CH623356A5 - - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Züchtung von kolben gegeben, der 25 ml 1-NSM-Medium (wie später näher

3

623 356

beschrieben) enthielt und zweimal täglich mit einem Gemisch, bestehend aus 40 Vol.-% Methan, 50 VoI.-% Luft und 10 Vol.-% CO2, begast. Der Kolben wurde auf einer Rotationsschüttelvor-richtung mit einem Orbitalradius von 2,5 cm mit 200 UpM eine Woche bei 40 °C geschüttelt. Die Kultur, in der eine Trübung 5 entstanden war, wurde in Unterkulturen weitergezüchtet,

wobei 2 ml Inokulum unter aseptischen Bedingungen in ähnliche Schüttelkolben gegeben wurden. Es wurde einige Male wiederholt und nachdem ein gutes Wachstum erhalten worden war, wurde die Kultur in dem Schüttelkolben angewandt, um 10 eine kontinuierliche Kultur unter den in Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen zu beimpfen. Nach mehr als 1000 Stunden kontinuierlicher Züchtung hatte sich eine stabile gemischte Bakterienkultur entwickelt, in der der überwiegende Organismus ein kokkoides methanverbrauchendes Bakterium war. Die 15 Charakteristika der als T4 bezeichneten gemischten Kultur sind im einzelnen unten beschrieben.

Die Isolierung einer reinen Kultur des methanverbrauchenden Mikroorganismus aus dem Gemisch T4 erwies sich mit Hilfe üblicher Agar-Plattenverfahren als unmöglich, da nur ge- 20 mischte Kulturen auf diese Weise auf den Platten entstanden. Es ist offensichtlich, dass bei Anwendung dieser Verfahren das Wachstum des methanolverbrauchenden Mikroorganismus abhängt von dem Vorhandensein heterotropher (nicht-methy-lotropher) Bakterien in dem Gemisch. Es wurde das folgende 25 Verfahren angewandt: 1 ml der gemischten Kultur T4 (ungefähr 2 g/1) wurde mit 40 ml einer sterilen geschmolzenen Lösung (55 °C) aus 1 % Bacto-Difco-Agar in 2-ASM-Medium (wie später näher beschrieben) vermischt und das Gemisch in sterile Petri-Schalen gegossen und zum Verfestigen stehenlas- 30 sen.

Eine zweite Agarschicht wurde über diese Schicht gegossen und ein steriles Millipore-Membranfilter auf diese zweite Schicht gelegt.

Proben der gemischten Kultur T4 wurden auf die Membran 35 aufgestrichen. Nach 4 Tagen Inkubation bei 40 °C wurden Kolonien beobachtet. Diese erwiesen sich als reine Kolonien des kokkoiden methanverbrauchenden Bakteriums, Methylococcus 999 (NCIB-Nr. 11083).

Dieser isolierte Mikroorganismus würde nicht als reine Kul-40 tur auf Agarplatten wachsen, wenn nicht ein sehr schweres Inokulum angewandt würde oder wenn nicht das oben beschriebene Verfahren mit übereinanderliegenden Schichten angewandt würde. Das Bakterium wuchs jedoch gut als reine Kultur in flüssiger Kultur.

Die Kultur T4 umfasst den methanverbrauchenden Stamm Methylococcus 999 (NCIB-Nr. 11083) sowie einen methanolverbrauchenden Stamm (NCIB-Nr. 11112) und vier heterotro-phe Stämme (NCIB-Nr. 11061,11062,11063 und 11065).

Der methanolverbrauchende Stamm und die vier hetero-trophen Stämme sind in der NL-Anmeldung 7416644 beschrieben.

Der methanverbrauchende Mikroorganismus ist offensichtlich eine bisher noch nicht beschriebene Spezies eines Methylo coccus aufgrund der folgenden Identifizierung:

Acetat

Succinat

Beweglichkeit

Kapsel gebildet:

Kolonienfarbe:

wasserlösliches Pigment:

Gramfärbung:

+

weiss-braun

Gram variabel; die Gramfärbung variierte mit den

Wachstumsbedingungen der Zellen. Zellen von einer kontinuierlichen Kultur, die auf einem Nitratmedium wuchsen, waren Gram positiv, aber Zellen von einer Kultur auf einem Ammoniakmedium waren Gram negativ.

