DE2224707A1

DE2224707A1 - Verbessertes Fermentationsverfahren

Info

Publication number: DE2224707A1
Application number: DE19722224707
Authority: DE
Inventors: Edward Rahway Birnbaum Jerome Morganville NJ Inamine (VStA) P A61k 11 00
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 1971-05-20
Filing date: 1972-05-19
Publication date: 1972-11-30
Also published as: NO135185B; NL7206339A; NO135185C; FR2143672A1; HU165957B; DE2224707B2; FI49839B; JPS5248196B1; SE385019B; FR2143672B1; DK130846B; CH582237A5; FI49839C; CA986863A; GB1382316A; DE2224707C3; ES402903A1; DK130846C; DD96974A5

Description

Die Erfindung betrifft die Herstellung eines neuen, wertvollen Antibioticums, das die chemische Bezeichnung 7-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(carbamoyloxymethyl)-7-raethoxy-3-cephem-4-carbonsäure trägt, und sie bezieht sich insbesondere auf eine verbesserte Methode zur Erzeugung dieses Antibioticums durch fermentation von Nährmedien mit geeigneten
Stämmen von Mikroorganismen, wie z.B. Streptomyces. ^:

Das Antibioticum entsteht bei der aeroben Fermentation geeigneter wässriger Nährmedien unter gesteuerten Bedingungen. Hierfür kann man wässrige Nährmedien verwenden, wie sie auch für die Erzeugung anderer Antibiotica verwendet werden. Solche
Medien enthalten durch den Mikroorganismus assimilierbare
Quellen für Kohlenstoff und Stickstoff und ausserdem anorganische Salze. Ferner enthalten die Fermentationsmedien Spurenmetalle, die für das Wachstum des Mikroorganismus notwendig sind und gewöhnlich als Verunreinigungen der anderen Be-

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standteile des Mediums vorliegen. Als Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff verwendet man im allgemeinen Kohlehydrate, wie Zucker, z.B. Saccharose, Maltose, Fructose, Lactose und dergleichen, und Stärken, wie Getreide, z.B. Hafer und Roggen, Maisstärke, Maismehl und dergleichen, für sich allein oder in Kombination miteinander. Die genaue Menge an Kohlehydraten in dem !Fermentationsmedium richtet sich teilweise nach den anderen Bestandteilen. Es wurde jedoch gefunden, dass Kohlehydratkonzentrationen von etwa 1 bis 6 Gewichtsprozent des Fermentationsmediums genügen. Man kann mit einer einzigen Quelle für Kohlenstoff arbeiten, aber auch mehrere solche Quellen für Kohlenstoff kombinieren.

Zufriedenstellende Quellen für Stickstoff sind die zahlreichen Eiweissstoffe, wie die verschiedenen Formen von Caseinhydrolysaten, Sojabohnenmehl, Maisquellwasser, lösliche Schlempebestandteile, Hefeprodukte, Tomatenbrei und dergleichen. Die verschiedenen Stickstoffquellen können für sich allein oder in Kombination miteinander verwendet werden und werden in Mengen von 0,2 bis 6 Gewichtsprozent, bezogen auf das wässrige Fermentationsmedium, zugesetzt.

Die Fermentation wird bei Temperaturen von 20 bis 37° C durchgeführt; wenn man die besten Ergebnisse erzielen will, führt man die Fermentation vorzugsweise bei etwa 24 bis 32° G durch. Der für das Züchten von Kulturen von Streptomyces und für die Erzeugung des Antibioticums geeignete pH-Wert der Nährmedien soll im Bereich von etwa 6,0 bis 8,0 liegen.

7-(D-5-Amino-5~carboxyvaleramido)-3-(carbamoyloxymethyl)-7-methoxy~3-cephem-4-carbonsäure, die die nachstehende Strukturformel 1 aufweist, entsteht bei der aeroben Fermentation eines Stammes von Streptomyces lactamdurans und Streptomyces clavuligerua, der imstande ist, diese Verbindung zu erzeugen, z.B. der Stämme, die sich im unbeschränkten Dauerdepot in der Kultursammlung der "Northern Utilization Research and Development

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Branch of the U.S. Department of Agriculture" in Peoria, "Illinois, USA. unter den Kennzeichnungen NRRL 3802 bzw. NRRL 3585 befinden. Man kann auch andere Stämme dieser Gattung verwenden, wie z.B. mit Hilfe von Mutationsmitteln erhaltene Mutanten oder aus der Natur isolierte Stämme.

0 HH₂ 0 ?^0H^

HOC-CH-CH₀-CH₀-Ch₀-C-NH-

COOH

Diese Verbindung ist eine amphotere Verbindung mit einem scheinbaren isoelektrischen Punkt bei einem pH-Wert von etwa ' 3,5 und ist in Lösung bei pH-Werten von 1,5 bis 9jO beständig.

Das Antibioticum der obigen Strukturformel I und seine Salze sind nicht nur gegen Penicillinase, sondern auch gegen die Cephalosporinasen beständig. Diese Verbindung hemmt das Wachstum von gram-positiven und gram-negativen Mikroorganismen und weist eine erhöhte Aktivität gegen gram-negative Mikroorganismen auf. Zum Unterschied von Cephalosporin C, das eine verhältnismässig geringe antibakterielle Aktivität besitzt, zeigen die Produkte der Erfindung eine beträchtliche Aktivität in vivo gegen gram-negative Mikroorganismen mit einer Stärke, die im allgemeinen höher ist als diejenige von Cephalothin. Zu dieser Aktivität gehört die Wirksamkeit in vivo gegen Proteus morganii und ausserdem Wirksamkeit gegen die folgenden gram-negativen Bakterien: Escherichia coli, Proteus vulgaris, Proteus mirabilis, Salmonella schottmuelleri, Klebsieila pneumoniae AD, Klebsiella pneumoniae B und' Paracolobactrum arizonae.

