DE2610478C2 - Verfahren zum Züchten von Mikroorganismen - Google Patents

Description

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man zusätzlich den methanverbrauchenden Stamm Methylomonas NCIB 11084 züchtet

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) den methanverbrauchenden und methanolbildenden Stamm Methylococcus NCIB 11083,

b) den methanolverbrauchenden Stamm NCIB 11112 und

c) die nicht-methylotrophen Stämme Pseudomonas NCIB 11062, Pseudomonas NCIB 11063, Pseudomo- — nas NCIB 1 !065 und Mycobacterium NCIB 1J061 züchtet

Es sind zahlreiche Mikroorganismen bekannt, die Kohlenwasserstoffe oder bestimmte oxidierte oder andere Derivate von Kohlenwasserstoffen als Kohlenstoff- und/oder Energiequelle verwenden können. Die durch Züchtung derartigen Mikroorganismen gewonnene Biomasse, die häufig als Einzellen-Protein (SCP) bezeichnet wird, ist reich an Protein und kann als möglicher Nährstoff oder Nährstoffzusatz für Menschen und Tiere verwendet werden. Von besonderem Interesse in diesem Zusammenhang sind Mikroorganismen, die imstande sind, gasförmige organische Verbindungen, enthaltend ein oder mehrere Kohlenstoffatome im Molekül, z. B. Methan, zu verwerten. Aus der GB-PS 13 66 711 ist ein solches Verfahren zur Züchtung eines methan- bzw. methanolverbrauchenden Mikroorganismus bekannt.

Es ist Aufgabe der Erfindung, ein verbessertes Verfahren zur Züchtung von Mikroorganismen zu entwickeln, bei dem auf einfache Weise schnell eine größere Menge Biomasse gebildet wird.
Die Erfindung betrifft das im Anspruch 1 angegebene Verfahren.

In vorteilhafter Weise kann der methanverbrauchende Mikroorganismus Methylomonas SM3 (NCIB Π084), der in der NL-OS 74 16 644 beschrieben ist, ebenfalls in der Kultur vorhanden sein.

Der methanolverbrauchende Mikroorganismus NCIB 1112 ist ebenfalls in der NL-OS 74 16 644 beschrieben.
Die nicht-methylotrophen Mikroorganismen Mycobacterium (NCIB 11061) und die drei Pseudomonas-Stämme (NCIB 11062,11063,11065) sind in der NL-OS 74 16 644 beschrieben.
Eine weitere Ausgestaltung der Erfindung nennt der Anspruch 3.

Der Stamm Methylococcus 999 (NCIB 11083) ist ein neuer Mikroorganismus, der auch gut in Form einer

reinen Kultur in einem flüssigen Medium wächst. Er wächst auch gut auf Methan in Gegenwart von einem oder mehreren nicht-methylotrophen Mikroorganismen ohne Zusatz von methanolverbrauchenden Mikroorganismen. Wenn Harnstoff als Stickstoffquelle angewandt wird, wird der Stamm Methylococcus 999 vorzugsweise in Gegenwart eines urease-positiven nicht-methylotrophen Mikroorganismus gezüchtet.

Die gemischte Kultur T4, die erfindungsgemäß eingesetzt wird, wurde aus einer Schlammprobe von einer in den Tropen gelegenen Entenfarm gewonnen. 2 g der Schlammprobe wurden in einen 250-ml-Schüttelkolben gegeben, der 25 ml 1-NSM-Medium (wie später näher beschrieben) enthielt und zweimal täglich mit einem Gemisch, bestehend aus 40 Vol.-% Methan, 50 Vol.-% Luft und 10 Vol.-°/o CO2, begast. Der Kolben wurde auf einer Rotationsschüttelvorrichtung mit einem Orbitalradius von 2,5 cm mit 200 UpM eine Woche bei 40⁰C geschüttelt. Die Kultur, in der eine Trübung entstanden war, wurde in Unterkulturen weitergezüchtet, wobei 2 ml Inokulum unter aseptischen Bedingungen in ähnliche Schüttelkolben gegeben wurden. Es wurde einige Male wiederholt und nachdem ein gutes Wachstum erhalten worden war, wurde die Kultur in dem Schüttelkolben angewandt, um eine kontinuierliche Kultur unter den in Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen zu beimpfen. Nach mehr als 100 Stunden kontinuierlicher Züchtung hatte sich eine stabile gemischte Bakterienkultur entwikkelt, in der der überwiegende Organismus ein kokkoides methanverbrauchendes Bakterium war. Die Charakteristika der als T4 bezeichneten gemischten Kultur sind im einzelnen unten beschrieben.

