CS195307B2

CS195307B2 - Process for the production of microorganisms

Info

Publication number: CS195307B2
Application number: CS761640A
Authority: CS
Inventors: David E F Harrison; Harmannus J Doddema
Original assignee: Shell Int Research
Priority date: 1975-03-14
Filing date: 1976-03-12
Publication date: 1980-01-31
Also published as: DE2610478C2; IE43456B1; IE43456L; CA1058105A; FR2303853B1; DK107776A; FR2303853A1; JPS51112586A; ES446012A1; HU178347B; DK141706B; IT1183051B; DK141706C; DE2610478A1; NL7602602A; US4042458A; NO760882L; FI760653A; NO144854B; GB1535320A

Description

Předmětem vynálezu je způsob produkce mikroorganismů, zahrnující kultivaci mikroorganismu zužitkovávajícího methan, jímž je kmen z rodu Methylococcus, za aerobních podmínek.

Jsou známy četné mikroorganismy, které mohou zužitkovat uhlovodíky nebo některé jejich kyslíkaté čl jiné deriváty, jako zdroj uhlíku a/nebo energie. Sušená biomasa získatelná kultivací takových mikroorganismů, často označovaná jako jednobuněčná bílkovina (SCP) je bohatá bílkovinami a může jí být použito jako potenciální potravy nebo náhrady potravy u Udí a zvířat. V souvislosti s tím jsou zvláště zajímavé mikroorganismy, které jsou schopny zužitkovat plynné organické sloučeniny obsahující v molekule jeden nebo více atomů uhlíku, jako je například methan.

Účelem vynálezu je poskytnout zlepšený způsob kultivace mikroorganismů, zužitkovávajících methan.

V souhlasu s tím je předmětem vynálezu způsob produkce mikroorganismů, zahrnující kultivaci mikroorganismu zužitkovávající methan, jímž je kmen z rodu Methylcoccus, za aerobních podmínek v přítomnosti plynného methanu v kapalném růstovém prostředí, obsahujícím asimilovatelné zdroje dusíku a nezbytné minerální soli, při tep195307 lotě v rozmezí 30 až 60 °C a při pH v rozmezí 6,0 až 8,0, s následnou izolací mikroorganismu z kapalného růstového prostředí, kterýžto způsob se vyznačuje tím, že jako kmene rodu Methylococcus se použije kmene Methylococcus 999 o pořadovém čísle NCIB 11 083.

Výhodně se způsob podle vynálezu provádí tak, že se kmen Methylococcus 999 kultivuje v přítomnosti jednak nejméně jednoho organismu zužitkovávajícího methanol, který je schopen metabolizovat methanol vznikající při kultivaci mikroorganismu zužitkovávajícího methan a kterým jsou kmeny Hyphomicrobium, Pseudomonas extorquens, Pseudomonas methylotropha nebo mikroorganismu kmene OML o pořadovém čísle NCIB 11112, jednak nejméně jednoho nemethylotrofního mikroorganismu, který je schopen metabolizovat organické látky produkované mikroorganismy, zužitkovávajícími methan a/nebo mikroorganismy zužitkovávajícími methanol a kterým jsou druhy rodu Pseudomonas mající pořadové číslo NCIB 11062, 11063 a/nebo 11063 a/nebo druh rodu Mycobacterium mající pořadové číslo NCIB 11061.

Bakterií zužitkovávající methan, výhodně použitelnou při způsobu podle vynálezu, je kmen Methylococcus 999, který je novým sái kmenem označeným vynálezci. Tento kmen má pořadové číslo NCIB 11083. V kultuře mohou být přítomny i jiné bakterie zužitkovávající methan, například Methylococcus SM 3 (NCIB 11 084), který je popsán v belgickém patentovém spisu 823 623.

Vhodné mikroorganismy, zužitkovávající methanol, zahrnují kmeny Hyphomicrobium (například NCIB č. 11040), Pseudomonas . extorquens.