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Die "biologische Analyse auf dieses Antibioticum wird nach der Scheiben-Plattenmethode unter Verwendung von 9,5 cm~Filterpapierscheiben durchgeführt. Die Testplatten werden mit 10 ml Difcp-Nähragar je Platte +2,Og Difco-Hefeextrakt je Liter vorbereitet. Eine Übernacht hergestellte Kultur des Testorganismus Tibrio percolans ATCC 8461 wird mit steriler Kochsalzlösung zu einer Suspension verdünnt, die bei einer Wellenlänge von 660 ΐημ 'eine Lichtdurchlässigkeit von 40 fo aufweist. Diese Suspension wird in einer Konzentration von 20 ml/l dem Nährmedium zugesetzt, bevor dieses auf die Platten gegossen wird.

Die Testplatten werden bis zur Verwendung, aber nicht langer als fünf Tage, bei 4° C aufbewahrt. Nach dem Auflegen der mit dem Antibioticum gesättigten Prüfscheiben werden die Platten 8 bis 24 Stunden bei 28° C inkubiert. Dann werden die Hemmungszonen in mm Durchmesser festgestellt. An diesen Werten werden die relativen Stärken oder, wenn man sie mit einer gereinigten Bezugsnorm vergleicht, die Stärke in γ/ml bestimmt.

In Anbetracht der Schwierigkeit der Abtrennung der reinen 7-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(carbamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure von den grossen Mengen an Verunreinigungen in der "Fermentationsflüssigkeit ist es von grosser Bedeutung, dass ein Weg gefunden wird, um die Konzentration dieses Antibioticums im Verhältnis zu der Gesamtmenge der Feststoffe in der Fermentationsflüssigkeit zu erhöhen.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, eine Methode zur Erhöhung der Ausbeute an dem Antibioticum bei einem Fermentationsverfahren zur Verfügung zu stellen, bei der unaufwendige, leicht erhältliche chemische Zusätze verwendet werden.

Es wurde gefunden, dass durch den Zusatz von Natriumthiosulfat (Na₂S₂O^), Natriumdithionit (Na₂S₂O,), oc-Aminoadipin&äure

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oder durch, gemeinsamen Zusatz von Nätriumthiosulfat und a-Aminoadipinsäure zu komplexen organischen oder chemisch definierten Fermentationsmedien die Bildung von 7-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramMo)-3-(carbamoyloxymethyl)~7-methoxy~3-ceptiem-4-carbonsäure gesteigert wird.

Als "komplexe organische" Medien werden solche bezeichnet, in denen einige Bestandteile chemisch nicht definiert sindo Bin Beispiel für solche Medien besteht aus "Crescent"-Hafer, Sojabohnenmehl, Natriumeitrat, einem Schaumverhütungsmittel und löslichen Schlempebestandteilen. Als "chemisch definierte" oder "synthetische" Medien werden solche bezeichnet, in denen sämtliche Bestandteile chemisch definiert sind. Bin Beispiel für solche Medien besteht aus Maisstärke, saurem Kaliumphosphat, Natriumeitrat, Asparagin, Methionin, Mononatriumglutamat, Calciumchlorid, Magnesiumsulfat und Eisen (III)-sulfat.

Die Menge an Natriumthiosulfat und/oder a-Aminoadipinsäure oder an Natriuindithionit, die zur Erhöhung der Ausbeute an Antibioticum erforderlich ist, richtet sich nach der jeweiligen Kultur und dem jeweiligen Medium. Wenn man mit Streptomyces lactamdurans arbeitet, beobachtet man eine Produktionserhöhung an dem Antibioticum in synthetischen Medien, wenn diese 0,005 bis 1,6$ (alle hier für die Zusätze gemäss der Erfindung angegebenen Prozentwerte beziehen sich auf Gewichtsteile je 100 Raumteile Fermentationsmedium) irgendeines dieser Zusätze enthalten. Um eine gute Erzeugung des Antibioticums zu gewährleisten, verwendet man jedoch vorzugsweise die Zusätze in Mengen von etwa 0,1 bis 0,8 $. Die besten Ausbeuten erhält man mit 0,3 bis 0,5 $, und besonders gute Ausbeuten werden bei 0,4 f° an diesen Zusätzen erzielt. Durch Zusatz von Natriumdithionit oder Natriumthiοsulfat zu einem synthetischen oder chemisch definierten Medium bei Verwendung von Streptomyces lactamdurans erhöht sich die Produktion von 7-(Dr5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(carbamoyloxy-

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methyl)-7-methoxy-3-cephem-4-car"bonsäure'um 91 bis 105 $> wenn das Fermentationsmedium 0,4 $> Natriumthiοsulfat enthält. Konzentrationen von Natriumthiosulfat oder Natriumdithionit von mehr als 1,6 tfo vermindern die Erzeugung des AntiMoticums in den Fermentationsmedien.

In komplexen organischen Nährmedien erhält man bei Verwendung von Streptomyces lactamdurans die besten Ausbeuten an Antibioticum bei Konzentrationen an Natriumthiosulfat oder Natriumdithionit von 0,05 bis 0,1 $.

Es wurde ferner gefunden, dass die Kombination von Natriumthiosulfat mit DL-oc-Aminoadipinsäure bei Verwendung von Streptomyces lactamdurans' die Erzeugung des AntiMoticums sowohl in synthetischen als auch in komplexen Nährmedien erhöht. Hierbei ist die Konzentration an Natriumthiosulfat die gleiche, wie oben angegeben, und die Konzentration an DL-oc-Aminoadipinsäure beträgt 0,005 bis 0,15 $>. Vorzugsweise setzt man die DIi-oc-Aminoadipinsäure in einer Konzentration von etwa 0,01 $ zu, und bei Kombination der beiden Zusätze betragen die günstigsten Konzentrationen an Natriumthiosulfat und an DL-a-Aminoadipinsäure etwa 0,4 ί» bzw. 0,01 fo. Am bemerkenswertesten ist die Ausbeuteerhöhung in synthetischen Medien; jedoch werden die Ausbeuten in komplexen organischen Nährmedien ebenfalls über die entsprechenden, ohne diese Zusätze erhaltenen Ausbeuten hinaus erhöht.