Die Isolierung einer reinen Kultur des methanverbrauchenden Mikroorganismus aus dem Gemisch T4 erwies sich mit Hilfe üblicher Agar-Plattenverfahren als unmöglich, da nur gemischte Kulturen auf diese Weise auf den Platten entstanden. Es ist offensichtlich, daß bei Anwendung dieser Verfahren das Wachstum des methanolverbrauchenden Organismus abhängt von dem Vorhandensein heterotropher (nicht-methylotropher) Bakterien in dem Gemisch. Es wurde das folgende Verfahren angewandt: 1 ml der gemischten Kultur T4 (ungefähr 2 g/l) wurde mit 40 ml einer sterilen geschmolzenen Lösung (55°C) aus 1% Bacto-Difco-Agar in 2-ASM-Medium(wie später näher beschrieben) vermischt und das Gemisch in sterile Petri-Schalen gegossen und zum Verfestigen !.^

stehengelassen. ji|

Eine zweite Agarschicht wurde über diese Schicht gegossen und ein steriles Millipore-Membranfilter auf diese ||

zweite Schicht gelegt. aiii

Proben der gemischten Kultur T4 wurden auf die Membran aufgestrichen. Nach 4 Tagen Inkubation bei 40° C wurden Kolonien beobachtet Diese erwiesen sich als reine Kolonien des kokkoiden methanverbrauchenden Bakteriums, Mythylococcus 999 (NCIB 11083).

Dieser isolierte Organismus würde nicht als reine Kultur auf Agarplatten wachsen, wenn nicht ein sehr schweres Inokulum angewandt würde oder wenn nicht das oben beschriebene Verfahren mit übereinanderliegenden Schichten angewandt würde. Das Bakterium wuchs jedoch gut als reine Kultur in flüssiger Kultur.

Die Kultur T4 umfaßt den methanverbrauchenden Stamm Methylococcus 999 (NCIB 11083) sowie einen methanolverbrauchenden Stamm (NClB 11112) und vier heterotrophe Stämme (NCIB 11061,11062,11063 und 11065).

Der methanverbrauchende Organismus ist offensichtlich eine bisher noch nicht beschriebene Spezies eines Methylococcus aufgrund der folgenden Identifizierung:

Membrantyp:

Zellform:

Zelldurchmesser:

Wachstum bei 37° C:

Wachstum bei 42° C:

W-u-chsiumbei55°C:

Wachstum auf Methanol:

Verstärkung des

Wachstums durch:

Hefeextrakt

Acetat

Succinat

Beweglichkeit

Kapsel gebildet:

Kolonienfarbe:

wasserlösliches Pigment:

Gramfärbung:

II stapelartige Membran (Whittenbury et al. Journal of
General Microbiology (1970), 61,205)
Kokki
ungefähr 0,9 nm

weiß-braun

Gram variabel; die Gramfärbung variierte mit den
Wachstumsbedingungen der Zellen. Zellen von einer kontinuierlichen Kultur, die auf einem Nitratmedium wuchsen, waren Gram positiv, aber Zellen von einer Kultur auf
einem Ammoniakmedium waren Gram negativ.

keine Reaktion

(+ = empfindlich;— = nicht empfindlich)

Katalase:

Oxidase:

Glukosesäure:

OF(Hugh Leifson):

Oxidation Alkane:

Empfindlichkeit gegenüber Antibiotika:

Chloramphenicol 10 μg:

Erythromycin 10 μg: —

SuIf afurasol 100 μg: +

Novobiocin 5 μg: —

Oleandomycin 5 μg: —

Pencillin G 1,5 Einheiten: +

Streptomycin 10 μg: +

Tetracyclin 10 μg: +

Cephaloridin 5 μg: —

Kenamycin 5 μg: +

Ampicillin 2 μg: +

Entsprechend diesen Charakteristika scheint der Organismus ein Stamm von Methylococcus zu sein. Er unterscheidet sich jedoch von allen bisher beschriebenen Methylococcusstämmen, indem er bei 55° C wächst und auf Mineralsalz-Agarplatten keine Kolonien bildet, solange nicht das oben beschriebene Verfahren angewandt wird.

Das bei dem erfindungsgemäßen Verfahren angewandte flüssige Wachstumsmedium umfaßt eine stickstoffhaltige Verbindung die Ammoniak, Harnstoff, ein Ammoniumsalz wie ein Sulfat, Chlorid oder Nitrat, z. B. ein Alkalinitrat, sein kann. Die Verbindung ist günstigerweise in einer Konzentration von 3 bis 50 g/l vorhanden.

Andere Elemente, die in dem Medium vorhanden sein können, sind: Phosphor, Schwefel, Magnesium und Eisen. Die Phosphorquelle besteht vorzugsweise aus einem oder mehreren Phosphaten, z. B. K₂HPO₄, KH₂PO₄, Na₂HPO₄ oder (NH₄)₂HPO₄, oder Phosphorsäure, vorzugsweise in einer Konzentration von 3 bis 20 g/l. Die Schwefelquelle kann Schwefelsäure oder ein Sulfat sein, wie (NH₄)₂SO₄, günstigerweise in einer Konzentration von 0,5 bis 5,0 g/l. Die beiden Metalle werden in Form des einen oder anderen ihrer Salze zugesetzt, z. B. MgSO₄-7H₂O in einer Konzentration von 0,2 bis 2,0 g/l und FeCb-OH₂O in einer Konzentration von 0,01 bis

Das Medium kann auch Spuren anderer Elemente in Form geeigneter Salze enthalten, z. B. Calcium, Mangan, Zink, Kobalt Molybdän und Bor. Beispiele für geeignete Medien umfassen:
1-NSM der folgenden Zusammensetzung

KH₂PO₄ 1.6 g/l

Na₂HPO₄ 1,16 g/l

NaNO₃ 1,18 g/l

MgSO₄-7H₂O 0,08 g/l

FeSOWH₂O 0,014 g/I

Ca(NO₃)₂-4H₂O 0,025 g/l

CuSO₄-5H₂O 4 χ 10-3 g/I

ZnSO₄ · 7H₂O 3,4 χ 10"⁴ g/l

MnSO₄ -4H₂O 3 χ 10-" g/l

Na₂MoO₄ · 2H₂O 2,4 χ 10~⁴ g/l

2-ASM mit der gleichen Zusammensetzung wie 1-NSM mit der Ausnahme, daß es 1,18 g (NH₄J₂SO₄Zl anstelle von NaNO₃ enthält

3-USM mit der gleichen Zusammensetzung wie 1-NSM mit der Ausnahme, daß es 2,0 g Harnstoff/1 anstelle von NaNO₃ enthält
5-C der folgenden Zusammensetzung