Mikroorganismem zužitkovávajícím methan, s výhodou použitelným při způsobu podle vynálezu, je — jak již bylo výše uvedeno — kmen Methylococcus 999, který je novým bakteriálním kmenem a byl jako takový označen vynálezci. Teto kmen má pořadové číslo NCIB 11 083. V kultuře mohou být přítomny i jiné bakterie zužitkovávající methan, například Methylomonas SM 3 (NCIB č. 11084), který byl popsán v belgickém patentovém spisu č. 823 623.

Příklady vhodných nemethylotrofních mikroorganismů pro použití ve způsobu podle vynálezu zahrnují kmeny Pseudomonas (např. NCIB č. 11019 a 11022). Acínetobacter (například NCIB č. 11020), Curtobacterium (například NCIB č. 11021), Nocardiaceae, Mycobacteriaceae a Achromobacteriaceae a zvláště Mycobacterium (NCIB číslo 11061) a tři kmeny Pseudomonas (NCIB č. 11062, 11063, 11065), které byly popsány v belgickém patentovém spise č. 823 623.

Smíšené kultury s použitím ve způsobu podle vynálezu mohou být použity následujícími způsoby:

A.

Smíšené kultury zahrnující mikroorganismy zužitkovávající methan ve spojení s jedním nebo více mikroorganismy zužitkovávající methanol a jedním nebo více nemethylotrofními mikroorganismy mohou být izolovány z přirozených zdrojů. Zvláště použitelná smíšená kultura pro použití způsobem podle vynálezu (dále označovaná jako T4) zahrnuje Methylococcus 999 (NCIB č. 11083), OML (NCIB č. 11112), Mycobacterium (NCIB č. 11061) a tři kmeny Pseudomonas (NCIB č. 11062, 11063, 11065). .

B.

Vhodné smíšené - kultury mohou být získány rovněž kombinací Jednoho nebo více kmenů Methylococcus s jedním nebo více kmeny mikroorganismů zužitkovávajících methanol a s jedním nebo více methylotrofními mikroorganismy.

Kmen Methylococcus 999 (NCIB č. 11083) je nový mikroorganismus, který roste rovněž dobře v tekutém prostředí v čisté kultuře, stejně jako způsob produkce těchto mikroorganismů, zahrnující · kultivaci za aerobních podmínek v tekutém růstovém prostředí, zahrnujícím asimilovatelné zdroje dusíku a esenciálních minerálních solí v přítomnosti plynného .methanu a izolaci mik roorganismů z tekutého růstového prostředí.

Tento nový kmen Methylococcus 999 roste rovněž dobře na methanu v přítomnosti jednoho nebo více nemethylotrofních mikroorganismů bez přidání mikroorganismů zužitkovávajících methanol. V souhlase s tím patent poskytuje rovněž způsob produkce mikroorganismů zahrnující kultivaci za aerobních podmínek v tekutém růstovém prostředí zahrnujícím asimilovatelné zdroje dusíku a . esenciální minerální kyseliny v přítomnosti plynného methanu, mikroorganismus Methylococcus 999 (NCIB č. 11 083) v přítomnosti jednoho nebo více nemethylotrofních mikroorganismů, který je/jsou schopné metabolizovat látky produkované mikroorganismem Methylococcus 999 (NCIB č. 11 083). Použije-li se jako zdroje dusíku močoviny, kmen Methylococcus 999 roste výhodně v přítomnosti ureázo-pozitivních nemethylotrofních mikroorganismů.

Smíšená kultura T4, která je ve způsobu podle vynálezu zvláště výhodná, byla izolována ze vzorku kalu odebraného na tropické kachní farmě. Dva gramy vzorku kalu byly přeneseny do 250ml třepací baňky obsahující 25 ml 1-NSM prostředí (později popsaného) a naplněné dvakrát denně plynnou směsí obsahující 40 ' % methanu, 50 % vzduchu, 10 % kysličníku uhličitého. Baňka byla inkubována na rotační třepačce poloměru 2,5 cm při 200 otáčkách za minutu při teplotě 40 °C po dobu 1 týdne. Kultura, v níž se objevil zákal, byla přeočkována s použittím 2 ml inokula za aseptických podmínek do podobné· třepací baňky. Toto bylo opakováno několikrát a když byl docílen dobrý růst, kultura . z třepací baňky byla využita k inokulaci kontinuální kultury za podmínek popsaných v příkladu 1. Po více než 1000 hodinách kontinuální kultivace byla získána stabilní smíšená kultura, v níž převládajícím organismem byla kokoidní bakterie zužitkovávající methan. Charakteristiky smíšené kultury označené jako T4 jsou popsány podrobně níže.