+

keine Reaktion +

45

50

Membrantyp:

Zellform:

Zelldurchmesser:

Wachstum bei 37 °C:

Wachstum bei 42 °C:

Wachstum bei 55 °C:

Wachstum auf Methanol: + Verstärkung des Wachstums durch: Hefeextrakt -

Malat -

II stapelartige Membran (Whittenbury et al., Journal of General Microbiology (1970), 61,205) Kokki 00

ungefähr 0,9 nm +

+

+

Katalase:

Oxidase:

Glukosesäure:

OF (Huigh Leifson):

Oxidation-Alkane :

Empfindlichkeit gegenüber Antibiotika:

(+ = empfindlich; - = nicht empfindlich)

Chloramphenicol 10 \ig : -

Erythromycin 10 (ig : -

Sulfafurasol 100 ng: +

Oleandomycin 5 p.g: -, Penicillin G

1,5 Einheiten: +

Streptomycin 10 p.g: +

Tetracyclin 10 |ig: +

Cephaloridin 5 \ig: -

Kenamycin 5 \xg: +

Ampicillin 2 jxg: +

Entsprechend diesen Charakteristika scheint der Mikroorganismus ein Stamm von Methylococcus zu sein. Er unterscheidet sich jedoch von allen bisher beschriebenen Methylococcus-stämmen, indem er bei 55 °C wächst und auf Mineralsalz-Agar-platten keine Kolonien bildet, solange nicht das oben beschriebene Verfahren angewandt wird.

Das bei dem erfindungsgemässen Verfahren angewandte flüssige Wachstumsmedium umfasst eine stickstoffhaltige Verbindung die Ammoniak, Harnstoff, ein Ammoniumsalz wie ein Sulfat, Chlorid oder Nitrat, zum Beispiel ein Alkalinitrat sein kann. Die Verbindung ist günstigerweise in einer Konzentration von 3 bis 50 g/1 vorhanden.

Andere Elemente, die in dem Medium vorhanden sein können, sind: Phosphor, Schwefel, Magnesium und Eisen. Die Phosphorquelle besteht vorzugsweise aus einem oder mehreren Phosphaten, zum Beispiel K2HPO4, KH2PO4, Na2HP04 oder (NH4)2HP04, oder Phosphorsäure, vorzugsweise in einer Konzentration von 3 bis 20 g/1. Die Schwefelquelle kann Schwefelsäure oder ein Sulfat sein, wie (NH4)2S04, günstigerweise in einer Konzentration von 0,5 bis 5,0 g/1. Die beiden Metalle werden in Form des einen oder anderen ihrer Salze zugesetzt, zum Beispiel MgS04 • 7H20 in einer Konzentration von 0,2 bis 2,0 g/1 und FeCb • 6H2O in einer Konzentration von 0,01 bis 0,1 g/1.

Das Medium kann auch Spuren anderer Elemente in Form geeigneter Salze enthalten, zum Beispiel Calcium, Mangan, Zink, Kobalt, Molybdän und Bor. Beispiele für geeignete Medien umfassen:

1-NSM der folgenden Zusammensetzung:

65

KH2PO4 NA2HPO4 NaNOa MgS04-7H20

1,6 g/1 1,16 g/1 1,18 g/1 0,08 g/1

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4

FeSOWHîO 0,014 g/1

Ca(N03)2-4H20 0,025 g/1

CuS04-5H20 4x 10"3 g/1

ZnS04-7Hz0 3,4 x 10"4 g/1

MnS04-4H20 3xl0"4g/l

Na2Mo04-2H20 2,4xl0"4g/l

2-ASM mit der gleichen Zusammensetzung wie 1-NSM mit der Ausnahme, dass es 1,18 g/I (NH4>2S04 anstelle von NaNCb enthält.

3-USM mit der gleichen Zusammensetzung wie 1-NSM mit der Ausnahme, dass es 2,0 g/1 Harnstoff anstelle von NaNCh enthält.

