DE2146400A1

DE2146400A1 - Neuer biosynthetischer Wirkstoff, Verfahren zu seiner Herstellung und diesen Wirkstoff enthaltende Arzneipräparate

Info

Publication number: DE2146400A1
Application number: DE19712146400
Authority: DE
Inventors: Denis Redhill; Rolinson George Newbolt Newdigate Surrey; Butterworth (Großbritannien). A61k 9-00
Original assignee: Beecham Group Ltd., Brentford, Middlesex (Grossbritannien)
Priority date: 1970-09-17
Filing date: 1971-09-16
Publication date: 1972-03-23
Also published as: DK130226B; CH562320A5; NL7112650A; BE772636A; FR2106582A1; DE2146400B2; AU3358471A; FR2106582B1; DK130226C; DE2146400C3; US3919415A; GB1363075A

Description

" Neuer biosyntiietischer Wirkstoff, Verfahren zu seiner Herstellung und diesen Wirkstoff enthaltende Arzneipräparate "

Priorität: 17. September 1970, Grossbritannien, Nr. 44 365/70 17. September 1970, Grossbritannien, Nr. 44 366/70

Die Erfindung betrifft einen neuen biosynthetischen Wirkstoff (MM 4550) in Form eines Feststoffes mit Säurefunktion, der dadurch gekennzeichnet ist, dass er in Porm des Bariumsalzes das als Anlage beigefügte Infrarot-Absorptionsspektrum auf v/eist und dass er eine Inhibitorwirkung gegenüber der Spaltwirkung von ß-Lactamase-Enzymen auf Penicilline und Cephalosporine zeigt. Die Erfindung betrifft ausserdem nicht-giftige Salze dieses neuen Wirkstoffes. Der neue V/irkstoff zeigt hingegen kein charakteristisches UV-Spektrum,

Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung dieses neuen biosynthetischen Wirkstoffes ist dadurch gekennzeichnet, dass ein Stamm von Streptomyces olivaceus oder eine Mutante desselben in einem Nährmedium gezüchtet wird, welches assimilierbaren Kohlenstoff und assimilierbaren Stickstoff liefernde Verbindun-

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gen sowie Mineralsalze enthält, und dass anschliessend der Wirkstoff aus diesem Medium abgetrennt wird.

Vorzugsweise wird das erfindungsgemässe Verfahren mittels der Stämme von Streptomyces olivaceus ATGC 21379, ATCC 21380, ATCC 21381 und ATCC 21382 durchgeführt. Diese hinterlegten Stämme wurden aus verschiedenen Erdproben isoliert und als zur Gattung Streptomyces olivaceus gehörig identifiziert.

Vorzugsweise wird die Züchtung des betreffenden Hicroorganismus aerobisch bei Temperaturen zwischen 20 und 35⁰C und insbesondere bei Temperaturen von. 30 bis 31⁰C in einem IJährmedium bei einem p^-Wert von etwa 7 durchgeführt. Die Züchtung dauert zweckmässig bis zu etwa 7 Tagen und insbesondere bis zu etwa 2 Tagen.

Der Wirkstoff MM 4550 kann dann aus dem Permentationsmedium durch Ionenaustauschverfahren, durch Chromatographie, durch Gelfiltration oder andere bekannte Abtrennungsmethoden isoliert werden.

Die vorstehend genannten vier hinterlegten Stämme mit der Kennnummer ATCC 21379 bis 21382 wurden in den verschiedensten Ilährmedien bezüglich ihrer Wachstumseigenschaften, bezüglich der Melaninerzeugung, bezüglich ihrer Sporenmorphologie und auch mittels physiolpgiscner Teste geprüft, beispielsweise im Bezug auf die Stärkehydrolyse, die Gelatineverflüssigung und die Nitratreduktion. Auf Grund der dabei erzielten Ergebnisse wurden sie einwandfrei als zur Gattung Streptomyces olivaceus zugehörig bestimmt.

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' -3- 2H6400.

Bei der praktischen Durchführung des erfindungsgeraässen Verfahrens zur Herstellung des neuen Wirkstoffes MM 4550 v/iz'd zunächst eine Kultur des Mikroorganismus auf einem geeigneten Nährmedium zwecks Sporenbildung gezüchtet. Pur Mikroorganismen der Spezies Streptomyces olivaceus hat sich insbesondere eine

Hefeextrakt-Glucose-Aga-rmischung für diesen Zweck als geeignet erwiesen. Nach der Beimpfung wird diese Kultur etwa 1 biö 2 Wochen lang bei 28 G bebrütet. Die gebildeten Sporen werden darm mittels sterilen V/assers von dem IJährmedium abgespült und diese Sporensuspension wird zum Beimpfen eines wässrigen Uährmediums verwendet, in welchem der Mikroorganismus weiter wächst und dabei den neuen biosynthetischen Wirkstoff MM 4550 erzeugt. Das so erhaltene Mycel kann ausserdem dazu benutzt v/erden, um eine zweite Menge eines flüssigen Fermentationsmediums zu beimpfen, wodurch erneut der biosynthetische Wirkstoff erzeugt wird.

