suspension of 0.5 to 0.7 according to the Tyndall method before centrifugation at 590 nmr.

6 842806 84280

Keksinnön mukaista menetelmää selitetään lähemmin seuraavan esimerkin avulla:The method according to the invention is explained in more detail by means of the following example:

Esimerkki: Käytettiin seuraavan koostumuksen omaavaa ravintoliuosta: dinatriumsukkinaattia 4,05 g/1 dikaliummonovetyfosfaattia 7 g/1 kaliumdivetyfosfaattia 3 g/1 ammoniumvetyfosfaattia l g/1 magnesiumsulfaattia . 7 H2O 0,05 g/1 rauta(III)kloridia 0,0025 g/1 pH säädettiin arvoon 7,0 ja lämpötila 30"C:seen. Ravinto-liuos ympättiin kannalla Pseudomonas aeruginosa M-2 ja sijoitettiin 15 l:n fermentaattoriin. 96 tuntia kestävässä fermentoinnissa käytettiin 140 1 ravintoväliainetta, jolloin ilman kulutus oli 10 % pC>2 (happiosapaine). Laimennusmäärä oli 0,1 My. Solutiheys oli virtaustasapainotilan saavuttamisen jälkeen 2 - 3 x 109 solua/ml.Example: A nutrient solution having the following composition was used: disodium succinate 4.05 g / l dipotassium monohydrogen phosphate 7 g / l potassium dihydrogen phosphate 3 g / l ammonium hydrogen phosphate 1 g / l magnesium sulphate. 7 H2O 0.05 g / l ferric chloride 0.0025 g / l The pH was adjusted to 7.0 and the temperature to 30 ° C. The nutrient solution was inoculated with Pseudomonas aeruginosa strain M-2 and placed in a 15 l fermentor The fermentation for 96 hours used 140 l of nutrient medium with an air consumption of 10% pC> 2 (oxygen partial pressure) and a dilution volume of 0.1 My cell density after reaching equilibrium was 2 to 3 x 109 cells / ml.

Samoissa olosuhteissa viljeltiin kantoja 170001 ja 1210, jolloin seuraavassa taulukossa on esitetty viljelyolosuhteet, laimennusmäärä, happiosapaine %:eina ja solusaanto (g/1 märkäpainoa) kaksinkertaisen sentrifugoinnin jälkeen 15.000 x g:ssä. Edelleen on esitetty suspension sameusarvot ennen sentrifugointia.Strains 170001 and 1210 were cultured under the same conditions, the following table showing the culture conditions, dilution amount, oxygen partial pressure in% and cell yield (g / l wet weight) after double centrifugation at 15,000 x g. The turbidity values of the suspension before centrifugation are further shown.

kanta vilj elyolosuhteet__solusaanto _ laimennus- happi- sameusarvo g/1 märkiä määrä pitoisuus 590 nm:ssä soluja ____d = 1 cm__ 170001 0,1 My 10 % p02 0,6 - 0,67 1,7 M-2 0,1 My 10 % pC>2 0,6 - 0,7 1,6-1,7 1210 0,1 My 10 % p02 0,55 - 0,65 1,5 - 1,6 1210 0,1 My 10 % p02 0,6 1,5-1,6strain culture conditions__cellular yield _ dilution oxygen turbidity value g / 1 wet amount concentration at 590 nm cells ____d = 1 cm__ 170001 0.1 My 10% p02 0.6 - 0.67 1.7 M-2 0.1 My 10 % pC> 2 0.6 - 0.7 1.6-1.7 1210 0.1 My 10% pO2 0.55 - 0.65 1.5 - 1.6 1210 0.1 My 10% pO2 0, 6 1.5-1.6

Claims

84230

A method for the cultivation of Pseudomonas aeruginosa bacterial strains from a taxonomic family of the genus Pseudomonadaceae, characterized in that strains producing the following H-type antigens Strain H-type 170001 - b M-2 - b 5940 - ao, a2 5939 - ag, aj 5933 aQ, aj_, a2 1210 to a0, ai, a2 170018 to öq, aj, a4 are cultured in an aqueous, antigen-free and protein-free nutrient medium containing a nitrogen source and mineral salts and a succinate or urea as a carbon source, continuously and turbidostatically with a nutrient medium, 5 to 20%, preferably about 10%, the cell density is maintained at 2-3x109 cells / ml and the dilution of the substrate is maintained at 0.1 My to 0.3 My by adding fresh nutrient medium.

Process according to Claim 1, characterized in that the temperature in the culture is maintained at 20 to 35 ° C, preferably at 30 ° C, and the pH is maintained at 6.5 to 7.5, preferably 7.0. θ Patentkrav: 84280