5-C der folgenden Zusammensetzung

KH2P04

1,6 g/1

Na2HP04

1,16 g/1

NaNOs

3,18 g/1

MgS04.7H20

0,107 g/1

FeS04-7H20

0,009 g/1

Ca(N03)2-4H20

0,06 g/1

CuS04-5H20

3x 10"4 g/1

ZnS04-7H20

3,6 x 10"4 g/1

MnS04-H20

5X10"4 g/1

N a2MoÛ4 • 2H2O

3,1x10-^/1

CoCl2-6H20

1,5x10-^/1

Das erfindungsgemässe Verfahren kann ansatzweise, halbkontinuierlich, aber vorzugsweise in einer kontinuierlichen Fliesskultur durchgeführt werden. Um ein Wachstum zu erzielen, werden die Mikroorganismen in das flüssige Medium geimpft, das mit einem Gasgemisch, enthaltend Methan und Sauerstoff, zusammengebracht wird. Methan kann in Form von natürlichem Gas zugeführt werden. Für eine kontinuierliche Fliesskultur können die Mikroorganismen in irgendeinem geeigneten Fermentationsgefäss wachsen, zum Beispiel in einem Fermentationsgefäss mit Ablenkblechen unter Rühren oder einem Sprühturmfermentor, der entweder mit einer inneren Kühlung oder einer äusseren Rückführ-Kühlschleife versehen ist. Frisches Medium wird kontinuierlich zu der Kultur mit Geschwindigkeiten entsprechend 0,02 bis 1,0 Kulturvolumina/ Stunde zugeführt und die Kultur mit einer solchen Geschwindigkeit abgezogen, dass das Volumen der Kultur konstant bleibt. Ein Gasgemisch, enthaltend Methan und Sauerstoff und gegebenenfalls Kohlendioxid oder andere Gase, wird mit dem Medium zusammengebracht, vorzugsweise durch kontinuierliches Einleiten durch eine Sprühdüse am Boden des Gefässes. Die Sauerstoffquelle für die Kultur kann Luft, Sauerstoff oder mit Sauerstoff angereicherte Luft sein. Das verbrauchte Gas bzw. Abgas wird am Kopf des Gefässes abgezogen. Es kann entweder durch eine äussere Schleife oder von innen mit Hilfe eines Gaseinführpropellers zurückgeführt werden. Der Gas-fluss und die Rückführung sollten so durchgeführt werden, dass man ein maximales Wachstum des Organismus und eine maximale Ausnutzung von Methan erhält.

Die Temperatur der Kultur wird im allgemeinen bei 30 bis 60 °C und vorzugsweise 38 bis 50 °C gehalten. Der pH-Wert der Kultur wird auf einen Wert zwischen 6,0 und 8,0 und vorzugsweise zwischen 6,0 und 7,0 eingestellt durch Zugabe von Alkali, zum Beispiel NaOH, KOH, NH4OH und/oder Säure, zum Beispiel H2SO4 oder H3PO4.

Die Mikroorganismenzellen können von dem Wachstumsmedium nach irgendeinem üblicherweise angewandten Standardverfahren gewonnen werden, zum Beispiel durch Ausflok-ken, Sedimentieren und/oder Ausfällen und anschliessendes Zentrifugieren und/oder Filtrieren. Die Biomasse wird dann getrocknet, zum Beispiel gefriergetrocknet oder sprühgetrocknet und kann in dieser Form als Proteinnährstoff oder Nährstoffzusatz für Menschen oder Tiere angewandt werden.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert:

Beispiel 1 und Vergleichsbeispiel

Kontinuierliche Kulturen sowohl von der gemischten Kultur T4 als auch der reinen Kultur von Methylococcus 999 wurden unter aseptischen Bedingungen unter Rühren in Fermenta-tionsgefässen mit einem Arbeitsvolumen von 2,51 (Biotec Fermenter, LKB Co. Ltd.) gezüchtet. Es wurde ein Methan-Luft-Gemisch (Volumenverhältnis 2:1) durch die Flüssigkeit in den Fermentationsgefässen mit einer Geschwindigkeit von 900 bis 1200 ml/min geleitet. Die Temperatur der Kulturen wurde auf 42 °C gehalten und der pH-Wert durch automatische Zugabe eines Gemisches von 0,5n NaOH und 0,5n KOH auf 6,8 gehalten. Die Kultur wurde mit einer Geschwindigkeit von 1200 UpM gerührt. Frisches Medium wurde kontinuierlich zu der Kultur zugeführt mit Hilfe einer peristaltischen Pumpe und die Kultur wurde mit der gleichen Geschwindigkeit abgepumpt, um ein konstantes Volumen in dem Fermentationskessel aufrechtzuerhalten. Das Wachstumsmedium besass die folgende Zusammensetzung:

Bestandteil

Konzentration (mM)