Wenn man mit Streptomyces lactamdurans arbeitet, spielt überraschenderweise der Zeitpunkt des Zusatzes der die Ausbeute erhöhenden Verbindungen zu dem Fermentationsansatz eine entscheidende Rolle. Die besten Ausbeuten erhält man, wenn man das Natriumthiosulfat und/oder die DL-a-Aminoadipinsäure oder das Natriumdithionit 24 bis 48 Stunden nach der Beimpfung zusetzt. Wenn der Zusatz zu einem früheren Zeitpunkt in dem' Permentationsverfahren stattfindet, erzielt man entweder keine Ausbeuteerhöhung oder sogar eine hemmende Wirkung.

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Im Gegensatz dazu ist beim Arbeiten mit einer Kultur von ■Streptomyces clavuligerus bei Verwendung von Natriumthiοsulfat weder der Zeitpunkt des Zusatzes· noch die Konzentration dieser Verbindung ausschlaggebend. Im allgemeinen erhöht Natriumthiosulfat die Erzeugung des Antibioticums um etwa 40 #, unabhängig davon, ob die Verbindung gleich zu Beginn der Fermentation oder nach der Beimpfung zugesetzt wird. Besonders gute Ausbeuten an dem Antibioticum werden jedoch bei Konzentrationen an diesem Zusatz von etwa 0,20 bis 0,60 f* beobachtet.

Wenn Natriumdithionit mit einer Kultur von Streptomyces clavuligerus verwendet wird, kommt es entscheidend auf den Zeitpunkt des Zusatzes an. Das Dithionit beschleunigt die Synthese des Antibioticums, wenn es mehrere Stunden, gewöhnlich 24 bis 31 Stunden, nach der Beimpfung zugesetzt wird, es hemmt dagegen das Wachstum des Mikroorganismus, wenn es gleich zu Beginn der Fermentation zugesetzt wird. Im allgemeinen erzielt man gute Ergebnisse, wenn man das Dithionit in Konzentrationen von 0,005 Ms 0,075 f° zusetzt; besonders gute Ausbeuten an dem Antibioticum werden erzielt, wenn diese Verbindung zu dem Produktionsmedium innerhalb 24 Ms 31 Stunden nach der Beimpfung in Konzentrationen von etwa 0,025 "bis 0,050 fo zugesetzt vird.

Wenn man mit Streptomyces clavuligerus arbeitet, wird durch gemeinsamen Zusatz von etwa 0,005 f° bis 0,6 fo Thiosulfat und etwa 0,01 bis 0,4 $> L-oc-Aminoadipinsäure im allgemeinen die Erzeugung des Antibioticums noch stärker beschleunigt als bei Zusatz von Thiosulfat allein. Der Zusatz von 0,20 f> Natrium-, thiosulfat und 0,05 f> L-oc-Aminoadipinsäure hat sich als besonders geeignet zur Erhöhung der Produktion an Antibioticum erwiesen, wenn der Zusatz zu Beginn des Fermentationsverfahrens erfolgt.

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Wenn L-oc-Aminoadipinsäure "bei der Fermentation einer Kultur von Streptomyces clavuligerus allein verwendet wird, wird die Erzeugung des Antibioticums durch Konzentrationen von etwa 0,01 bis 0,4 fo erhöht. Besonders gute Ausbeuten erhält man bei Konzentrationen von etwa 0,025 bis 0,05 $.

Die Fermentationsmedien, zu denen das Thiosulfat, das Dithionit und die α-Aminoadipinsäureverbindung. zugesetzt werden, kann ein beliebiges geeignetes wässriges Nährmedium sein; mit gewissen Nährmedien erhält man jedoch bei Verwendung dieser Zusätze besonders gute Ausbeuten an Antibioticum. So wurde überraschenderweise gefunden, dass man mit Kulturen von Streptomyces clavuligerus die höchsten Ausbeuten mit dem folgenden Nährmedium erzielt:

Medium I

Stärke 4,8

lösliche Schiempebestandteile 0,5

Sojabohnengrütze 0,21

Glycerin 0,8 hydrolysiertes Casein

(*N-Z-Amih, Typ A) 0,5

Eisen(ll)-sulfat-heptahydrat 0,01

mit Leitungswasser aufgefüllt auf .... 1,0

* N-Z-Amin, Typ A ist ein angedautes Enzym aus Casein, hergestellt von der Sheffield Chemical Co., Norwich, New York, USA.

während man mit Streptomyces Iactamduran3 besonders gute Ausbeuten an dem Antibioticum mit dem nachstehend angegebenen Nährmedium II erzielt:

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Meditun II

lösliche Schlempebestandteile 3,0

primäre Trockenhefe 1,0 ■ , Schaumverhütungsmittel

(»Mobil par-S") 0,25 Glycin ' · 0,05

!■-Phenylalanin 0,30

Maisstärke 2,0

mit entmineralisiertem Wasser

aufgefüllt auf ' 1,0 1.