KH₂PO₄ 1,6 g/l

Na₂HPO₄ 1,16 g/l

NaNO₃ 3.18 g/l

MgSO₄-7H₂O 0,107 g/l

FeSO₄-7H₂O 0,009 g/l

Ca(NO₃)₂-4H₂O 0,06 g/l

CuSO₄-5H₂O 3 xlO-⁴ g/l

ZnSO₄-7H₂O 3,6 XlO-⁴ g/l

MnSO₄-H₂O 5xlO-⁴g/l

Na₂MoO₄-2H₂O 3,1 χ 10-" g/l

CoCl₂-OH₂O 1,5 xlO-⁴ g/l

Das erfindungsgemäße Verfahren kann ansatzweise, halbkontinuierlich, aber vorzugsweise in einer kontinuierlichen Fließkultur durchgeführt werden. Um ein Wachstum zu erzielen, werden die Mikroorganismen in das flüssige Medium geimpft, das mit einem Gasgemisch, enthaltend Methan und Sauerstoff, zusammengebracht wird. Methan kann in Form von natürlichem Gas zugeführt werden. Für eine kontinuierliche Fließkultur können die Mikroorganismen in irgendeinem geeigneten Fermentationsgefäß wachsen, z. B. in einem Fermentationsgefäß mit Ablenkblechen unter Rühren oder einem Sprühturmfermentor, der entweder mit einer inneren Kühlung oder einer äußeren Rückführ-Kühlschleife versehen ist. Frisches Medium wird kontinuierlich zu der Kultur mit Geschwindigkeiten entsprechend 0,02 bis 1,0 Kulturvolumina/Stunde zugeführt und die Kultur mit einer solchen Geschwindigkeit abgezogen, daß das Volumen der Kultur konstant bleibt. Ein Gasgemisch, enthaltend Methan und Sauerstoff und gegebenenfalls Kohlendioxid oder andere Gase, wird mit dem Medium zusammengebracht, vorzugsweise durch kontinuierliches Einleiten durch eine Sprühdüse am Boden des Gefäßes. Die Sauerstoffquel-Ie für die Kultur kann Luft, Sauerstoff oder mit Sauerstoff angereicherte Luft sein. D^s verbrauchte Gas bzw. Abgas wird am Kopf des Gefäßes abgezogen. Es kann entweder durch eine äußere Schleife oder von innen mit Hilfe eines Gaseinführpropellers zurückgeführt werden. Der Gasfluß und die Rückführung sollten so durchgeführt werden, daß man ein maximales Wachstum des Organismus und eine maximale Ausnutzung von Methan erhält.

Die Temperatur der Kultur wird im allgemeinen bei 30 bis 60⁰C und vorzugsweise 38 bis 50⁰C gehalten. Der pH-Wert der Kultur wird auf einen Wert zwischen 6,0 und 8,0 und vorzugsweise zwischen 6,0 und 7,0 eingestellt durch Zugabe von Alkali, z. B. NaOH, KOH, NH₄OH und/oder Säure, z. B. H₂SO₄ oder H₃PO₄.

Die Mikroorganismuszellen können von dem Wachstumsmedium nach irgendeinem üblicherweise angewandten Standardverfahren gewonnen werden, z. B. durch Ausflocken, Sedimentieren und/oder Ausfällen und anschließendes Zentrifugieren und/oder Filtrieren. Die Biomasse wird dann getrocknet, z. B. gefriergetrocknet oder Sprühgetrocknet und kann in dieser Form als Proteinnährstoff oder Nährstoffzusatz für Menschen oder Tiere angewandt werden.

Die Erfindung wird durch die folgerden Beispiele näher erläutert:

B e i s ρ i e 1 1

Kontinuierliche Kulturen sowohl von der gemischten Kultur T4 als auch der reinen Kultur von Methyiococcus 999 wurden unter aseptischen Bedingungen unter Rühren in Fermentationsgefäßen mit einem Arbeitsvolumen von 2,5 1 gezüchtet. Es wurde ein Methan-Luft-Gemisch (Volumenverhältnis 2:1) durch die Flüssigkeit in den Fermentationsgefäßen mit einer Geschwindigkeit von 900 bis 1200 ml/min geleitet. Die Temperatur der Kulturen wurde auf 42°C gehalten und der pH-Wert durch automatische Zugabe eines Gemisches von 0,5n NaOH und 0,5n KOH auf 6,8 gehalten. Die Kultur wurde mit einer Geschwindigkeit von 1200 UpM gerührt. Frisches Medium wurde kontinuierlich zu der Kultur zugeführt mit Hilfe einer peristaltischen Pumpe und die Kultur

wurde mit der gleichen Geschwindigkeit abgepumpt, um ein konstantes Volumen in dem Fermentationskessel aufrechtzuerhalten. Das Wachstumsmedium besaß die folgende Zusammensetzung:

Bestandteil Konzentration (mM)

(NH₄)₂SO4 H₃PO₄ MgSO₄

CaCl₂ 0,1

FeSO₄ ZnSO₄ MnSO₄ H₃BO₃

CuSO₄ 0,5 χ 10-3

Na₂MoO₄ CoCl₂ KJ

H₂SO₄

Die Fermentationsgefäße wurden mit 2 I des Mediums beschickt, gerührt, belüftet und Methan und Luft, wie oben beschrieben, zugeführt. Jedes Fermentationsgefäß wurde mit 100 ml einer voll ausgewachsenen Schüttelkolbenkultur beimpft, und zwar das eine mit dem Gemisch T4 und das andere mit der reinen Kultur Methylococcus 999. Das Medium wurde in die Fermentationsgefäße mit einer Verdünnungsgeschwindigkeit, beginnend mit 0,10 h-' und einer Zunahme von ungefähr 0,02 bis 0,03 h-' eingeleitet, bis die Kultur begann, aus dem Fermentationskessel ausgewaschen zu werden. Der Gleichgewichtszustand wurde bei jeder Verdünnungsgeschwindigkeit mindestens 48 Stunden lang aufrechterhalten. Die Ergebnisse sind in Tabelle I zusammengefaßt.

Tabelle i

11,0	ΙΟ"3	ΙΟ-3
10,0	X	10-3
0,4	X	10-3
0,1	X	10-3
33 χ	X	10-3
1,0	X	ΙΟ-3
1,0	X	ΙΟ-3
1,0	X	ΙΟ"3
0,5	X
0.2
0,2
0,5
1.0

Kultur	maximale Ver	Trockengewicht	Ausbeute-Koeffizient
	dünnungsge	konzentration	(g Trockengewicht/
	schwindigkeit	(g χ i-1)	g verbrauchtes Methan)
	(h-i)

T4 0,34 2,42 0,71

Methylococcus 999 0,31 2,14 0,66

Beispiel 2

Nicht-kontinuierliche Kulturen des Organismus Methylococcus 999 allein und dieses Organismus im Gemisch mit einem ureasepositiven Bazillus, der nicht imstande ist, auf Methan zu wachsen, aber imstande ist, auf Substanzen, die durch den Organismus Methylococcus 999 gebildet worden sind, zu wachsen, wurden bei 42° C in >

einem einfachen Salzmedium in sterilen Glasgefäßen mit einem Fassungsvermögen von 500 ml gezüchtet durch das kontinuierlich Methan, Luft und CO₂ mit einer Geschwindigkeit von 25, 100 bzw. 10 ml/min über einen Sintersol-Glasfilter geleitet wurde.

Die Kolben wurden mit 1,5 ml frischem Inokulum beimpft. Das Medium in den Gefäßen war 300 ml 3-USM. Das Wachstum wurde bestimmt durch Messung der optischen Dichte (OD) bei 625 nm. Die Ergebnisse sind in Tabelle II angegeben.

Der urease-positive Bazillus besitzt die folgenden Charakteristika: Gramfärbung + , stäbchenförmig, nichtmotil, Wachstum an der Luft +, Katalase +, Oxidase —, Glukosesäure (Gas) +, OF (Hugh & Leifson) +, Urease +,keine Denitrifikation

Tabelle II '.1

Wachstum von Methylococcus 999 und gemischter Kultur (OD bei 625 nm) g

Mittelwerte von drei Kulturen i§

Kultur Zeit(h) P

0 24 96 120 _ω ψ

Methylococcus 999 allein · 0,005 0,005 0,029 0,054 || Methylococcus 999 im Gemisch 0,005 0,229 0,490 0,550 ||

trat dem urease-positiven Bazillus β

Diese Ergebnisse zeigen, daß der Organismus Methylococcus 999 nur dann gut auf Harnstoff wächst, wenn ein urease-positiver Organismus ebenfalls vorhanden ist

Beispiel 3

Die gemischte Kultur T4 wurde mit verschiedenen Stickstoffquellen unter unterschiedlichen Bedingungen gezüchtet.