Die betreffenden Fermentationsmedien müssen Verbindungen enthalten, welche assimilierbaren Kohlenstoff und assimilierbaren Stickstoff sowie anorganische Salze liefern. Geeignete Lieferanten für assimilierbaren Stickstoff sind Hefeextrakt, Sojabohnenmehl, Fleischextrakt, Baumwollsaatmehl,bei der Malzdestillation anfallende getrocknete lösliche Rückstände, einzelne Aminosäuren, Proteinhydrolysate sowie Ammoniumverbindungen und !Titrate. Geeignete Kohlenstofflieferanten sind Glucose, Lactose, Maltose, Stärke und Glycerin. Die Ausbeute an dem gewünschten neuen Virkstoff kann durcn Mitverwendung verschiedener Metallsalze in dem Permentationsmedium erhöht v/erden, beispielsv/eise Mangansalze oder Kobaltsalze sowie Kalk (ausgefälltes Calciumcarbonate

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Nachdem man die Fermentation bis zu etwa 7 i'ageii hat fortschreiten lassen, wird das Fermentationsmedium vom liycel befreit und der neue Wirkstoff MH 4550 wird dann aus der Fermentationsflüssigkeit extrahiert. Die Fermentation kann selbstverständlich auch mittels eines kontinuierlichen Strömungsverfahrens durch geführt v/erden.

Es hat sich gezeigt, dass der neue Wirkstoff MM 4550 zur Hauptsache in der Fermentationsflüssigkeit enthalten ist, und dass nur sehr wenig in den Zellen des Mikroorganismus zurückgehalten wird, liach Abtrennung des Mycels aus der Fermentati ons flüssigkeit nach Beendigung· der eigentlichen Züchtungsperiode, beispielsweise durch Filtration, kann der Wirkstoff Ι·Ι1Ί 4550 in einem wesentlichen Ausmass dadurch gereinigt v/erden, dass man beispielsweise die den Wirkstoff enthaltende Fermentationsflüssigkeit mit einem Anionenaustauschermaterial, beispielsweise einer ionenaustauschenden Cellulose^, behandelt und anschliessend die absorbierte Wirkstoffsubstanz eluiert. Die so erhaltene Lösung kann dann durch weitere Ionenaustauscherbehandlungen auch entsalzt werden. Eine andere Möglichkeit besteht darin, zunächst · die Fermentationsflüssigkeit an einer Säule aus Cellulose oder an einer Säule aus einem liationenaustauscher, wie Amborlite CG50_; chromatographisch zu behandeln, da der Wirkstoff Ia-I 4550 schneller durch eine solche Trennsäule hindurchgeht als die

Ausmass
Verunreinigungen. Ein gewisses/an Reinigung kann auch dadurch erzielt werden, dass man die Fermentationsflüssigkeit einer Gelfiltration mittels beispielsweise Sephadex G15 oder G25 unterwirft.

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Nach Durchführung einer oder mehrerer der vorstehend beschriebenen .Reinigungsmassnahmen kann die dabei erhaltene wässrige gereinigte Fraktion einer Gefriertrocknung unterworfen werden. Auf diese Weise erhält man den neuen Wirkstoff I'M 4550 in Form eines festen Präparates. Dieses Präparat sowie auch gereinigte und gegebenenfalls aufkonzentrierte Fermentationsflüssigkeiten können mittels der verschiedensten Extraktionsmethoden noch v/eitergehenden Reinigungen unterworfen werden. Es hat sich gezeigt, dass der biosynthetische Wirkstoff MM 4550 bei saurem und neutralem ρτ,-Wert in der vom Mycel befreiten Fermentationsflüssigkeit relativ stabil ist. Bei den teilweise gereinigten wässrigen Fraktionen ist jedoch die Stabilität des Wirkstoffes v/esentlich geringer und darüber hinaus zersetzt sich der Wirkstoff während der Verdampfung bei vermindertem Druck oder bei der Gefriertrocknung in einem gev/issen Ausmass.

Demzufolge sind die mittels solcher Massnahmen erhaltenen festen Präparate mit Zersetzungsprodukten des aktiven Wirkstoffes verunreinigt. Durch Zusatz eines Borats lässt sich jedoch die Stabilität der Wirkstoffpräparate während ihrer Reinigung und sonstigen Handhabung verbessern.

Die Tatsache, dass sich der Wirkstoff MM 4550 einer Gelfiltration unterwerfen lässt und dass er durch eine Dialysemembrane hindurchgeht, v/eist daraufhin, dass der Wirkstoff ein relativ niedriges Molekulargewicht aufweist.