(NH4)2S04

11,0

H3PO4

10,0

MgS04

0,4

CaCb

0,1

FeS04

33X10"3

ZnS04

1.0X10"3

MnS04

l,0x 10"3

H3BO3

l,0xl0"3

Q1SO4

0,5 x 10"3

Na2Mo04

0,2 x 10"3

C0CI2

0,2 xlO"3

KJ

0,5 xlO"3

H2SO4

l,0xl0-3

Die Fermentationsgefässe wurden mit 21 des Mediums beschickt, gerührt, belüftet und Methan und Luft, wie oben beschrieben, zugeführt. Jedes Fermentationsgefäss wurde mit 100 ml einer voll ausgewachsenen Schüttelkolbenkultur beimpft, und zwar das eine mit dem Gemisch T4 und das andere mit der reinen Kultur Methylococcus 999. Das Medium wurde in die Fermentationsgefässe mit einer Verdünnungsgeschwindigkeit, beginnend mit 0,10 h_1 und einer Zunahme von ungefähr 0,02 bis 0,03 h_1 eingeleitet, bis die Kultur begann, aus dem Fermentationskessel ausgewaschen zu werden. Der Gleichgewichtszustand wurde bei jeder Verdünnungsgeschwindigkeit mindestens 48 Stunden lang aufrechterhalten. Die Ergebnisse sind in Tabelle I zusammengefasst.

Tabelle I

Kultur maximale Ver

Trockengewicht- Ausbeute

dünnungsge konzentration

Koeffizient

schwindigkeit

(gxl-1)

g Trockengewicht/

(h"1)

g verbrauchtes

Methan)

T4

0,34

2,42

0,71

Methylococcus

999

0,31

2,14

0,66

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

623 356

Beispiel 2

Die gemischte Kultur T4 wurde mit verschiedenen Stickstoffquellen unter unterschiedlichen Bedingungen gezüchtet.

Die Kulturen wurden in 2,5-1-Gefässen unter Rühren wie in Beispiel 1 gezüchtet. Obwohl bei diesen Versuchen nicht streng auf aseptische Bedingungen geachtet wurde, änderten sich die mikrobiologischen Eigenschaften der Kultur nicht.

Die Züchtungsbedingungen waren: Temperatur 42 °C, pH-Wert 7,0, Verdünnungsgeschwindigkeit 0,18 h_1, Rührgeschwindigkeit 1000 UpM, Gesamtgasströmungsgeschwindigkeit 600 ml/min. Die Ausbeutekoeffizienten wurden berechnet aus der Analyse des in das Fermentationsgefäss eintretenden und daraus austretenden Gasstroms durch Gaschromatographie und durch sorgfältige Messung der Gasströmungsgeschwindigkeiten mit Hilfe eines Blasenzählers. Die Trockengewichtkonzentration der Mikroorganismen, die zwischen 4 und 5 g/1 lag, wurde abgeschätzt durch Messung der Differenz der Kohlenstoffkonzentration zwischen einer Kulturprobe und der überstehenden Flüssigkeit nach dem Zentrifu-gieren einer Probe mit 6000 g 15 Minuten lang. Der Kohlenstoffgehalt der im Ofen getrockneten Zellen erwies sich als konstant 48%.

Das angewandte Medium enthielt (g/1); KH2PO4:1,60; N a2HP04:1,16 ; MgSO-t • 7H20:0,080; FeSÛ4 • 7 H20:0,014 ; Ca(N03)2 • 4H20:0,025; 2,4 x 10-3 ; ZnSÛ4 • 7 H20:3,4 x 10"4; MnSO4-4H2O:3,0x IO"6; NaMo04-2H2Q:2,4x 10~4; CoCl2-6H20:1,5 x 10~4; konzentrierte Schwefelsäure (36n) wurde in einer Menge von 0,33 ml/1 zugegeben. Als Stickstoffquelle wurde NaN03(3,18 g l"1), (NHO2SO4 (2,46 g 1_1) oder Harnstoff (1,122 g/1) zugegeben.

Die Ergebnisse sind in Tabelle III angegeben.