Izolace čisté kultury mikroorganismu zužitkovávajícího methan ze smíšené kultury T4 obvyklou technikou na agarových plotnách je neuskutečnitelná, tímto způsobem vznikají pouze smíšené kolonie. Protože je patrno, že při použití této techniky růst organismu zužitkovávajícího methan byl závislý na přítomnosti heterotrofní (nemethylotrofní) bakterie ve směsi, byl adaptován následující způsob: 1 ml smíšené kultury T4 (přibližně 2g/l) bylo smícháno se 40 ml sterilního roztaveného roztoku (při 55 °C) 1 % Bacto Difco agaru v 2-ASM prostředí (dále popsaného), směs nalita na sterilní Petriho misky a ponechána usadit.

Na tuto vrstvu je nalita další vrstva agaru a na tu je umístěn sterilní milipórový membránový filtr.

Vzorky smíšené kultury T4 byly natřeny na membránu. Po době 4 dní inkubace při teplotě 40 °C byly pozorovány kolonie. Bylo

6 zjištěno, že to jsou čisté kolonie kokoidní bakterie zužitkovávající methan, Methylococcuš 999 (NCIB č. 11 083).

Izolovaný organismus by nerostl v čisté kultuře na agarových plotnách, pokud by se nepoužilo velmi těžkého inokula, nebo pokud by se nepoužila shora uvedená převrstvovací technika. Avšak bakterie roste dobře jako čistá kultura v tekuté kultuře.

kultura T4 zahrnuje methan zužitkovávající kmen Methylococcus 999 (NCIB čís. 11083), obsahuje rovněž jeden mikroorganismus zužitkovávající methan (NCIB číslo 11112) a čtyři heterotrofní organismy (NCIB č. 11 061, 11 062, 11063, 11065).

Organismus zužitkovávají methanol a čtyři heterotrofní organismy jsou již popsány v belgickém patentovém spise č. 823 623.

Organismus zužitkovávající methan se zdá být dříve nepopsaným druhem Methylococcus na základě následující identifikace:

Typ membrány: membrána typu II, jaký je popsán Whittenburym se sp.: J. Gen. Microbiology (1970) 61, 205.

Tvar buňky: koky. Průměr buňky: asi 0,9 nm.

Růst při teplotě 37 °C: + Růst při 42 °C: + Růst při 55 °C: 4Růst při methanolu: +

Inhlbice růstu: extraktem z kvasnic: — jablečnanem: — octanem: — jantarariem: — Motilita: — tvorba pouzder: 4barva kolonie: bílá/hnědá pigment rozpustný ve vodě: —

Gram vybarvení: variabilní, mění se s růstovými podmínkami buněk. Buňky izolované z kontinuální kultury rostoucí na dusičnanovém prostředí byly grampozitívní, avšak buňky rostoucí na čpavkovém prostředí byly gramnegativní.

Kataláza: +

Oxidáza: —

Glukóza * kyselina: —

OF/Hugh Leifson: nereaguje alkánová oxidace: 4Citlivost na antibiotika: (4- znamená citlivost) ( — znamená necitlivost). Chlorafenikol 10 ^g: — Erythromycin 10 pg: — Sulfafurazol 100 ^g: + Novobiocin 5 pg: — Oleandomycin 5 pg: — Penicilín G 1,5 jednotek: + Streptomycin 10 pg: + Tetracyklin 10 p: -tCefaloridin 5 pg:—

Kanamycin 5 pg·. +

Ampicilin 2 pg: 4: . ... -----------• ’ ·» .

Z těchto charakteristik tento organismus se zdá být kmenem Methylococcus. Je však odlišný od dříve popsaného kmene Methylococcus v tom, že roste při 55 °C a netvoří kolonie na agarových deskách s minerálními solemi, ledaže se použije shora uvedené techniky.