Bei Durchführung einer Elektrophorese während 25 Minuten bei einer angelegten Spannung von 3000 Volt (etwa 60 Volt/cm) und .unter Verwendung eines Pyridin-Essigsäurepuffers bei einem

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jj von 5,3 v/andert der neue Wirkstoff auf einem 40 cm 1 anunter Verwendung von

gen Papierstreifen aus Whatman 3K-i Papier/,- mi τ Ceilophan abgedeckten Papierdpcnten einer Gesamtlänge von etwa 10 mm insgesamt etv/a 18 cm in Richtung auf die Anode. Der dabei verwendete Puffer besteht aus einer 0,067 molaren Essigsäurelösung, welche mittels Pyridin auf einen p_H-Wert von 5,3 eingestellt worden ist. Bei Durchführung einer DünnschichtChromatographie auf aus Cellulose bestehenden Chromatogrammblättern, welche mit einer Mischung aus Aceton und dem bei der Elektrophorese verwendeten Pyridin-Acetatpuffer (Mengenverhältnis 2 : 1) entwickelt v/erden, zeigt der neue Wirkstoff MK 4550 einen R--Wert von etwa 0,85. Die Lage des neuen biosynthetischen Wirkstoffes auf den Chromatogrammen oder den Elektropherogrammen lässt sich mittels biologischer Auswertung oder durch Besprühen mit dem Reagens nach Ehrlich bestimmen. Dieses Reagens besteht aus einer Lösung von 300 mg 4-Dimethylaminobenzaldehyd in 9 ml konzentrierter Salzsäure, 9 ml Äthanol und 54 ml n-Butanol. Der neue Wirkstoff ergibt dabei eine blaue Farbreaktion. Der neue Wirkstoff MM 4550 kann auch während der Fermentation und während der Isolierungsmas snahmen durch den Lochplatten-Diffusions test bestimmt werden. Zu diesem Zweck wird eine geschmolzene Nähr-Agarmasse bei 45 C mit einem geeigneten ß-Lactamase erzeugenden Stamm von Klebsiella aerogenes beimpft und dann setzt man eine solche Menge einer sterilen Lösung von Penicillin G hinzu, dass die Penicillinkonzentration in dem Agar 10 ug/ml beträgt. Die Agarmasse wird dann in eine Petrischale eingegossen und nach der Verfestigung werden unter Verwendung eines sterilen Metallschneiders in gleichmässigen Abständen zylindrische Löcher in die Agarschicht eingestanzt. Die zu prüfende Lösung wird dann

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in diese löcner eingefüllt. Die Platte wird bei einer konstanten Temperatur im Bereich von 27 "bis 37⁰C bebrütet. Während dieser Bebrütungszeit diffundiert der Wirkstoff MM 4550 der in der Testlösung enthalten ist, in die Agarplatte hinein und inhibiert damit die Wirkung der ß-Lactamase, Vielehe durch die in der Agarplatte vorhandenen Klebsiella-Zellen erzeugt wird. Das gleichfalls in der Agarplatte vorhandene Penicillin G wird dadurch vor einer Zerstörung durch die ß-Lactamase bewahrt und ist in ausreichenden Konzentrationen vorhanden, um ein Weiterwachsen von Klebsiella zu verhindern. In denjenigen Teilen der Agarplatte, in welche der neue Wirkstoff MM 4550 nicht eindiffundiert ist oder keine ausreichende Konzentration aufweist, wird hingegen das Penicillin G durch die ß-Lactamase zerstört und daher entwickelt sicn an diesen Stellen der Agarplatte ein dichtes Wachstum von Klebsiella. Infolgedessen bilden sich um diejenigen Löcher, welche den Wirkstoff MM 4550 enthalten, klare kreisförmige Zonen aus, in denen das Wachstum von Klebsiella verhindert ist. Die Grosse einer jeden solchen Zone hängt von dex' Konzentration des neuen Wirkstoffes in der zu prüfenden Lösung ab.

Eine andere Möglichkeit zur Bestimmung der Menge und Aktivität dos neuen Wirkstoffes KM 4550 in einer zu prüfenden Lösung besteht darin, das Ausmass der·Inhibierung einer durch ß-Lactamase hervorgerufenen Hydrolyse von Penicillin G festzustellen. Die Anfangsreaktionsgeschwindigkeit wird dabei sowohl in Anwesenheit als auch in Abwesenheit des Prüfmaterials gemessen. Die Hydrolysegeschwindigi-:eit von Penicillin G lässt sich dabei durch mikrojodometrische Kessung der gebildeten Penicilloinsäure ermitteln.

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Die nachstehende Tabelle I belegt das breite Spektrum der antibiotischen .Wirksamkeit des neuen Wirkstoffes ΜΙΊ 4550 gegenüber den verschiedensten klinisch bedeutsamen Erzeugern von ß-Lactamase. Für jedes Enzympräparat wird der Prozentsatz der Inhibierung einer Hydrolyse von Penicillin G angegeben, welche auf der Mitverwendung des neuen Wirkstoffes in dem betreffenden Enzympräparat beruht.