Tabelle III

Wirkung der Stickstoffquelle und des begrenzenden Faktors auf kontinuierliche Kulturen des T4-Gemisches

Stickstoffquelle

NaNCb

(NH4)2S04

Harnstoff

Verhältnis Luft:Methan

im zugeführten Gas

3:1

6:1

3:1

6:1

3:1

das Wachstum begrenzender

Faktor

O2

CHt

O2

CH4

O2

Ausbeutekoeffizient

(g Zellen/g CH4)

0,65

0,63

0,69

0,83

0,76

±0,03

±0,03

±0,04

±0,02

±0,05

Beispiel 3

Die gemischte Kultur T4 wurde unter Rühren in einem 7-1-Fermentationsgefäss (Chemap Co. Ltd., Zürich, Schweiz) gezüchtet. Die Temperatur wurde auf 42 °C gehalten und der pH-Wert auf 7,4 durch automatische Zugabe einer 5n-Lösung 40 eines KOH/NaOH-Gemisches (1:1) oder 5n H2SO4, je nach Erfordernis. Ein Gemsich von Sauerstoff und Methan wurde durch das Fermentationsgefäss mit einer Geschwindigkeit von 21/min geleitet. Es wurde mit 1500 UpM gerührt. Das Volumen in dem Fermentationsgefäss wurde auf 4,41 gehalten mit Hilfe 45 eines Überlaufs, durch den die Kultur kontinuierlich abgepumpt wurde. Nährmedium wurde zu der Kultur in zwei Strömen zugegeben, und zwar 1. eine Lösung von NH4SO4 (150 mM), H3PO4 (45 mM), MgS04 (4,5 mM), CaCli (1,5 mM), FeS04 (0,6 mM) und 26,4 ml einer Lösung, enthaltend (g/1) ZnS04 • 7H20:0,18 ; Q1SO4 • 5H20:0,16 ; MnS04 • 4H20:0,15 ; C0CI3 • 6H20:0,18 ; Hs BO3:0,1 ; NaMoÜ4 • 2H20:0,3 ; und 2. entionisiertes Wasser. Diese Ströme wurden kontinuierlich zu der Kultur gepumpt, so dass die Gesamtfliessgeschwindigkeit immer der Verdünnungsgeschwindigkeit von 0,09 h_1 entsprach. Die relativen Fliessgeschwindigkeiten der Ströme wurden variiert. Da die Gaszufuhr mehr als ausreichend war,

wurde die Konzentration der Kultur begrenzt durch die Konzentration der Stickstoffquelle in dem gesamten Nährmedium. Dadurch nahm, wenn die Nährstoffzufuhr der Salzlösung gegenüber dem Wasserstrom erhöht wurde, die Konzentration der Mikroorganismen in der Kultur zu.

Ausgehend von einer Konzentration an Mikroorganismen, bezogen auf das Trockengewicht von 4,2 g/1, wurde die Fliessgeschwindigkeit der Salzlösung erhöht, bis eine Konzentration an Mikroorganismen, bezogen auf das Trockengewicht von 23 g/1, erreicht war und bei diesem Wert im Gleichgewichtszustand gehalten.

Beispiel 5 und Vergleichsbeispiel

Eine Kultur des Organismus Methylococcus 999 und der gemischten Kultur T4 wurden kontinuierlich, wie in Beispiel 1, auf einem 5-C-Medium gezüchtet mit einer Verdünnungsgeschwindigkeit von 0,08 h_1. Die Zellen wurden von der aus dem Reaktionskessel abgezogenen Kultur gewonnen, zentrifugiert und gefriergetrocknet. Der Proteingehalt (berechnet als n x — 6,25) war in beiden Fällen 69%. Die Aminosäureanalyse der Zellen von den beiden Kulturen ist in Tabelle IV angegeben.

Tabelle IV

Aminosäuregehalt der Zellen von T4 und Stamm 999 % rohes Protein (g/16 g n)

T4

999

8,55

8,29

4,42

4,34

3,49

3,40

9,39

9,27

7,39

6,53

5,41

4,68

7,66

6,32

6,31

5,99

N/D

0,57

2,32

2,59

3,83

4,21

7,28

7,30

2,17

3,97

4,59

4,65

0,05

0,18

5,49

5,24

5,63

5,04

2,02

2,06

Aminosäure

50

Aspartinsäure

Threonin

Serin

Glutaminsäure 55 Prolin Glycin Alanin Valin Cystin bo Methionin Isoleucin Leucin Tyrosin Phenylalanin 65 Ornithin Lysin Arginin Histidin

623356 6

Die in den Ansprüchen und in der Beschreibung erwähnten NCIB 11062 November 1973

Kulturen NCIB sind bei der National Collection of Industriai NCIB 11063 November 1973