Die obige Beschreibung bezieht sich in erster linie auf die Fermentation mit einem besonderen Stamm von Kulturen von Streptomyces lactamdurans und Streptomyces clavuligerus. Man kann aber auch andere Stämme dieser Mikroorganismen, wie Mutanten, zur Erzeugung des Antibiotikums verwenden, und auch dann kann man von Natriumthiosulfat, Natriumdithionit oder der Kombination aus Natriumthiosulfat und DL- oder I-a-Aminoadipinsäure zur Erhöhung der "Ausbeute an dem Antibioticum Gebrauch machen. Im Rahmen der Erfindung liegen Abänderungen der günstigsten Zusatzkonzentrationen oder des Zeitpunktes des Zusatzes zu dem Fermentationsmedium usw., unabhängig davon, welcher Stamm von Streptomyces lactamdurans oder Streptomyces clavuligerus zur Erzeugung des Antibioticums 7-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(carbamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure verwendet wird.

Obwohl 'das neue Antibioticum gemäss der Erfindung in Oberflächenkultur oder in Submerskultur erzeugt werden kann, führt man die Fermentation zur Zeit vorzugsweise in Submerskultur durch. Fermentationen in kleinem Massstabe werden zweckmässig durchgeführt, indem man geeignete Mengen des Fährmediums in Kolben einbringt, die Kolben und ihren Inhalt durch Erhitzen auf 120 C sterilisiert, die Kolben entweder mit Sporen oder mit einer vegetativen Zellenkultur eines 7-(D-5-Amino-5-carboxyvalerainido)-3-(carbamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-

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4-car"bonsäure erzeugenden Stammes von Streptomyces "beimpft, die Hälse der Kolben locker mit Watte verschliesst und die Fermentation 3 Ms 5 Tage bei einer konstanten Raumtemperatur von etwa 28° C in der Sehüttelmaschine durchführt. Für Arbeiten in grösserem Massstabe führt man die Fermentation vorzugsweise in grossen Behältern mit Rührwerk und Belüftungseinrichtung für das Fermentationsmedium durch. Bei dieser Methode wird das Nährmedium im Behälter angemacht und durch Erhitzen auf 120° G sterilisiert. Nach dem Kühlen wird das sterilisierte Medium mit einer vegetativen Zellenkultur des Streptomyces beimpft und die Fermentation 2 bis 4 Tage unter Rühren und/oder Belüftung des Nährmediums und Innehaltung einer Temperatur von etwa 28° C durchgeführt. Diese Methode zur Erzeugung von 7-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(carbamoyloxymethyl )-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure eignet sich besonders für die Herstellung des neuen Antibioticums in grossen Mengen.

Die Fermentation unter Verwendung des 7-(D-5-Amino-5-carboxyvalerainido)-3-(carbamoyloxyinethyl)-7-niethoxy-3-cephem-4-carbonsäure erzeugenden Mikroorganismus kann bei Temperaturen von etwa 20 bis 37° 0 durchgeführt werden. Zur Erzielung der besten Ergebnisse ist es jedoch am zweekmässigsten, die Fermentation bei Temperaturen von 26 bis 30 C durchzuführen. Der pH-Wert des zum Züchten des Streptomyces und zur Erzeugung des Antibioticums geeigneten Nährmediums kann im Bereich von etwa 5 bis 9 variieren. Vorzugsweise arbeitet man jedoch bei pH-Werten von etwa 6,0 bis 7,5.

Zur Durchführung der Erfindung stellt man eine Zellensuspension her, indem man steriles Medium zu einer Agar-Sehrägröhrchenkultur eines 7-(D-5-Aroino~5-carboxyvaleramido)-3-(carbamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure erzeugenden Mikroorganismus zusetzt. Das Erzeugnis der Schrägröhrchenkultur wird dann zur Beimpfung eines Saatkolbens verwendet, und der Saatkolben wird 1 bis 3 Tage bei 28° C geschüttelt, um ein gutes Wachstum zu erzielen. Dann wird der Saat-

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kolben zur Beimpfung' der Produktionskolben verwendet. Man kann den Saatkolben auch mit einer gefriergetrockneten Kultur oder einem eingefrorenen Impfgut beimpfen.

Die Beimpfung wird im allgemeinen mit 1 ml je 40 ml Produktionsmedium durchgeführt. Dann werden die Zusätze in den gewünschten Konzentrationen nach der erforderlichen "Wartezeit in die Produktionskolben eingegeben,und die Fermentation wird 2 bis 4 Tage unter Rühren und/oder Belüftung des Nährmediums und Innehaltung der Temperatur von etwa 28° C durchgeführt. Alle Produktionskolben, d.h. diejenigen Kolben, die die Zusätze enthalten, und diejenigen Kolben, die für die Leerversuche verwendet werden, werden dann, im allgemeinen nach 96 Stunden, analysiert, um die Menge an· Antibioticum zu bestimmen, die sich in jedem Kolben gebildet hat.

Das Antibioticum 7-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(carbamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure wird zweckmässig nach der Scheiben-Plattenmethode unter Verwendung von Vibrio percolans ATCC 8461, als TestOrganismus analysiert. Man verwendet Scheiben von 9»5 cm Durchmesser. Die Aktivität des Antibioticums wird in γ/ml freier Säure ausgedrückt. Aus Lösungen von bekannten Konzentrationen an dem Antibioticum wird eine Standardkurve erstellt.

Dann werden die Produktionskolben analysiert, indem man die Probe mit 0,02-molarer Phosphatpufferlösung (pH 7) auf eine geeignete Konzentration verdünnt. Der Testorganismus ist Vibrio percolans ATCC 8461, und als Analysenmedium verwendet man Difco-Nähragar + O,2 $> Difco-Hefeextrakt. Die Scheiben werden in eine genormte Lösung des Antibioticums getaucht, die 5 γ des Antibioticums je ml enthält, und abwechselnd mit der Probe auf die Platte gelegt. Die Platten werden 18 Stunden bei 37° C inkubiert, worauf man die Zonendurchmesser in mm bestimmt. Es werden fünf Wormplatten verwendet, die vier Konzentrationen des genormten Antibioticums von 2,5 γ/ml bis

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20 γ/ml enthalten. Die Analyse wird mit Hilfe eines Nomogramms berechnet, und die Ergebnisse werden in γ/ml freier Säure angegeben.