Die Enzymmengen in den betreffenden Präparaten sind so gewählt, dass die Hydrolysegeschwindigkeit von Penicillin G unter den Versuclisbedxngungen im Bereich von 0,1 bis 0,2 ^g/ml/min-liegt. Die Enzympräparate v/erden unter Zusatz von insgesamt 10 jig/ml Penicillin G bei einem p_H-Wert von 7,0 in einem m/20-Phosphatpuffer bei einer Temperatur von 37 C sowohl in Abwesenheit als auch in Anwesenheit des neuen Wirkstoffes bebrütet. Die Konzentration des V/irkstoffes entspricht einer Verdünnimg der geklärten Permentationslösung im Verhältnis 1 : 625.

Tabelle I

Inhibierung der Reaktionsgeschwindigkeit während der ersten

10 Minuten

ß-Lactamase erzeugender Mikroorganismus I Inhibierung,

Escherichia coli, Stamm BIl Escherichia coli, Stamm HS Klebsieila aerogenes, Stamm Al Proteus vulgaris, Stamm A Pseudomonas pyocyanea, Stamm A Bacillus cereus, Stamm B569/H Staphylococcus pyogenes, Stamm A Staphylococcus pyogenes, Stamm H

86 23 83 51 13 68 0 18

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In jeden Fall ist die Inhibierung fortschreitender Art, d.h. sie nimmt mit der Zeitdauer der Einwirkung des Inhibitors auf das Enzym zu, wie sich insbesondere aus der nachstehenden Tabelle II ergibt, in-welcher der Prozentsatz der Inhibierung d.er anfänglichen Hydrolysegeschwindigkeit von Penicillin G nach einer während unterschiedlicher Zeiträume durchgeführten "Vorbebrütung des Enzyms mit dem Wirkstoff gemessen wird.

Tabelle II

Portschreitende Inhibierung von ß-Lactamase-Enzymen durch den ' Wirkstoff HM 4350 (in Prozent)

I	ß-Lactamase erzeugender	Dauer der Vorbebrütung (Min.),	30	60	120 i
Mikrο organi smus	0	92	92	— ;
Esciierichia coli, Stamm BIl	19	43	44	- !
Escherichia coli, Stamm HS	21	36	39	— ■
Iilebsiella aerogenes, Stamm Al	•9	12	12	— i
Proteus vulgaris, Stamm A	0	26	60	70
Bacillus cereus, Stamm B569/H	0	30	40	60
Staphylococcus pyogenes, Stamm A	0	—	20	30
Staphylococcus pyogenes, Stamm H	0

Es hat sich auch gezeigt, dass diese Inhibitorwirkung weder durch Zusatz von überschüssigem Substrat noch durch Dialyse umgekehrt wird. Diese irreversible und fortschreitende Wirkung der Inhibierung von j"3-Lacta^r;iase, welche schon bei niedrigen Konzentrationen des Wirkstoffes MM 4550 auftritt, ist vollständig neuartig und unterscheidet sich ganz wesentlich von der Inhibitorwirkung, welche bei bestimmten Penicillinen zu beobachten ist. V/eitere Prüfungen haben bestätigt, dass der Wirkstoff MM 4550 nicht ein allgemein wirksames Enzymgift ist.

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Der neue Wirkstoff MM 4550 in Form des besser gereinigten Bariumsalzes hat ausser der Inhibitorwirkung gegenüber i3-Lactaraase auch antibakterielle Eigenschaften. Auch Rohpräparate des Wirkstoffes MM 4550 zeigen eine gewisse antibakterielle Aktivität, docn ist diese wesentlicn schwächer als die Aktivität des gereinigten Bariumsalzes. Diese antibakterielle Aktivität konnte gegenüber Staphylococcus aureus Oxford und Klebsiella aerogenes gemessen werden.

Weiterhin zeigte sich ganz überraschend, dass ein antibakterieller Synergismus zwischen dem neuen Wirkstoff MM 4550 und Penicillin oder Cephalosporinen besteht.

Demgemäss betrifft die Erfindung auch Arzneipräparate, welche durch einen Gehalt an dem Wirkstoff MM 4550 sowie an einem Penicillin oder Cephalosporin gekennzeichnet sind. Der Wirkstoff kann in diesen Arzneipraparaten auch in Form eines nicht-toxischen Salzes und gegebenenfalls zusammen mit pharraekologiseh zulässigen Träger- und Verdünnungsmitteln vorliegen.

Bei dem in den Arzneipraparaten mit verwendeten Penicillin oder Cephalosporin kann es sich um eine Verbindung mit Wirkung gegenüber grampositiven Bakterien oder aber auch um eine Breitbandwirkung handeln, d.h. die Penicilline bzw. Cephalosporine können auch eine gewisse Resistenz gegenüber pathogenen Bakterien aufweisen, welche die verschiedensten ß-Lactamase-Enzyme erzeugen.