Die Kulturen wurden in 2,5-1-Gefäßen unter Rühren wie in Beispiel 1 gezüchtet. Obwohl bei diesen Versuchen nicht streng auf aseptische Bedingungen geachtet wurde, änderten sich die mikrobiologischen Eigenschaften der Kultur nicht.

Die Züchtungsbedingungen waren: Temperatur 42^CC, pH-Wert 7,0, Verdünnungsgeschwindigkeit 0,18 h~', Rührgeschwindigkeit 1000 UpM, Gesamtgasströmungsgeschwindigkeit 600 ml/min. Die Ausbeutekoeffizienten ίο wurden berechnet aus der Analyse des in das Fermentationsgefäß eintretenden und daraus austretenden Gasstroms durch Gaschromatographie und durch sorgfältige Messung der Gasströmungsgeschwindigkeiten mit Hilfe eines Blasenzählers. Die Trockengewichtkonzentration des Organismus, die zwischen 4 und 5 g/l lag, wurde abgeschätzt durch Messung der Differenz der Kohlenstoffkonzentration zwischen einer Kulturprobe und der überstehenden Flüssigkeit nach dem Zentrifugieren einer Probe mit 6000 g 15 Minuten lang. Der Kohlenstoffgehalt der im Ofen getrockneten Zellen erwies sich als konstant 48%.
Das angewandte Medium enthielt (g/l):

KH₂PO₄ :1,60; Na₂HPO₄ : 1,16; MgSO₄ ■ 7H₂O : 0,080; FeSO₄ · 7H₂O : 0,014;
Ca(NO₃)₂ · 4H₂O :0,025;CuSO₄ · 5H₂O :4 χ 10-3;ZnSO₄ · 7H₂O : 3,4 χ 10-⁴;
MnSO₄ · 4H₂O : 3,0 χ ΙΟ"⁶; NaMoO₄ · 2H₂O : 2,4 χ 10"⁴; CoCl₂ ■ 6H₂O : 1,5 χ 10-";

konzentrierte Schwefelsäure (36n) wurde in einer Menge von 0,33 ml/l zugegeben. Als Stickstoffquelle wurde NaNO₃(3,18 g/l),(NH₄J₂SO₄(2,46 g/l) oder Harnstoff (1,122 g/l)zugegeben.

Die Ergebnisse sind in Tabelle III angegeben.

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Tabelle III

Wirkung der Stickstoffquelle und des begrenzenden Faktors auf kontinuierliche Kulturen des T4-Gemisches

Stickstoffquelle	6:1	4	(NH4J2SO4	6:1	Harnstoff
NaNO3	CH4		3:1	CH4	3:1
3:1	0,63	O2	0,83	O2
O2	±0,03	0,69	±0,02	0,76
0,65	±0,04		±0,05
±0,03
Beispiel

Verhältnis Luft: Methan im zugeführten Gas
das Wachstum begrenzender Faktor
Ausbeutekoeffizient (g Zellen/g CH₄)