Das Antibioticum lässt sich aus dem Fermentationsmedium nach verschiedenen Verfahren gewinnen. Man kann die filtrierte Fermentationsflüssigkeit durch eine oder mehrere Ionenaustauschersäulen hindurchleiten. Da das Antibioticum eine amphotere Verbindung ist, kann man sowohl mit Kationen- als auch mit Anionenaustauschharzen arbeiten, um die beste Gewinnung zu erzielen. Das adsorbierte Antibioticum wird dann, vorzugsweise mit einem flüchtigen Lösungsmittel, wie Pyridin, das sich leicht entfernen lässt, eluiert.

Beispiel 1

Eine Agar-Schrägröhrchenkultur von Streptomyces lactamdurans NRRL 5802 wird mit 10 ml steriler abgerahmter Milch versetzt. Die Suspension der abgerahmten Milch wird in einzelnen sterilen Reagensgläsern gefriergetrocknet; jedes Glas enthält 0,1 bis 0,2 ml der Suspension. Die gefriergetrocknete Kultur wird verwendet, um einen mit Umlenkorganen ausgestatteten 250 ml-Erlenmeyerkolben zu beimpfen, der 40 ml eines Saatmediums enthält, welches aus 1-prozentiger primärer Hefe in destilliertem Wasser besteht.

Der Saatkolben wird zwei Tage in einer rotierenden Schüttelmaschine bei 220 U/min und einem Hub von 4 cm bei 28° C bebrütet. Für die zweite'Aussaat setzt man 1,0 ml der obigen Kultur zu einem synthetischen Medium zu, welches die gleiche Zusammensetzung hat wie das synthetische Produktionsmedium, und inkubiert, wie oben, zwei Tage.

Zu einem jeden von acht 250 ml-Erlenmeyerkolben, von denen jeder 40 ml steriles Medium der folgenden Zusammensetzung:

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14 957 ft

Synthetisches Produktionsmedium f*

Glucose	1,0
Mononatriumglutamat	0,425
Dikaliumphosphat	.0,2
Ammoniumchlorid	0,1
NaCl	0,05
MgSO₄ . 7H₂O	0,05
CaCO,	■0,025
i-Inosit	0,02
IeSO,, · TH₀O 4 c	0,0025
ZnSO₄ . 7H₂O	0,001
MnSO₄ . H₂O	0,0005
p-Aminobenzoesäure	0,000001

in Wasser bei einem pH~Wert von 7,0 enthält, setzt man 1,0 ml der, wie oben beschrieben, hergestellten zweiten Aussaat zu. Nach 3O-stundigem Inkubieren wird eine wässrige Lö- . sung hergestellt, die so viel Na₂SgO₄ (Natriumdithionit) oder NSpS₂O₃ (Natriumthiosulfat) enthält, dass die Konzentration an dem betreffenden Salz 0,1 ?S beträgt, und diese Lösung wird auf sechs Kolben verteilt. Dann inkubiert man weitere 66 Stunden bei 28° C in einer mit 220 U/min umlaufenden Schüttelmaschine bei einem Hub von 5 cm. Der Inhalt eines jeden Kolbens wird 3 Minuten mit 8500 U/min zentrifugiert und die Flüssigkeit von den Peststoffen dekantiert. Die überstehende flüssigkeit wird mit Hilfe von Vibrio percolans als Testorganismus analysiert. Die Analysen der flüssigkeiten sind nachstehend angegeben:

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it· yj ι Versuch	Kolben	Zusatz	2224707 Erzeugung an freier Säure, γ/ml
1 1	(Leerversueh)	keiner	36 .
2		0,1 ft Na₂S₂O,	56
3		0,1 fo Na₉S₉O,	50
2 1	(Leerversueh)	keiner	40
CVl		0,1 $ Na₂S₂O₃	54
3		0,1 $> Na₂S₂O₄	56
B e i s ρ i e	1 2

Nach Beispiel 1 hergestellte Kolben, die Produktionsmedium und die Saat des Mikroorganismus enthalten, werden nach 30-stündiger Inkubation mit Ka₉S₀On. in den folgenden Konzentrationen versetzt. Nach weiterer 66-stündiger Inkubation wird die j?ermentationsflüssigkeit_c wie oben beschrieben, analysiert, wobei man die folgenden Ergebnisse erhält:

Kolben

Zugesetztes Na₉S₉O,, <£

Erzeugung an freier Säure, γ/ail

33 51 57 59 62 56 51 43

Die folgende Fermentation wird nach dem oben beschriebenen allgemeinen Verfahren durchgeführt, wobei man jedoch den Zeitpunkt des Zusatzes des Na₉S₀O:, bzw. die Menge des zugesetzten

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1 (Leerversueh)	keines	3
2	0,05
3	0,10
4	0,20
5	0,40
6	0,80
7	1,2
8	1,6
Beispiel

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NapSpO, variiert, um die günstigsten Bedingungen für eine erhöhte Erzeugung des Antibiotikums aufzuzeigen:

Erzeugung an freier Säure, γ/ml

	keine (Leerversuch)	0	Zugesetzte	Menge	•	0	C	0,2	,S₂O₅, ?	0	0,8
-	Na₂S₂O₅ nach	39	0,05 0	,10	45		0,4
Zusätze	O Stunden
1.	30 Stunden				0		0
	keine (Leerversuch)		34	0	70	0	73
2.	Na₂S₂O₅ nach	28	70	74		84
3.	O Stunden					-
4.	30 Stunden			0		0
			1;2	49	0	45
5.	49	54
6.