Tekuté růstové prostředí ve způsobu po. dle vynálezu zahrnuje sloučeninu obsahující dusík, kterým může být amoniak, močovina, ammoniové soli, jako síran hydrochlorid nebo dusičnan, například dusičnan alkalického kovu. Sloučenina je vhodně přítomna v koncentraci od 3 do 50 g/1.

Dalšími prvky, které mohou být přítomny, jsou fosfor, síra, hořčík a železo. Zdrojem fosforu je jeden nebo více fosfátů například K2HPO4, KH2PO4, Na4HPO2 nebo (NH4)2HPO4 nebo kyselina fosforečná, přítomná s výhodou v koncentraci od 3 do 20 g/1. Zdrojem síry může být kyselina sírová nebo síran jako (NH4)2SO4 s výhodou v koncentraci od 0,5 až 5,0 g/1. Dva kovy se poskytují jako jedna nebo jiná z jejich solí, například MgSO4.7 H2O v koncentraci od 0,2 do 2,0 g/1 a FeCls. 6 H2O v koncentrací od 0,01 do 0,1 g/1. ^Λ·

Prostředí může obsahovat rovněž stopová množství jiných prvků ve formě vhodných solí, například vápník, mangan, zinek, kobalt, molybden a bor. Příklady vhodného prostředí zahrnují:

1- NSM následujícího složení:

KH2PO4 1,6 gramu/litr

Na2HPO4 1,16 gramu/litr NaNOs 1,18 gramu/litr

MgSO4.7 H2O 0,08 gramu/litr

FeSCh . 7 H2O 0,014 gramu/litr

Ca(NOs)ž. 4 H2O 0,025 gramu/litr

CuSO4.5 H2O 4 x 10-3 gramu/litr ZnSO4.7 H2O 3,4 x 10⁴ gramu/litr MnS04.4 H2O 3 x 10 ~⁴ gramu/litr NazMoO4.2 H2O 2,4 x 10^-4 gramu/litr.

2- ASM, které má stejné složení jako 1-NSM s výjimkou, že namísto NaNCh obsahuje 1,18 g/1 (NH4)2SO4.

3- USM, které má stejné složení jako 1-NSM, s výjimkou, že namísto NaNOs obsahuje 2,0 g/1 močoviny.

5-C o následujícím složéní:

KH2PO4 1,6 gramu/litr NazHPO4 1,6 gramu/litr NaNO3 3,18 gramu/litr

MgSO4.7 H2O 0,107 gramu/litr

FeSO4.7 H2O 0,009 gramu/litr Ca(N03)2.4 Й2О 0,06 gramu/litr

CuSO4. 5 H2O 3 x 10“⁴ gramu/litr ZnSO4.7 H2O 2,6 x 10^-4 gramu/litr MnS04.4 H2O 5 x 10⁴ gramu/litr

NazMoOá. 2 H2O 3,1 x 10^_4 gramu/litr C0CI2.6 H2O 1,5 x 10-4 gramu/litr.

Způsob podle vynálezu se může provádět šaržově, polokontinuálně, avšak s výhodou v kontinuální ' kultuře. Aby se docílil růst, mikroorganismy · se inokulují do tekutého růstového prostředí, v němž se uvádějí ve styk s plynnou směsí obsahující methan a kyslík. · Methan může být dodáván ve formě přírodního plynu. Při kontinuální kultivaci mikroorganismy mohou růst ve vhodně · uzpůsobeném fermentačním kotli, například v míchaném přepážkovém fermentoru nebo věžovém fermentoru, který je opatřen vnitřním chlazením nebo vnějším chladicím okruhem. Čerstvé prostředí se čerpá kontinuálně do kultury rychlostí ekvivalentní 0,02 až 1,00 objemů kultury za hodinu . a kultura se odstraňuje takovou rychlostí, že objem kultury se nemění. Plynná směs obsahující methan a kyslík a eventuálně kysličník uhličitý nebo jiné plyny se uvádí ve styk s prostředím výhodně kontinuálním přobubláváním trubicí ke dnu kotle. Zdrojem kyslíku pro kulturu může být vzduch, kyslík nebo vzduch obohacený kyslíkem. Odpadní plyn je z hlavy kotle odstraňován. Odpadní plyn může být recyklován vnějším okruhem nebo vnitřně pomocí odstředivého uváděče plynu. Proud plynu · a récyklace by měly být nastaveny tak, aby poskytovaly maximální růst organismu a maximální zužitkovávání methanu.