Palis die Arzneipräparate in Form von Tabletten oder als Kinder medizin in Form von Sirupen vorliegen, s.o können sie inerte Füll stoffe, Bindemittel und Schmiermittel enthalten. Für parenterale Präparate enthalten die Arzneipräparate steriles Wasser und aus-

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serdein können sie auch in Form von Gelatinekapseln vorliegen.

Der antibakterielle Synergismus zwischen dem erfindungsgemässen neuen Wirkstoff und einem Penicillin ergibt sich aus den in der nachstehenden Tabelle III angegebenen Versuchsdaten, welche die minimale Heinmkonzentration von Ampicillin allein und von Ampicillin in Kombination mit dem neuen Wirkstoff gegenüber den verschiedensten klinisch bedeutsamen pathogenen Bakterienarten zeigt.

Tabelle III

Minimale Hemrnkonzentration (ug/ml) von Ampicillin (^ r-Aminobenzylpenicillin)

BaVterienstamm Ampicillin Ampicillin mit

liakt en en stamm allein Wirkstoff

_: MM 4550*

Klebsiella aerogenes A Klebsiella aerogenes E70 Proteus mirabilis 8 Proteus mirabilis 11 Proteus mirabilis 889 Staphylococcus aureus Russell Staphylococcus aureus H Staphylococcus aureus 1517

*) Der Wirkstoff HM 4550 wird dabei in einer Konzentration verwendet, welche einem Zehntel der Konzentration des für den Versuch verwendeten geklärten Fermentationsniediums entspricht. Dieses Fermentationsmedium selbst zeigt keine antibiotische Aktivität, wenn es in der gleichen Konzentration gegenüber den acht untersuchten Bakterienstämmen allein geprüft wird.

Die nachstehende Tabelle IV erläutert den antibakteriellen Synergismus zwischen, dem neuen Wirkstoff und einem Cephalosporin. Auch hier ist wiederum die minimale Hemmkonzentration

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100	2,5
250	10,0
1000	5,0
1000	2,5
1000	2,5
500	2,5
500	2,5
1000	. 25

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des Cephalosporins allein und in Kombination rait dem Wirkstoff MM 4550 gegenüber den verschiedensten pathogenen ß-Laetamase erzeugenden Bakterienarten angegeben.

Tabelle IV

Minimale Hemmkonzentration (ug/ml) von Cephaloridin

.Bakterienstamm

Cephaloridin
allein

Cephalox'idin mit V/irkstoff HM 4550 *

Klebsieila aerogenes T201 Klebsieila aerogenes Oxy Β Escherichia coli BIl Escherichia coli 1506 Proteus vulgaris D Proteus vulgaris E

500	50
12,5	2,5
250	50
12,5 .	5,0
500	12,5
500	5,0

*) Bezüglich der Konzentration des V/irkstoff es Ml-I 4550 gilt das bei Tabelle III Gesagte.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Stämme von Streptomyces olivaceus mit der Hinterlegungsnumwer ATCC 21379, 213Ö0 und 21382 werden 7 Tage lang bei 28⁰C in flachen Medizinflaschen von 250 rnl Pass ung s vermögen auf einer schräg geneigten Agarfläche gezüchtet. Das Nährmedium hat die folgende Zusammensetzung:

Komponente Menge (g/Liter)

Hefeextrakt 10,0

Glucose 10,0

Agar 15,0

Vor dem Sterilisieren wird der p„-Wert des Nährmediums auf 6,8 eingestellt. Durch Abspülen der Schrägkulturen mit 35 ml sterilem Wasser, welches 0,02 Prozent eines oberflächenaktiven Mi t-

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4,	0
20,	0
10,	0

tels enthält, v/ird eine Sporensuspension jeder der drei genannten Bakterienstämme hergestellt. Jeweils 0,5 nil jeder Sporensuspension werden dafür verwendet 20 ml eines sterilen Fermentationsmediums zu beimpfen, welches sich in Erlenmeyer-Kolben von 100 ml Fassungsvermögen befindet, die mit Gaze und Wattebäuschen verschlossen sind. Dieses Fermentationsmedium hat die folgende Zusammensetzung:

Komponente Menge (g/Liter)

Hefeextrakt Glucose Malzextrakt

Der p„-Yfert dieses Fermentationsmediums wird auf 8,0 eingestellt und dann wird es 15 Hinuten lang im Autoklaven bei 120⁰C sterilisiert. Nach der Beimpfung werden die Fermentationskolben 4 Tage lang bei einer Temperatur von 28 0 auf einem rotierenden Rüttler bebrütet, welcher eine Umdrehungszahl von 240 UpM und eine Hubhöhe von 32 nun hat. Anschliessend wird die Fermentationsflüssigkeit jedes Kolbens durch Zentrifugieren vom Mycel befreit und dadurch geklärt und die überstehenden Flüssigkeiten werden mittels der vorstehend beschriebenen Lochplatten-Diffusionsmethode bezüglich der Aktivität und des Vorliegens des neuen biosynthetischen Wirkstoffes MM 4550 geprüft. Die Ergebnisse sind wie folgt:

Mikroorganismus Durchmesser der Inhibie-■ rungszone (mm)

ATCC 21379 17,0

ATCC 21380 19,3

ATCC 21382 20,9

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Beispiel 2

Gemäss der Arbeitsweise von Beispiel 1 wird eine Sporensuspension des Stammes ATCC 21379 von Streptomyces olivaceus hergestellt. Mit der Sporensuspension werden wiederum 20 ml eines Fermentationsmediums beimpft, welches sich in Erlerimeyer-Kolben von 100 ml Fassungsvermögen befindet, v/obei die Kolben durch Gaze und Wattepfropfen verschlossen sind. Dieses Fermentationsmedium A hat die folgende Zusammensetzung:

Fermentationsmedium A Komponente Mergp ig/Litor)

2,5 20,0 1,5 3,0 1,0 0,05 0,003 0,003 0,002

Der ρττ-Wert des Mediums wird auf 7,0 eingestellt und dann wird dieses 15 Minuten lang im Autoklaven bei einem Druck von

₂
1,05 kg/cm sterilisiert.

Ausserdem werden weitere Fermentationsmedien B, C und D hergestellt, bei denen jedoch anstelle von L-Arginiri-Monohydroehlorid die nachstehenden assimilierbaren Stickstoff liefernden Substanzen verwendet werden s

Medium B - L-Tyrosin Medium G - Natriumnitrat Medium D - Ammoniumsulphat.

BAD ORlGiNA*,

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L-Arginin-Monohydrochlorid	0
Lactose	0
K₂HPO₄	0
NaCl	0
MgSO₄.7H₂
CuSO₄.5H₂
ZnSO₄.7H₂
MnSO₄. 4H₂

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Die Bebrütung der Fermentationskolben wird 4 Tage lang bei einer Temperatur von 2β C auf einem rotierenden Schüttler (Umdrehungszahl 240 UpK, Hubhöhe 32 mm) durchgeführt. Anschliessend werden die Fermentationsmedien vom Mycel befreit und geklärt und dann wird jedes Fermentationsmedium bezüglich des Vörliegens und der Aktivität des neuen biosynthetischen Wirkstoffes mittels der Lochplatten-Diffusionsmethode geprüft:

Medium ■ Durchmesser der Inhibierungszone (mm)

A ' 22,1

B 21,6

C 13,7

D 12,9

Beispiel 3

Genäss der Arbeitsweise von Beispiel 1 wird eine Sporensuspension des hinterlegten Stammes ATCG 21379 von Streptomyces olivaceus hergestellt. I-Iit dieser Sporensuspension werden 20 ml eines sterilen Fermentationsmediums in Erlenmeyer-Eolben von 100 ml Fassungsvermögen beimpft. Das Fermentationsmedium hat die folgende Zusammensetzung:

Komponente Menge (g/Liter)

!-Tyrosin 1,0

Glucose 1,0

K₂HPO₄ · 2,0

Fe₂(SO₄)₅ 0,05

CuSO₄.5H₂O 0,003

KnSO₄.4H₂O 0,004

Der powert des Fermentationsmediums wird auf 7»0 eingestellt und dann v/ird dieses Medium 15 Minuten lang im Autoklaven bei

ρ
einem Druck von 1,05 kg/cm sterilisiert. Die Fermentations-

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kolben werden bei einer Temperatur von 28 C auf einem röbie-■ renden Schüttler (Umdrehungszahl 240 UpH, Kubhöhe 32 mm) bebrütet. Nach Bebrütungszeiten von 20 Stunden bzw. 44 Stunden bzw. 68 Stunden werden jeweils zwei Permentationskolben entnommen, vom Mycel befreit und dann wird das Permentationsmedium bezüglich der Menge und Aktivität des neuen Wirkstoffes M-I 4550 ■mittels der Lochplatten-Diffusionsmethode untersucht. Es werden die folgenden Ergebnisse erzielt:

Bebrütungsdauer (St'd. ) Mittlerer Durchmesser der Inhibierungszone (mm)

20 15,6

44 28,0

68 30,5

Beispiel 4

Gemäss der Aroeitsweise von Beispiel 1 stellt man von dem hinterlegten Stamm ATCC 21379 von Streptomyces olivaceus eine Schrägkultur auf einem Hefeextrakt-Glucose-Agar-Nährmedium. her. Zu jeder Schrägkultur werden dann 50 ml steriles entionisiertes Wasser mit 0,02 Prozent eines oberflächenaktiven Mittels augesetzt und die gebildeten Sporen werden durch Schütteln suspendiert. Diese Sporensusp.ension wird als Inoculum zu 75 Liter eines sterilisierten Fermentationsmediums in einem Fermentationsbehälter aus rostfreiem Stahl von 100 Liter Fassungsvermögen zugesetzt. Dieses Fermentätionsmedium hat die folgende Zusammensetzung:

Komponente Menge (g/Liter)

Soyabohnenmehl 10,0

Glucose-Monohydrat 20,0

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Als Schaumbremse werden vor dem Sterilisieren 50 ml einer lOvolumenprozentigen Lösung eines Polyoxyalkylenglykols in Soyabohnenöl zugesetzt. Der Fermentationsbehälter wird 20 Minuten lang bei 120⁰C mit Dampf sterilisiert. Man rührt dieses Kulturmedium mittels eines mit Leitschaufeln besetzten Schei-

benrührers von 19,05 cm Durchmesser mit einer Umdrenungsgeschwindigkeit von 140 UpM. Dabei wird sterile Luft durch einen Verteiler mit offenem Verteilerkopf in einer Menge von 75 Liter/Minute zugeführt. Der Fermentationsbehälter selbst ist mit Prallplatten ausgestattet. Die Bebrütung wird bei einer Temperatur von 28⁰C während 45 Stunden durchgeführt. Anschliessend setzt man 2,5 Liter dieses Fermentationsmediurns als Inoculum zu 50 Litern eines weiteren sterilen Fermentationsmediums in einem anderen Fermentationsbehälter aus rostfreiem Stahl von 90 Liter Fassungsvermögen hinzu.

Dieses weitere Fermentationsmedium hat die folgende Zusammensetzung:

Komponente Menge (g/Liter)

L-Tyrosin	1,0
Glucose-Monohydrat	1,0-
K₂HPO₄ ·	2,0
"C\ λ f O Ct* 1 I* ÜO V O \J A J Γ?	0,05
CuSO₄.5H₂O	0,003
MnSO₄.4H₂O	0,05

Man stellt den p„-Y/ert des Mediums mittels einer verdünnten Salzsäurelösung auf 7,0 ein. Als Schaumbremse werden 100 ml einer lOvolumenprozentigen Lösung einea oberflächenaktiven Mittels in Soyabohnenöl augesetzt. Dieses Fermentationsmedium wird

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~^lö~ 2U6400

20 Minuten lang bei 120⁰C mittels Dampf"in dem Fermentationsbehälter sterilisiert. Kan rührt unter Verwendung eines mit Leitschaufeln ausgestatteten Scheibenrührers von 12,7 cm Durchmesser mit einer. Geschwindigkeit von 430 UpH., wobei der Fermentationsbehälter selbst mit Prallplatten ausgestattet ist. tiber einen Verteiler mit offenem Kopf wird sterile Luft mit einer Geschwindigkeit von 50 Liter/Minute eingeleitet und die Fermentati ons temperatur wird auf 3O⁰C gehalten. Unter diesen Bedingungen wird die Bebrütung des Fermentationsmediums 48 Stunden lang durchgeführt. Zu verschiedenen Zeiten werden Proben des Fermentationsmediums abgezogen, das I-lycel wird daraus entfernt und die geklärte Fermentationslösung v/ird bezüglich der Menge und der Aktivität des gebildeten biosynthetisehen Wirkstoffes mittels der Lochplatten-Diffusionsmethode geprüft. Es werden dabei die folgenden Ergebnisse erzielt:

Bebrütungsdauer (Std.) Durchmesser der Inhibie-

rungszone (mm)

6	0
12	14,9
24	23,5
36	24,5
4ö	26,7

Nach Beendigung der Bebrütung wird das Hycel aus der gesamten Fermentationslösung abgetrennt und zwar mittels Zentrifugieren. Die dabei erhaltene klare überstehende Flüssigkeit wird bei 5°C gelagert.

300 ml dieser geklärten Fermentationslösung werden mittels eines Drehverüampfers im Vakuum auf 30 ml eingeengt. Mit diesem Konzentrat beschickt man eine Kationenaustauschersäule von

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5,08 cm Durchmesser und 2,44 P- Höhe, v/elche mit dem Kationenaustauacnerharz Amberlite IRC5O gefüllt ist, das mit eine^ !"iatriumboratpuffer ins Gleichgewicht gesetzt worden ist (0,1 Prozent
(Gewicht/Volumen) ITa₂B₄Or-,. 10H₂O, p„-Wert: ö). Diese Austauschersäule wird mittels des Boratpuffers eluiert und das Eluat wird in Fraktionen von jeweils 25 eil gesammelt. Die gesamten aktiven Fraktionen werden vereinigt und die dabei erhaltenen 250 ml Flüssigkeit werden irn Vakuum mittels eines Drehverdampfers bis auf 20 ml eingeengt. Dieses Konzentrat wi-rd an einer Ionenaustauschersäule (Amberlite XAD-I) von 2,54 cm Durchmesser und 45,7 cm Höhe entsalzt. Beim Eluieren mit entionisiertem Wasser v/erden Fraktionen von jeweils 10 ml gesammelt und die aktiven 'Fraktionen werden vereinigt. Man erhält so 80 ml Flüssigkeit. Diese
Flüssigkeit wird einer Gefriertrocknung unterworfen, wobei man 56 mg eines weissen Pulvers erhält. Durch die vorstehend angegebenen Hassnahmen wird eine Reinigun^swirkung erzielt, v/elche bezogen auf die Aktivität, dem fünffachen der Gesamtmenge an
Feststoffen in der vom I-Iycel befreiten Fermentationslösung
entspricht.