Zeitpunkt des Na₂S₂0,-Zusatzes, Stunden

kein Zusatz

24 30 48 54 72

7.	keine	(Leerversuch)	43
8.	0,4 f°	Na₂S₂O₅
9.	keine	(Leerversuch)	52
10.	0,4 $>	Na₂S₂O₅
B e	i s ρ	i e 1 4

33 74 71 48 44 10 60 80 79 47

Die folgende Fermentation wird ausgeführt, um den Vorteil der Verwendung einer Kombination von Na₂S₂O₅ und DL-oc-Aminoadipinsäure (AAA) als Zusatz zu dem oben beschriebenen JTermentationsmedium zu erläutern.

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Versuch	Kolben	Zusätze nach 30 Stunden	(Leerversuch)	^fo AAA	Erzeugung an freier Säure, γ/ml
1	1	keine	Na₂S₂O₅		43
	2	0,4 io	Na₂S₂O₅ + 0,01 °i		74
	5	0,4 io	(Leerversuch)	S AAA	120
2	1	keine	Na₂S₂O₅		33
	2	0,4 #	Na₂S₂O₇ + 0,01 °t		50
	3	0,4 $	(Leerversuch)	£ AAA	82
' 3	1	keine	Na₂S₂O₅ AAA		30
	2 5	0,4 io o,i io	Na₂S₂O₅ + 0,01 °t		57 32
	4	0,4 #	(Leerversuch)		65
4	1	keine	Na₂S₂O₅	£ AAA	35
	2	0,4 io	^fo AAA		58
	3	0,01 'S	Na₂S₂O₅ + 0,01 °i	35
	4	0,4 #	•	84 .
B e i s	P i e 1 5

Die folgenden Untersuchungen werden mit einem komplexen organischen Medium als Fermentationsmedium durchgeführt. Das
Saatmedium wird nach Beispiel 1 hergestellt. Ein 2,5-prozentiges Impfgut aus der ersten Aussaat wird einem zweiten Aussaatkolben zugesetzt, der 2-prozentiges Hefeautolysat
(Fleishman S-I50) von einem pH-Wert von 7,0 enthält.

Nach 48-stündiger Inkubation in der zweiten Saatstufe verwendet man 1 ml, um einen jeden, 40 ml komplexes organisches Medium enthaltenden Kolben zu beimpfen. Dieses !indium hat die
folgende Zusammensetzung%

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Komplexes organisches' Medium

Primäre Troekenhefe lösliche Schlempebestandteile Glycin !-Phenylalanin Maisstärke

Schaumverhütungsmittel ("Mobil par-S")

mit Wasser aufgefüllt auf

Der pH-Wert wird auf 7,5 eingestellt.

. 1.0 g -

30 g

0,5 g

3 g

20 g

2,5 ml 1000 ml.

Zu diesem Medium- wird der Zusatz in den nachstehend angegebenen Konzentrationen hinzugefügt. Die Gesamtfermentationsdauer beträgt 96 Stunden; die Analyse wird, wie oben beschrieben, durchgeführt. Die Ergebnisse sind die folgenden:

Erzeugung von 842A, γ/ml

Zeitpunkt des Zusatzes, Stunden

Kolben

Zusätze

kein
Zusatz

48

Leerversuch 0,005> 0,01 <fo 0,05

0,10

180	233	171	175
208	230	222	191
226	256	241	176
217		241i	184

Beispiel

Zusatz von Natriumthiosulfat; abgeändertes Fermentationsverfahren

Stufe A: Schrägröhrchen

Ein gefriergetrocknetes Glas mit einer Kultur von Streptomyces clavuligerus (NREI 3585) wird aseptisch· geöffnet und der.Mikroorganismus auf Agar-Schrägröhrchen der folgenden Zusammensetzung übertragen:

- 17 209849/1194

Dextrin	. 10,0 g
Hefeextrakt	1,0 g
hydrolysiertes Casein (N-Z-Amin, Typ-A)	2,0 g
Einderextrakt	1,0 g
Agar	20,0 g
mit entmineralisiertem Wasser aufgefüllt auf	1,0 1

Der pH-Wert dieses Mediums wird mit Natronlauge auf 7,0 eingestellt. Die Schrägröhrchen werden < biert und in der Kälte aufbewahrt.

stellt. Die Schrägröhrchen werden dann 7 lage bei 28° C inku-

Stufe B: Saatsystem

Die Schrägröhrchenkultüren der Stufe k werden zum Beimpfen von 100 ml Saatmedium der folgenden Zusammensetzung verwendet:

Glucose . 15,0 g

Sojabohnenmehl 15>0 g

Maisquellwasser 5,0 g

Galciumcarbonat 2,0 g

Natriumchlorid 5,0 g

mit entmineralisiertem Wasser

aufgefüllt auf 1,0 1.

Dieses Medium wird mit Natronlauge auf einen pH-Wert, von 6,7 eingestellt. Dann wird das Saatmedium 4-8 Stunden bei 28° ö unter Schütteln in einer mit 220 U/min umlaufenden Taumel-Schüttelmaschine mit einem Hub von 5 cm inkubiert.

Stufe 0; Erzeugung des Antibioticums

1,0 ml Impfgut aus der Saatstufe wird verwendet, um 40 ml Produktionsmedium in 250 ml-Erlenmeyerkolben zu beimpfen. Dieses Medium hat die folgende Zusammensetzung:

- 18 -

20 9 849/1194

14 957

Medium I: ·' *

2224707	i°
4,8	ίο
0,5	*ίο ■*
2,1	ί°
0,8	ίο
0,5	*\ ί .*
ο,ο	1.
ι,ο

Stärke

lösliche Schlempebestandteile

Sojabohnengrütze

Glycerin ^- _Nj

hydrolysiertes Casein (N-Z-Amin, Typ A)

Eisen(II)-sulfat-heptahydrat

mit Leitungswasser aufgefüllt auf

Diese Lösung wird mit Natronlauge auf einen pH-Wert von 6,5 eingestellt, auf 250 ml-Erlenmeyerkolben verteilt und durch .15 bis 20 Minuten langes Erhitzen auf 120° C bei 1,05 kg/cm² sterilisiert. Die Inkubation erfolgt über einen Zeitraum von vier Tagen bei 28° C in der Schüttelmaschine bei 220 U/min und einem Hub von 5 cm.