Teplota kultury se obvykle udržuje mezi 30 až 60 °C a s výhodou od 38 do 50 °C. Hodnota pH kultury se udržuje na pH mezi 6,0 a 8,0 a s výhodou mezi 6,0 a 7,0 příslušným přidáním zásady, například hydroxidu sodného, hydroxidu draselného, čpavku a/nebo kyseliny, například kyseliny sírové nebo kyseliny fosforečné.

Buňky mikroorganismu mohou být z růstového prostředí izolovány obvykle používaným způsobem, například vyvločkováním, sedimentací a/nebo srážením následovaným odstředěním a/nebo filtrací. Biomasa se potom suší například lyofylizací nebo sprayovým sušením, ' může jí být použito v této formě jako bílkovinné potravy nebo náhražky potravy pro člověka nebo zvířata. Vynález je dále ilustrován následujícími příklady.

Příklad 1

Kontinuální kultury obou smíšených kultur T4 a čisté kultury Methylococcus 999 rostly za ' aseptických podmínek v míchaném fermentoru o 2,51itrovém pracovním objemu (Biotec Fermenter, LKB Co.Ltd.j. Směsi methanu se vzduchem (poměr objemů . byl 2:1) byly probublávány tekutinou rychlostí 900 až 1200 ml/min. Teplota kultury byla udržována na 42 °C a hodnota pH pří 6,8 automatickým přidáváním směsi 0,5 N hydroxidu sodného a 0,5 N hydroxidu draselného. Kultura byla míchána rychlostí 1200 . otáček za minutu. Pomocí peristaltického čerpadla byla kultura zásobována čerstvým prostředím, stejnou rychlostí, aby se udržel konstantní objem v reakční nádobě. Složení prostředí bylo následující:

Složka	Koncentrace (mM)
(NH4)2SO4	11,0
H5PO4	10,0
MgSOá	0,4
CaC12	0,1
FeSO4	. 33	X	10-3
ZnSO4	1,0	X	10-3
MnSO4	1,0	X	Ί0-3
H3BO3	1,0	X	10-3
CuSO4	0,5	X	10-3
Na2MoO4	0,2	X	10-3
C0CI2	0,2	X	10-3
KJ	0,5	X	10-3
H2SO4	1,0	X	10-3

Fermentořy byly naplněny dvěma litry média, míchány, vzdušněny a zásobovány methanem a vzduchem, jak je shora popsáno. Každý fermentor byl inokulován 100 ml plně rostoucí kultury z třepací baňky, jeden směsí T4, druhý čistou kulturou Methylococcus 999. Fermentory byly zásobovány médiem v rozmezí zřeďovací rychlosti od 0,10 hod1 postupně do přibližně 0,02 až 0,03 hod-1, až se kultura začala vymývat z reakční nádoby. Během každé zřeďovací rychlosti byly udržovány stacionární stavy alespoň po dobu 48 hodin. Výsledky jsou shrnuty v tabulce I.

TABULKA 1

Kultura Dosažená maximální zře d’ovací rychlost (hT40,34

Methylococcus 9990,31

Příklad 2

Šaržové kultury pouze organismu Methylococcus 999 a tohoto organismu ve směsi s ureázo-pozitivním bacilu neschopném růstu na methanu, avšek schopném růstu na látkách produkovaných organismem Methylococcus 999 rostly při teplotě 42 °C v jednoduchém solném prostředí v sterilních skleněných reakčních nádobách objemu 500 ml, kterými byla bublána pomocí skleněných frit směs methanu, vzduch a kysliční10

Sušina, koncentrace (g/1-¹)	Výtěžek, koeficient/g sušiny/g CH4, který byl použit
2,42	0,71
2,14	0,66

ku uhličitého při 25, 100 a popřípadě 10 ml za minutu.

