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"Verfahren zur Gerinnung von Einzeller-.
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protein auf Basis von Methanol" Der zunehmende Bedarf an Protein
für die menschliche und tierische Ernährung machen es erforderlich, neue Verfahren
zur Gewinnung hochwertigen Proteins zu entwickeln. So wurde in den letzten Jahren
die Produktion von Protein aus Mikroorganismen untersucht, die als Kohlenstoffquelle
gasförmige Kohlenwasserstoffe wie Methan oder flüssige Kohlenwasserstoffe aus Erdölfraktionen
verwerten können. Die gasförmigen Kohlenwasserstoffe haben jedoch die Nachteile,
daß sie eine geringe Wasserlöslichkeit aufweisen und bei den aeroben Züchtungsbedingungen
explosive Gasgemische entstehen.
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Die flüssigen Kohlenwasserstoffe haben die Nachteile, daß sie ebenfalls
nur eine minimale Wasserlöslichkeit besitzen, was zur Verteilung der zwei flüssigen
Phasen einen erhöhten Energiebedarf bedingt. Außerdem muß bei der auf flüssigen
Kohlenwasserstoffen gewachsenen Zellmasse mindestens eine Extraktion mit organischen
Lösungsmitteln durchgeführt werden.
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Als besonders günstige Kohlenstoff- und Energiequelle für die Züchtung
von Mikroorganismen in großem Maßstabe wird seit einigen Jahren Methanol diskutiert.
Dieses Substrat hat die Vorteile, daß es in chemisch definierter reiner Form und
preiswürdig aus Synthesegas zugänglich ist, welches aus verschiedenen Rohstoffen
wie Erdgas, Fraktionen des Erdöls, Steinkohle oder Braunkohle erzeugt werden kann.
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Aus der DT-OS 2 040 358 ist ein Verfahren zur Herstellung von Einzellerprotein
bekannt, bei dem aus der Oxidation von flüssigen Alkanen entstandenen Alkoholen,
Aldehyden, Ketonen, Carbonsäuren und deren Derivate als Kohlenstoffquellen verwendet
werden.
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Aus der DT-AS 2 152 039 ist die Gewinnung von Bakterien-Zellmasse
in einem methanolhaltigen Nährmedium durch die Verwendung der Bakterien-Stämme:
Protaminobacter ruber var. machidanus ATCC 21 611, ATCC 21 612, ATCC 21 613 oder
ATCC 21 614 bekannt.
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Aus der DT-OS 2 311 006 ist ein Verfahren zur Proteinherstellung bekannt,
bei welchem der aerobe Mikroorganismus Methylomonas methanolica NRRL-B-5458 auf
Methanol als einziger Kohlenstoffquelle gezüchtet wird.
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Aus der DT-OS 2 059 277 ist ein mikrobiologisches Verfahren zur Herstellung
von Protein bekannt, welches in geeigneter Nährlösung mit Methanol als einziger
Kohlenstoffquelle unter aeroben Bedingungen die folgenden Bakterien-Stämme verwendet:
Pseudomonas methanica, Pseudomonas sp. ATCC 21 438, Pseudomonas sp. ATCC 21 439,
Pseudomonas sp. PRL-W 4, Corynebacterium sp. ATCC 21 232, Corynebacterium sp. ATCC
21 235 und Corynebacterium sp. ATCC 21 236.
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Aus der DT-OS 2 407 740 ist ein Verfahren zur Züchtung von Mikroorganismen
bekannt, bei welchem eine Mischkultur,bestehend aus einem fakultativ Methanol-verwertendenBakterium,
und
mehreren nicht Methanol-verwertenden Bakterien, angewandt wird. Das Methanol-verwertende
Bakterium ist nicht beweglich und kann -neben Methanol auch andere Kohlenstoffsubstrate
wie z. B. Glucose oder Glycerin als Kohlenstoffquelle verwerten.
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Für die Züchtung von Protein aus ethanol wird nach diesem Stand der
Technik kein obligat Methanol-verwertendes Bakterium, sondern es werden fakultativ
methylotrophe Mikroorganismen verwendet.