Wenn die Fermentation beendet ist, werden die Zellen abzentrifugiert, und die Fermentationsflüssigkeit wird mit Phosphatpufferlösung (pH 7,0) verdünnt. Die Konzentration der 7-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(carbamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem~4-carbonsäure in der Fermentationsflüssigkeit wird nach der biologischen Scheibenanalysenmethode bestimmt. Als TestOrganismus verwendet man Yibrio percolans (ATCC 8461). Filterpapierscheiben werden in verdünnte Fermentationsflüssigkeiten getaucht und auf agarhaltige Petrischalen aufgelegt, die mit dem Testorganismus Vibrio percolans (ATCC 8461) geimpft worden sind. Ferner werden auf diese Petrischalen Scheiben aufgelegt, die zuvor in genormte Lösungen mit bekannten Konzentrationen des Antibioticums getaucht worden sind. Die Scheiben werden übernacht bei 28 C inkubiert und die Durchmesser der Hemmungszonen verzeichnet. Die Konzentration des Antibioticums in der Fermentationsflüssigkeit wird durch Interpolieren aus der Standardkurve berechnet, die die Beziehung zwischen dem Hemmungszonendurchmesser und bekannten Konzentrationen der Normlösungen des Antibioticunrs

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angibt. Nach diesem Verfahren wird berechnet, dass Streptomyces clavuligerus NRRL 3583 in dem Grundproduktionsmedium im Mittel 749 γ/ml 7-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(carbamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure erzeugt.

Stufe P; Zusatz von Natriumthiosulfat

Durch Zusatz von Natriumthiosulfat zu dem Medium I in Stufe C wird die Ausbeute an 7-(D~5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(carbamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephein-4-carbonsäure bedeutend erhöht. In Tabelle I ist das Ausmass dieser Erhöhung für einen Bereich von verschiedenen Konzentrationen angegeben. Der Leerversuch wird gemäss den oben beschriebenen Verfahrensstufen A bis C durchgeführt, und die übrigen Versuche v/erden in gleicher Weise, aber unter Zusatz der angegebenen Mengen an Natriumthiosulfat vom Zeitpunkt 0 bis 48 Stunden durchgeführt. Die Zeit Null bedeutet, dass das Natriumthiosulfat etwa zur Zeit der Beimpfung mit'der Saat aus der Stufe B zugesetzt wird. Die Analysen werden, wie in Stufe C beschrieben, durchgeführt.

	Kolben	T a b e	lie I	Antibioticum-
	1	Zeitpunkt	Zugesetztes	erzeugung, γ/ml
Versuch	2	des Zusatzes	Thiosulfat	721
1	3	Leerversuch	0	865
	1	0 h	0,10 io	828
	2	24 h	o,io io	755
2	3	Leerversuch	0	991
	4	O h	o,io io	1163
	5	O h	0,20 io	856
	6	O h	0,40 io	1120
	40 h	o,io io	1095
	48 h	0,10 $

209 8 49 / 1194

14 ypY	Kolben	.Tabelle I	(PortSetzung)	2224707	748
	1	Zeitpunkt		936
	2	des Zusatzes	Zugesetztes Antibioticum-	845
Versuch	3	Leerversuch	Thiosulfat erzeugung, γ/ml	1023
3.	4	0 h	0	658
	1	0 h	0,10 $	945
	2	Oh	0,20 <fo	1154
	3	Leerversuch	0,40 $	1150
4	4 .	0 h	0	1162
	5	0 h	0,10 fo	891
	1	0 h	0,20 <f	1211
	2.	Oh ·	0,40 ft	1291
	5	Leerversuch	0,60 $>	1133
5	4	0 h	0	766
	1	O h	0,10 $	995
	2	Oh	■ 0,20 fo
		Leerversuch	0,40 $
6	0 h	0
		0,20 $

Die Ergebnisse der Tabelle I zeigen, dass der Zusatz von Natriumthiosulfat die Erzeugung des Antibioticums in sechs Versuchen im Mittel um 40 $ erhöht. Weder der Zeitpunkt des Zusatzes noch die Konzentration an Thiosulfat scheint besonders ausschlaggebend zu sein.

Beispiel 7 Zusatz von Natriumthiosulfat und/oder L-oc-Aminoadipinsäure

Bei diesem Versuch arbeitet man nach Beispiel 6 mit dem Unterschied, dass die dort angegebenen Konzentrationen an ETatriumthiosulfat durch die folgenden Konzentrationen an L-a-Aminoadipinsäure allein bzw. an Natriumthiosulfat in Kombination

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mit L-cc-Aminoadipinsäiire (L-AAA) ersetzt'werden. Die Zusätze erfolgen zu dem Impfgut des Beispiels 6, Stufe G, vor der Inkubation.