Bacteria, Tory Research Station, 135 Abbey Road, Aberdeen, NCIB 11065 November 1973

AB9 8DG Scotland, hinterlegt worden und dort zugänglich. NCIB 11083 Juni 1974

Die Hinterlegung erfolgte zu den folgenden Zeitpunkten: 5 NCIB 11084 Juli 1974

NCIB 11061 November 1973 NCIB 11112 Oktober 1974

G

Claims (7)

1. 623356 1

   PATENTANSPRÜCHE Mikroorganismen, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man

   1. Verfahren zur Züchtung Mikroorganismen unter aeroben unter aeroben Bedingungen in einem flüssigen Wachstums-Bedingungen in einem flüssigen Wachstumsmedium, umfas- medium, umfassend assimilierbare Stickstoffquellen und essensend assimilierbare Stickstoffquellen und essentielle Salze, in " tielle Mineralsalze, in Gegenwart von Methangas einen meth-Gegenwart von Methan und Gewinnung der Mikroorganismen 5 anverbrauchenden Mikroorganismus, der ein Stamm von Metaus dem flüssigen Wachstumsmedium, dadurch gekennzeich- hylococcus ist, in Gegenwart von a) einem oder mehreren met-net, dass man einen methanverbrauchenden Mikroorganismus, hanoiverbrauchenden Mikroorganismen züchtet, die imstande der ein Stamm von Methylococcus ist, in Gegenwart von a) sind, das von den wachsenden methanverbrauchenden einem oder mehreren methanolverbrauchenden Mikroorganis- Mikroorganismen gebildete Methanol zu metabolisieren und b) men, die imstande sind, das von dem wachsenden methanver- io einem oder mehreren nicht-methylotrophen Mikroorganismen, brauchenden Mikroorganismus gebildete Methanol zu metabo- die imstande sind, organische Substanzen zu metabolisieren, lisieren und b) einem oder mehreren nicht-methylotrophen die von den methan- und/oder methanolverbrauchenden Mikroorganismen, die imstande sind, die organischen Substan- Mikroorganismen gebildet worden sind, und die Mikroorganis-zen zu metabolisieren, die von dem methan- und/oder metha- men aus dem flüssigen Wachstumsmedium gewinnt, nolverbrauchenden Mikroorganismus gebildet worden sind, i 5 Ein methanverbrauchender Mikroorganismus, der für das züchtet. erfindungsgemässe Verfahren besonders geeignet ist, ist der
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, Stamm Methylococcus 999, der ein neuer Bakterienstamm ist, dass man als methanverbrauchenden Methylococcusstamm und die NCIB-Nr. 11083 besitzt. Andere methanverbrauchende den Mikroorganismus Methylococcus 999 mit der NCIB-Nr. Bakterien können ebenfalls in der Kultur vorhanden sein, zum

   11083 verwendet. 20 Beispiel Methylomonas SM3 (NCIB-Nr. 11084), der in der NL-
3. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeich- Anmeldung 7416644 beschrieben ist.

   net, dass zusätzlich der methanverbrauchende Mikroorganis- Geeignete methanolverbrauchende Mikroorganismen für mus Methylomonas SM3 mit der NCIB-Nr. 11084 in dem flüssi- das erfindungsgemässe Verfahren umfassen Stämme von gen Wachstumsmedium vorhanden ist. Hyphomicrobium (zum Beispiel NCIB-Nr. 11040), Pseudomo-
4. 4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeich- 25 nas extorquens und Pseudomonas methylotropha (zum Beispiel net, dass man als methanolverbrauchenden Mikroorganismus NCIB-Nr. 10508 bis 10515 und 10592 bis 10596) und besonders einen Stamm von Hyphomicrobium, Pseudomonas extorquens obligat-methanolverbrauchende Mikroorganismen wie den als oder Pseudomonas methylotropha oder den Mikroorganismus- OML bezeichneten Stamm (NCIB-Nr. 11112), der in der NL-stamm OML mit der NCIB-Nr. 11112 verwendet. Anmeldung 74 16644 beschrieben ist.