Baňky byly inokulovány 1,5 ml čerstvého inokula. Médiem v baňkách bylo 300 ml 3-USM. Růst byl sledován měřením optické hustoty (OD) při 625 nm. Výsledky jsou udány v tabulce 2.

Ureázo-pozitivní bacil byl charakterizován takto: Gram vybarvení +, tyčinkovitý tvar, nepohyblivý, růst na vzduchu +, kataláza +, oxidáza —, glukóza -+ kyselina: +, OF (Hugh and Leifson) +, ureáza +, žádná denitrifikace.

TABULKA 2

Růst Methylococcus 999 a smíšená kultura (OD při 625 nm) (průměrné hodnoty tříkomponentových kultur)

Kultura T v hodinách	0	24	96	120
Methylococcus 999 samotný	0,005	0,005	0,029	0,054
Methylococcus smíchaný s ureázo-	0,005	0,029	0,490	0,550

-pozitivním bacilem

Výsledky ukazují, že organismus Methylococus 999 roste dobře na močovině, avšak jenom v tom případě, je-li přítomen ureázo-pozitivní organismus.

Příklad 3

Smíšená kultura T4 rostla v přítomnosti různých zdrojů dusíku za rozličných podmínek.

Kultury rostly ve 2,51itrových reakčních nádobách popsaných v příkladu 1. Ačkoliv nebyla dodržována přísná asepse v těchto pokusech, mikrobiologické znaky kultury se nezměnily.

Podmínky kultyry byly: teplota 42 °C; pH: 7,0; zřeďovací rychlost 0,18 hod“¹; rychlost míchání: 1000 otáček za minutu, celková rychlost toku plynu: 600 ml/mln. Výtěžkové koeficienty byly počítány z analýzy proudu vcházejícího a vycházejícího plynu ve fer mentoru pomocí plynové chromatografie a z pečlivého měření průtokové rychlosti pomocí průtokoměru. Suchá hmotnost organismu, která se pohybovala mezi 5 g l“¹, byla měřena rozdílem koncentrace uhlíku vzorku kultury a horní vrstvy po odstředění vzorku při 6000 g během 15 minut. Obsah uhlíku buněk sušených v sušárně byl konstantně 48 %.

Použitá média obsahovala (g l“¹) KH2PO4: 1,60; NazHPOít: 1,16; MgSOd. 7 H2O 0,080; FeSOd . 7 H2O: 0,014; Ca(NOs)2.4 H2O: 0,025;

2,4 x 10“³; ZnSO4.7 H2O: 3,4 x 10“⁴; MnSO4.4H2O; 3,0 x 10“¹⁶; NaMoO4.2H₂O:

2,4 x 10⁴; COCI2.6H2O: 1,5 x 10“⁴, na litr bylo přidáno 0,33 ml 36 N koncentrované kyseliny sírové. Jako dusíkového zdroje bylo přidáno 3,18 g l“¹ NaNOs, 2,46 g l“¹(NH4)2SOí nebo 1,122 g I^-1 močoviny.

Výsledky jsou ukázány v tabulce 3.

TABULKA 3

Vliv zdroje dusíku a limitujícího faktoru na kontinuální kultury směsi T4

Zdroj dusíku NaNO3 (NHdJzSOá Močovina

Poměr vzduch/methan v:	3:1	6:1	3:1	6 :1	3 :1
Faktor limitující růst	O2	CH4	O2	CH4	O2
Koeficient výtěžku/g buněk/g CH4	0,65	0,63	0,69	0,83	0,76
	+ 0,03	±0,03	±i0,04	±.0,02	±0,05