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Dieser Stand der Technik wird durch das Verfahren der Erfindung überwunden,
welches ein obligat methylotrophes Bakterium zur Züchtung von Einzeller-Protein
verwertet.
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Es wurde nun ein Verfahren zur Gewinnung von Einzellerprotein auf
Basis von Methanol gefunden, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß in einem begasten
Reaktor mit oder ohne einer mechanischen Rührung eine wachsende Submerskultur mit
dem obligat Methanolverwertenden Bakterium Methylomonas sp. DSM 580 unter aeroben
Bedingungen erzeugt wird, in der sich Methanol als einæigste Kohlenstoff- und Energiequelle,
anorganische Nährstoffe und gegebenenfalls Wuchsstoffe befinden und außerdem in
dieses System Luft oder sauerstoffangereicherte Luft bei einer Reaktionstempe 0
-ratur von 20 - 45°C zugeführt wird, danach aus dem entstandenen Dreiphasensystem
die Zellmasse abgetrennt und getrocknet wird, wobei eine Zellmasse erzeugt wird
mit einem Rohproteingehalt von mindestens 60 - 7o Gew.-%, einem Nucleinsäuregehalt
von 2 - 17 Gew.-%, einem Aschegehalt von 3 - 6 Gew.-%, einem Fettgehalt von 3 -
3 Gew.-70 und die von der Zellmasse befreite flüssige Phase gegebenenfalls ganz
oder teilweise in dem Prozeß recyclisiert wird.
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Das Verfahren der Erfindung zur Gewinnung von Einzellerprotein erzeugt
das obligat Methanol-verwertende Bakterium Methylomonas sp. DSM 580 mit folgenden
charakteristischen Eigenschaften: 1. Zellmorphologie Stäbchen in den Grenzen o.3
- o.6 x 1. - i.o bewe-glich mit einer polaren Geißel 2. Kol6nienmorphologie: Transparent,
weiß, rund und glatt, etwa 1 - 2 mm Durchmesser nach 2 - 3 Tagen
3.
Stammeigenschaft: Gram-negativ, Zelltrockenmasse schwach rosa 4. Physiologie.
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Streng aerob, Katalase positiv, MethanolDehydrogenase positiv, Hexose-PhosphatSynthetase
positiv, Hydroxy-Pyruvat-Reductase negativ 5. Wachstumseigenschaften: Min. Opt.
Marx.
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Temperatur (°C) 20 33-36 45 pH 4.5 6.5-7.5 9.5 Methanol-Konz. % (V/V)
o.5-1.5 5,o Das Bakterium Methylomonas sp. wurde bei der Deutschen Sammlung von
Mikroorganismen, Göttingen, mit der Nummer DSM 580 hinterlegt.
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Methylomonas sp. DSM 580 kann nur auf Methanol als Kohlenstoff- und
Energiequelle wachsen, nicht dagegen auf Methan, Methylamin, äthanol oder Glucose,
wie aus Tabelle ersichtlich ist.
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Wachstum von Methylomonas sp. DSM 580 auf verschiedenen Kohlenstoffquellen
in wässrigem anorganischen Nährmedium unter aeroben Bedingungen Substrate Wachstum
1) Methan Methanol + Methylamin Formaldehyd Formiat Äthanol Propanol- (1) Propanol-
(2) Acetat Lactat Pyruvat Succinat Citrat Glucose Fructose Serin + + Wachstum -
kein Wachstum
Ferner wurde gefunden, daß SIethylomonas sp. DSM 58o
bei chargenweiser Prozeßführung bei einer Anfangskonzentration von o.5 -5.o Vol.-«O
Methanol, insbesondere bei 2 - 3 Vol,-« gewonnen wird und daß Methylomonas sp. DSM
58o bei chargenweiser Prozeßführung bei gesteuerter Aufrechterhaltung einer konstanten
Methanol konzentration von o.ol - 2.o Vol.-%, bis zu einem Gesamtumsatz von 25 Vol.-%
ethanol gezüchtet wird.