	Zusatz	T a	bei	le II	Antibioticum-
Kolben	keiner				erzeugung, γ/ml
Nr.	0,025 ?	an Na^S₉C	)^ und	L-AAA	766
1	0,050 ?	(Leerversuch)		833
2	0,20 fo	i L-AAA		880
3	0,20 #	δ L-AAA		995
	0,20 #	Na₂S₂O^		1051
5		io L-AAA	1195
6		# L-AAA

	Na₂S₂O^, + 0,025
Na₂S₂O₃H
ν 0,05

Die Ergebnisse zeigen, dass dez? kombinierte Zusatz von Natrium thiosulfat und L-cc-Aminoadipinsäure (L-AAA) die Erzeugung des Antibioticums 7-(D-5-Aroino-5-carboxyvaleramido)-3-(oarbamoyloxymethyl)~7-meth.o>:y-3-cephe!B-4--oarbonsäure stärker beschleunigt als der Zusatz von Natriumthiosulfat allein. Der Zusatz eines Gemisches aus 0,20 $ Na₂S₂O, und 0,05 $ L-oc-Aminoadipinsäure erhöht die Ausbeute an 7-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(carbamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-car~ bonsäure am wirksamsten.

Beispiel Zusatz von Natriumdithionit

Man arbeitet nach Beispiel 6, jedoch in Stufe D mit Natriumdithionit (Na₂S₂O.) anstelle des Natriumthiosulfat. In der folgenden Tabelle sind die Konzentrationen an Natriumdithionit und die darauf zurückzuführenden Ausbeutesteigerungen an dem Antibioticum angegeben.

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209849/119A

14 957	•Tabelle III	2224707
	Zeitpunkt des Zusatzes,
	Stunden	Antibiotioum-
Ha₂S₂O₄, fo	0	erzeugung, γ/ml
keines (Leerversuch)	0	703
0,025	0	O
0,050	24	O
0,025	24.	835
0,050	31	763
0,025	31	793
0,050	738

Diese Ergebnisse zeigen,.dass das Natriumdithionit die Synthese des Antibioticums erhöht, wenn es 24 bis 31 Stunden nach der Beimpfung zugesetzt wird; wenn man die Verbindung jedoch zu Beginn der Fermentation zusetzt, hemmt sie das Wachstum des Mikroorganismus.

- 23 209849/ 1194

Claims

Merck & Co., Inc. 19. flAI 1972 14 957 Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung von T-Cl^- amido)-3-(carbamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbon~ säure durch Züchten eines neuen Actinomyceten in einem Nährmedium, dadurch gekennzeichnet, dass man dem Nährmedium Natriumthiosulfat, Natriumdithionit oder oc-Aminoadipinsäure für sich allein oder in Kombination zusetzt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass mami' als Actinomyceten einen neuen Stamm von Streptomyces verwendet.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man als Actinomyceten Streptomyces lactamdurans oder Streptomyces .clavuligerus verwendet.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man das Natriumdithionit oder Natriumthiosulfat 24 "bis Stunden nach der Beimpfung mit einer Kultur von Streptomyces lactamdurans zusetzt.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass man als Zusatz Natriumthiosulfat verwendet.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass man zu dem Fermentationsmedium ausser Natriumthiosulfat DL-cc-Aminoadipinsäure zusetzt«

- 24 209849/ 1 1 9 Λ

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass man die DL-cc-Aminoadipinsäure in Mengen von etwa 0,005 bis 0,015 Gewichtsteilen auf je 100 Raumteile fermentationsmedium zusetzt.

8. Verfahren zur Herstellung von 7-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(carbamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carl)onsäure durch Beimpfen eines wässrigen komplexen organischen Mediums mit Streptomyces lactamdurans und Kultivieren dieses Mikroorganismus unter aeroben Bedingungen, bis er dem Medium eine wesentliche antibiotische Aktivität verliehen hat, dadurch gekennzeichnet, dass man zu dem Medium 24 bis 48 Stunden nach der Beimpfung mit der Kultur von.Streptomyces lactamdurans 0,005 bis 0,1 Qiewiehtsteile Natriumthiosulfat, bezogen auf je 100 Raumteile Fermentationsmedium, zusetzt.

9. Verfahren nach Anspruch 8·, dadurch gekennzeichnet, dass

• man das Natriumthiosulfat in einer Konzentration von 0,1 Gewichtsteil auf je 100 Raumteile des komplexen.organischen Mediums zusetzt.

10. Verfahren zur Herstellung von 7-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(carbamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure durch Beimpfen eines Nährmediums mit Streptomyces clavuligerus, dadurch gekennzeichnet, dass man zu dem Nährmedium Natriumthiosulfat, Natriumdithionit, oc-Aminoadipinsäure oder eine Korabination aus Natriumthiosulfat und a-Aminoadipinsäure zusetzt.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass man Natriumthiosulfat und L-oc-Aminoadipinsäure dem Nährmedium etwa zum Zeitpunkt der Beimpfung mit der Kultur von Streptomyces clavuligerus zusetzt. '

- 25- 209849/119

I
I ·

12. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass man das Natriumthiosulfat in Konzentrationen von etwa
0,025 "bis 0,2 Gewichtsteilen und die Ii-cc-Aminoadipinsäure in Konzentrationen von etwa 0,1 "bis 0,4 Gewichtsteilen
auf je 100 Raumteile des Nährmediums zusetzt.

13. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass man das Natriumthiosulfat in einer Menge von 0,20 Gewichtsteilen und die L-cc-Aminoadipinsäure in einer Menge von 0,05 Gewichtsteilen auf je 100 Raumteile des Nährmediums vor dem Beimpfen zusetzt.

14. Verfahren nach Anspruch 1*0, dadurch gekennzeichnet, dass man 0,005 "bis 0,4; Sewichtsteile L-a-Aminoadipinsäure auf je 100 Raumteile Nährmedium vor dem Beimpfen zusetzt.

15. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass man dem Nährmedium Natriumthiosulfat zusetzt.

16. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass man dem Nährmedium Natriumdithionit nach dem Beimpfen
zusetzt. '

17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass man das Natriumdithionit in Mengen von 0,005 Ms 0,075
Gewichtsteilen ^e 100 Raumteile Nährmedium zusetzt.

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