193307

P ř Í к 1 a d 4

Kultura rostla v 7mililitrovém fermentoru (Chemap Co. Ltd. Curych, Švýcarsko). Teplota byla udržována při 42 °C a hodnota pH při 7,4 automatickým přidáváním 5 N roztoku směsi KOH/NaOH v poměru 1:1 nebo 5 N H2SO4 podle toho, jak bylo zapotřebí. Fermentorem byla uváděna směs kyslíku a methanu v množství 2 litry/minuta. Fermentor byl míchán při 1500 otáčkách za minutu. Objem ve fermentoru byl udržován na 4,4 litrech pomocí zábrany přetékání nebo tím, že. kultura byla kontinuálně čerpána. Kultura byla zásobována médiem dvěma proudy, tj. 1. roztok (NH4)2SO4 (150 mM), H3PO4 (45 mM), MgSO4 (4,5 mM), CaC12 (1,5 mM), FeSCM (0,6 mM) a 26,4 ml roztok obsahující (gramy v litru) ZnSO4. . 7H2O : 0,18; CuSO4.5НгО : 0,16; MnSO4 . . 4H2O : 0,15; C0CI3.6H2O : 0,18; НзВОз:0,1; NaMoO4.2НгО : 0,3 : a 2. deionisovaná voda. Tyto byly čerpány kontinuálně do kul tury tak, že celková rychlost toku byla vždy ekvivalentní zřeďovací rychlosti kultury 0,09 hod^-1. Relativní rychlosti toku solí a proudů vody byly měněny. Jakmile zásobování plynem bylo více než dostatečné koncentrace kultury byla limitována koncentrací zdroje dusíku v celkovém zásobování média. Tak zvýšené zásobování roztokem solí v poměru к proudu vody zvyšovalo koncentraci organismů v kultuře.

Příklad 5

Kultura organismu Methylococcus 999 a směs T4 se nechají růst v kontinuální kultuře, jak je to popsáno v příkladu 1 na médiu 5-C při zřeďovací rychlosti 0,08 hod^-1.

Buňky byly izolovány z kultury, čerpány z fermentoru, odstředěny a sušeny za nízké teploty a tlaku. Obsah bílkovin (počítáno jako N x 6,25,) obou, byl 69 %. Analysa aminokyselin buněk ze dvou kultur je ukázána v tabulce 4.

T a b u 1 к a 4

Obsah aminokyselin z buněk T4 a kmene 999 % surové bílkoviny (g/16 g N)

Aminokyselina T4 999

kyselina asparagová	8,55	8,29
threonln	4,42	4,34
serin	3,49	3,40
kys. giutamová	9,39	9,27
prolln	7,39	6,53
glycln	5,41	4,68
alanin	7,66	6,32
valln	6,31	5,99
cystln	N/D	0,57
methlonin	2,32	2,59
lsoleucin	3,83	4,21
leucln	7,28	7,30
tyrosin	2,17	3,97
fenylalanln	4,59	4,65
ornlthin	0,05	0,18
lysin	5,49	5,24
arginln	5,63	5,04
hlstidin	2,02	2,06

PŘEDMĚT vynálezu

Claims

1. Způsob produkce mikroorganismů, zahrnující kultivaci mikroorganismu zužitkovávajícího methan, jímž je kmen z rodu Methylococcus, za aerobních podmínek v přítomnosti plynného methanu v kapalném růstovém prostředí obsahujícím asimilovatelné zdroje dusíku a nezbytné minerální soli, při teplotě v rozmezí 30 až 60 °C a při pH v rozmezí 6,0 až 8,0, s následnou isolací mikroorganismu z kapalného růstového prostředí, vyznačující se tím, že jako kmene rodu Methylococcus se použije kmene Methylococcus 999 NCIB 11 083.

2. Způsob podle bodu 1 vyznačující se tím, že se kmen Methylococcus 999 kultivuje v přítomnosti jednak nejméně jedno ho organismu zužitkovávajícího methanol, který je schopen metabolizovat methanol vznikající při kultivaci mikroorganismu zužitkovávajícího methan, a kterým jsou kmeny Hyphomlcroblum, Pseudomonas extorqens, Pseudomonas methylotropha nebo mikroorganismus kmene OML NCIB 11112, jednak nejméně jednoho nemethylotrofního mikroorganismu, který je schopen metabolizovat organické látky produkované mikroorganismy zužitkovávajícími methan a/nebo mikroorganismy zužitkovávajícími methanol, a kterým jsou druhy rodu Pseudomonas NCIB 11062, 11063 a/nebo 11063 a/nebo druh rodu Mycobacteríum NCIB 11061.