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Weiter wurde gefunden, daß Methylomonas sp. DSM 58o bei kontinuierlicher
Prozeßführung mit einer Durchflußrate von o.lo.5 Vol./Vol./Std. unter chemostatischen
oder turbidostatischen Bedingungen gewonnen wird.
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Außerdem wurde gefunden, daß während des Wachstums durch Zusatz von
Alkalien bzw. Säuren ein praktisch konstanter pH-Wert von 4.5 - -9.o, vorzugsweise
von 6.5 - 7.5, eingestellt wird.
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Ferner wurde gefunden, daß die Züchtung von Methylomonas sp.
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DSM 58o bei einer Temperatur zwischen 20 und 450C, vorzugsweise bei
33 bis 360C, durchgeführt wird.
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Weiter wurde gefunden, daß während der Züchtung in den Reaktor LUft
oder sauerstoffangereicherte Luft mit einer Belüftungsrate von o.5 - 1.5 Vol./Vol./Min.
zugeführt wird und das eingeleitete Gasgemisch einen Sauerstoffgehalt von 2o - Go
Vol.-% aufweist.
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Außerdem wurde gefunden, daß während der Züchtung in den Reaktor Luft
oder sauerstoffangereicherte Luft mit einer Belüftungsrate von o.l - o.2 Vol./Vol./hfin.
zugeführt wird und das eingeleitete Gasgemisch einen Sauerstoffgehalt von 20 - 60
Vol.-% aufweist.
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Ferner wurde gefunden, daß die wässrige Nährlösung als Stickstoffquelle
Ammonium und/oder Nitrat-Salze und/oder Harnstoff, sowie die für das Wachsum notwendigen
Kationen Natrium, Kalium, Magnesium, Calcium, Eisen, Zink, Mangan und die Anionen
Phosphat, Sulfat, Nitrat, Chlorid und Wuchsstoffe enthält.
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Das Verfahren der Erfindung wird durch folgende Beispiele näher erläutert:
Beispiel 1 Ein 30 1 Bioreaktor, gefüllt mit 50 1 Nährlösung (Zusammensetzung: 200
.g (N114)2S04, 150 g KH2P 125 g Na2HP04, 25 g MgS04 7 H20, 1.25 g Ca(NO3)2. 4 H20,
0.25 g FeS04 7 H20, 0.25 g 0 ZnS04 H20, 0.25 g KCl in 50 1 Wasser) wird 10 Min.
bei 121 C sterilisiert, auf 35 0C abgekühlt, aseptisch mit 1000 ml Methanol versetzt,
mit 500 ml Inoculum von Methylomonas sp. DSM 580 beimpft, 28 Stdn. bei 35 0C mit
einem Turborührer (300 Upm) suspendiert und bei einer Belüftungsrate von 0.7 Vol./Vol./Min.
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gezüchtet. Während der Züchtung wird in der Submerskultur durch automatische
Zugabe von 6 Vol.% Ammoniaklösung ein konstanter pH-Wert von 7.0 aufrechterhalten.
Nach 22 Stdn. wird der Reaktor auf 15°C gekühlt, der pH-Wert durch Zusatz von Schwefelsäure
auf pH 3.0 eingestellt und die ausgefällte Zellmasse abfiltriert, mit Wasser gewaschen
und getrocknet (324 g Zelltrockenmasse).