Die Kultur wurde unter Rühren in einem 7-1-Fermentationsgefäß gezüchtet. Die Temperatur wurde auf 42°C gehalten und der pH-Wert auf 7,4 durch automatische Zugabe einer 5n-Lösung eines KOH/NaOH-Gemisches (1:1) oder 5n H₂SO₄, je nach Erfordernis. Ein Gemisch von Sauerstoff und Methan wurde durch das Fermentationsgefäß mit einer Geschwindigkeit von 2 l/min geleitet. Es wurde mit 1500 UpM gerührt. Das Volumen in dem Fermentationsgefäß wurde auf 4,4 1 gehalten mit Hilfe eines Überlaufs, durch den die Kultur kontinuierlich abgepumpt wurde. Nährmedium wurde zu der Kultur in zwei Strömen zugegeben, und zwar 1. eine Lösung von NH₄SO₄ (150 ml), H₃PO₄ (45 mM), MgSO₄ (4,5 mM), CaCl₂ (1,5 mM), FeSO₄ (0,6 mM) und 26A ml einer Lösung, enthaltend (g/l) ZnSO₄-7H₂O:0,18; CuSO₄-5HO:0,16; MnSO₄-4H₂O:0,15; CoCl₃-6H₂O:0,18; H₃BO₃:0,l; NaMoO₄-2H₂0:0,3; und 2. entionisiertes Wasser. Diese Ströme wurden kontinuierlich zu der Kultur gepumpt, so daß die Gesamtfließgeschwindigkeit immer der Verdünnungsgeschwindigkeit — 1 von 0,09 h entsprach. Die

so relativen Fließgeschwindigkeiten der Ströme wurden variiert Da die Gaszufuhr mehr als ausreichend war, wurde die Konzentration der Kultur begrenzt durch die Konzentration der Stickstoffquelle in dem gesamten Nährmedium. Dadurch nahm, wenn die Nährstoffzufuhr der Salzlösung gegenüber dem Wasserstrom erhöht wurde, die Konzentration des Organismus in der Kultur zu.

Ausgehend von einer Konzentration an Organismus, bezogen auf das Trockengewicht von 4,2 g/l, wurde die

Fließgeschwindigkeit der Salzlösung erhöht, bis eine Konzentration an Organismus, bezogen auf das Trockengewicht von 23 g/L erreicht war und bei diesem Wert im Gleichgewichtszustand gehalten.

Beispiel 5

Eine Kultur des Organismus Methylococcus 999 und der gemischten Kultur T4 wurden kontinuierlich, wie in Beispiel 1, auf einem 5-C-Medium gezüchtet mit einer Verdünnungsgeschwindigkeit von 0,08 h-¹. Die Zellen wurden von der aus dem Reaktionskessel abgezogenen Kultur gewonnen, zentrifugiert und gefriergetrocknet Der Proteingehalt (berechnet als N χ 6,25) war in beiden Fällen 69%. Die Aminosäureanalyse der Zellen von den beiden Kulturen ist in Tabelle IV angegeben.

65

Tabelle IV

Aminosäuregehalt der Zellen von T4 und Stamm 999

Aminosäure

% rohes Protein (g/16 g n)	999
T4	8,29
8,55	4,34
4,42	3,40
3,49	9,27
9,39	6,53
7,39	4,68
5,41	6,32
7,66	5,99
6,31	0,57
nicht bestimmt	2,59
2,32	4,21
3,83	7,30
7,28	3,97
2,17	4,65
4,59	0,18
0,05	5,24
5,49	5,04
5,63	2,06
2,02

Aspartinsäure Threonin

Serin 3,49 3,40 ίο

Glutaminsäure Prolin Glycin Alanin

Valin 6,31 5,99 15

Cystin Methionin Isoleucin Leucin

Tyrosin 2,17 3,97 20

Phenylalanin Ornithin Lysin Arginin

Histidin 2,02 2,06 25

Claims (1)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Züchtung vor Mikroorganismen unter aeroben Bedingungen in einem flüssigen Wachstumsmedium, umfassend assimilierbare Stickstoffquellen und essentielle Salze, in Gegenwart von Methan und Gewinnung der Mikroorganismen aus dem flüssigen Wachstumsmedium, dadurchgekennzeichn e t, daß man

a) den methanverbrauchenden und methanolbildenden Stamm Methylococcus NCIB 11083,

b) den methanolverbrauchenden Stamm NCIB 11112 und

ίο c) den nicht-methylotrophen Stamm Pseudomonas NCIB 11062, Pseudomonas NCIB 11063 und/oder Pseudomonas NCIB 11065 und/oder Mycobacterium NCIB 11061 züchtet