   ^Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeich- 30 Beispiele für geeignete nicht-methylotrophe Mikroorganis-net, dass man als nicht-methylotrophe Mikroorganismen Arten men für das erfindungsgemässe Verfahren umfassen Stämme von Pseudomonas mit der NCIB-Nr. 11062,11063 und/oder von Pseudomonas (zum Beispiel NCIB-Nr. 11019 und 11022),

   11065 und/oder einen Mikroorganismus der Art Mycobacte- Acinetobacter (zum Beispiel NCIB-Nr. 11020), Curtobacterium rium mit der NCIB-Nr. 11061 verwendet. (zum Beispiel NCIB-Nr. 11021), Nocardiaceae, Mycobacteria-
5. 6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, 35 ceae und Achromobacteriaceae und besonders Mycobacte-dass man als methanverbrauchende Mikroorganismen, metha- rium (NCIB-Nr. 11061) und drei Pseudomonas-Stämme nolverbrauchende Mikroorganismen und nichtmethylotrophe (NCIB-Nr. 11062,11063,11065), die in der NL-Anmeldung Mikroorganismen eine gemischte Kultur, umfassend den 7416644 beschrieben sind.

   Mikroorganismus Methylococcus 999 mit der NCIB-Nr. 11083, Gemischte Kulturen, die für das erfindungsgemässe Verfah-den Mikroorganismus OML mit der NCIB-Nr. 11112, den 40 ren geeignet sind, können folgendermassen erhalten werden: Stamm der Art Mycobacterium mit der NCIB-Nr. 11061 und a) Gemischte Kulturen, umfassend einen methanverbrau-

   die Stämme der Arten Pseudomonas mit den NCIB-Nr. 11062, chenden Mikroorganismus zusammen mit einem oder mehre-11063 und 11065 verwendet. ren methanolverbrauchenden Mikroorganismen und einem
6. 7. Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeich- oder mehreren nicht-methylotrophen Mikroorganismen, könnet, dass man die Temperatur der Kultur auf 30 bis 60 °C hält. 45 nen aus natürlichen Quellen isoliert werden. Eine besonders
7. 8. Verfahren nach Anspruch 1 bis 7, dadurch gekennzeich- geeignete gemischte Kultur für das erfindungsgemässe Verfah-net, dass man den pH-Wert der Kultur auf 6,0 bis 8,0 einstellt. ren (im folgenden als T4 bezeichnet) umfasst Methylococcus

   999 (NCIB-Nr. 11083), OML (NCIB-Nr. 11112), Mycobacterium (NCIB-Nr. 11061) und drei Pseudomonas-Stämme (NCIB-Nr.

   50 11062,11063 und 11065).

   b) Geeignete gemischte Kulturen können auch erhalten werden durch Zusammengeben von einem oder mehreren

   Es sind zahlreiche Mikroorganismen bekannt, die Kohlen- Stämmen von Methylococcus mit einem oder mehreren Stäm-wasserstoffe oder bestimmte oxidierte oder andere Derivate men von methanolverbrauchenden Mikroorganismen und von Kohlenwasserstoffen als Kohlenstoff- und/oder Energie- 55 einem oder mehreren Stämmen von nicht-methylotrophen quelle verwenden können. Die durch Züchtung derartiger Mikroorganismen.

   Mikroorganismen gewonnene Biomasse, die häufig als Einzel- Der Stamm Methylococcus 999 (NCIB 11083) ist ein neuer len-Protein (SCP) bezeichnet wird, ist reich an Protein und Mikroorganismus, der auch gut in Form einer reinen Kultur in kann als möglicher Nährstoff oder Nährstoffzusatz für Men- einem flüssigen Medium wächst.

   sehen und Tiere verwendet werden. Von besonderem Interesse 60 Wenn Harnstoff als Stickstoffquelle angewandt wird, wird in diesem Zusammenhang sind Mikroorganismen, die imstande der Stamm Methylococcus 999 vorzugsweise in Gegenwart sind, gasförmige organische Verbindungen, enthaltend ein oder eines urease-positiven nicht-methylotrophen Mikroorganismus mehrere Kohlenstoffatome im Molekül, zum Beispiel Methan, gezüchtet.

   zu verwerten. Die gemischte Kultur T4, die besonders bevorzugt ist für

   Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein verbessertes 65 das erfindungsgemässe Verfahren, wurde aus einer Schlamm-Verfahren zur Züchtung von methanverbrauchenden Mikroor- probe von einer in den Tropen gelegenen Entenfarm gewon-ganismen zu entwickeln. nen. 2 g der Schlammprobe wurden in einem 250-ml-Schüttel-