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Beispiel 2 Ein 340 1 Bioreaktor, ausgerüstet mit einem "Intensor",
Hersteller: Biologische Verfahrenstechnik AG, Basel, wird mit 200 1 Nährsalzlösung
(Zusammensetzung: 500 g (NH4)2SOß, 500 g NH4NO3, 600 g KH2P04, 500 g Na2HP04, 140
g MgSO4.7 H20, 15 g Ca (N03)2.4 H20, 6 g FeSO4 .7 H20, 2 g KCl in 200 1 Leitungswasser)
beschickt, der pH-Wert auf 6.8 eingestellt, 15 Min. bei 121 0C sterilisiert, auf
330C abgekühlt, aseptisch mit 2000 ml Methanol versetzt, mit 4000 ml einer 18 Stdn.-Vorkultur
von Methylomonas sp. DSM 580 beimpft und bei 33°C, einer Belüftungsrate von 0.5
Vol./Vol./Min. und einer Umdrehungszahl von 1800 Upm gezüchtet. Während des Wachstums
wird in der Submerskultur automatisch die Methanolkonzentration auf 0.5 Vol.% konstant
gehalten, indem man die der Flüssigkeitskonzentration entsprechende Dampfkonzentration
an Methanol im Abgas mittels eines Flammenionisationsdetektors kontinuierlich erfasst
und über einen Grenzwertgeber die notwendige Methanolzugabe steuert, außerdem wird
automatisch mit einer pH-Regulierstation durch Zusatz einer 12 Vol.-%igen Ammoniaklösung
ein pH-Wert von 6.8 aufrechterhalten. Nachdem nach 25 Stdn. bereits eine Zellkonzentration
von 14 g Zelltrockenmasse pro Liter erreicht ist, wird unter Konstanthaltung der
Belüftungsrate mit sauerstoffangereicherter Luft mit einem Sauerstoffgehalt von
40 Vol.% begast. Der Prozeß wird nach 60 Stdn. auf 15 0C abgekühlt, in einer Durchlaufzentrifuge
bei 10 000 g die entstandene Zellmasse abgetrennt und getrocknet. Unter diesen Prozeßbedingungen
beträgt die Zellausbeute 0.44 g Zelltrockenmasse/g Methanol, mit einem Gehalt an
68 % Gesamtaminosäuren und 9 % Nucleinsäuregehalt bezogen auf die Zelltrockenmasse.
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Beispiel 3 Ein 80 1 Bioreaktor, ausgerüstet mit einem "Intensor" wie
in Beispiel 2, wird mit 50 1 Nährsalzlösung mit einer Zusammensetzung wie in Beispiel
1 beschrieben, mit 1000 ml einer Kultur von Methylomonas sp. DSM 580 beimpft, die
zuvor 15 Stdn. bei 35 0C kultiviert wurde, bei 350C, einer Belüftungsrate von 0.5
Vo1./VolO/Min. und einer Umdrehungszahl von
1200 Upm bei einem
konstanten pH-Wert von 7.0 unter statischen Bedingungen gezüchtet. Die kontinuierliche.
Kultur wird nach 18 Stdn. gestartet bei einer Durchflußrate von 0.05, nach weiteren
48 Stdn. wird die Durchflußrate auf 0.1 erhöht und dann innerhalb von 120 Stdn.
stufenweise auf 0.35 gesteigert. Unter diesen Bedingungen wird der Gleichgewichtszustand
aufrechterhalten, bei Zellausbeutekoeffizienten von 0.46 ( g Zelltrockenmasse/g
Methanol) und einer Produktivität von 10.8 g/l/h. Die Zellzusammensetzung beträgt:
72 % Reinprotein und 4.5 % Nucleinsäuren.
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Das Verfahren der Erfindung bietet den Vorteil, daß erstmalig ein
obligat methylotrophes Bakterium verwendet wird, das eine wesentliche höhere Produktivität
aufweist gegenüber bekannten fakultativ methylotrophen Mikroorganismen. Bei dem
Verfahren der Erfindung können sich keine Mutanten entwickeln, die die Fähigkeit
auf Methanol zu wachsen verloren haben. Das Bakterium nach dem Verfahren der Erfindung
ist somit sehr stabil, sein Stoffwechsel ist auf ein Minimum reduziert, weitere
genetischen Veränderungen würden zum Absterben der Zellen führen. Ein weiterer Vorteil
des Verfahrens der Erfindung liegt darin, daß die Methanol-dissimilatorischen und
-assimilaL-orischen Enzyme konsitutiv sind, Wenn das Verfahren der Erfindung un-ter
Methanol limitierenden Bedingungen kontinuierlich durchgeführt wird, ist der Nucleinsäuregehalt
der Zellmasse sehr niedrig und der Verlust an Methanol durch Verdampfung praktisch
gleich null.