Beispiel 5

Gemäss der Arbeitsweise von Beispiel 4 züchtet man den hinterlegten Stamm ATCC 21379 von Streptomyces olivaceus unter \^rerwendung eines Fermentationsmediums der nachstehenden Zusammensetzung:

Komponente Menge (g/Liter)
Soyabohnenmehl 10,0

Glucose-IIonohydrat 20,0

.4H₂O . 0,05

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Nach 48 Stunden entfernt man das Myeel aus der Fermentationslösung und klärt diese durch Zentrifugieren. Bei Durchführung des Lochplatten-Diffusionstestes mit der geklärten Flüssigkeit erhält man eine Inhibierungszone von 28,6 mm. 10 Liter der geklärten Fermentations lösung v/erden mit 3 leg (liassgewicht) einer ionenaustauschenden Cellulose in Acetatform verrührt. Die gebildete Aufschlämmung wird filtriert und der Wirkstoff Wl 455-0 wird aus dem Ionenaustauscherharz unter Verwendung von 3 Liter einer 0,5 m Natriumsulfatlösung eluiert. Man erhält so einen Extrakt des. Wirkstoffes in einer Ausbeute von 80 Prozent. Dieser Extrakt wird im Vakuum mittels eines Drehverdampfers bis auf 80 ml eingeengt, wobei eine grosse Menge des natriumsulfats ausfällt, Das so erhaltene Konzentrat wird filtriert und dann an einer Ionenaustauschersäule (Amberlite XAD-2) von 2,54 cm Durchmesser und 1,52 m Höhe behandelt. Man eluiert mit entionisiertem V/asser und sammelt das Eluat in Fraktionen von jeweils 20 ml. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt und die dabei erhaltenen 500 ml Flüssigkeit werden durch Ultrafiltration bis auf 30 ml aufkonzentriert. Dieses Konzentrat ergibt beim Gefriertrocknen 100 mg eines weissen Pulvers, welches den Wirkstoff HM 4550 enthält, wobei die Aktivität etwa das 33fache derjenigen der gesamten in der geklärten Fermentationslösung enthaltenen gelösten Feststoffe beträgt.

Beispi-el 6

Gemäss der Arbeitsweise von Beispiel 4 wird der hinterlegte Stamm Al¹GC 21379 vom Streptornyces olivaceus gezüchtet, Das verwendete Fermentationsmedium hat die folgende Zusammensetzung:

2 0 9 8 1 3 / 1 U 3

Komponente Menge,(g/Liter)

Soyabohnenmehl 10,0

Glucose-Konohydrat 20,0 Fällung von Calciumearbonat 0,2

.KobaltChlorid (CoCl₂.6H₂O) 0,001

Als Schaumbremse werden 300 ml einer lOvolumenprozentigen Lösung eines oberflächenaktiven Mittels in Soyabohnenöl zugesetzt. Die Bebrütungsdauer beträgt 4ö Stunden. Anschliessend trennt man das Mycel ab und klärt die Fermentationslösung durch Zentrifugieren. Die geklärte Lösung wird mittels der Lochplatten-Diffusionsmethode untersucht und man erhält eine Inhibierungszone von 33,0 mm. 100 Liter der geklärten Fermentationslösung werden mit 12 kg (Iiassgewicht) einer ionenaustauschenden Cellulose in der Acetatform verrührt. Die gebildete Aufschlämmung wird filtriert und der neue Wirkstoff wird aus der Cellulose unter Verwendung von 12 Liter einer 0,5 m-Kaliumsulfatlösung eluiert. Der dabei gewonnene Extrakt wird bei einer Temperatur unterhalb 30 C im Vakuum mittels eines steigenden Filmverdampfers bis auf 6 Liter aufkonzentriert. Durch Zusatz von 12 Liter Aceton fällt der grösste Anteil des Kaliumsulfats aus. Die Lösung wird dann filtriert und im Vakuum bei einer Temperatur unterhalb 30 C durch Verdampfen bis auf 200 ml aufkonzentriert. Dieses Konzentrat wird an einer Ionenaustauschersäule (Amberlite XAD-2) von 76 mm Durchmesser und 2 m Höhe behandelt. Man eluiert mit entionisiertem V/asser und sammelt das Eluat in Fraktionen von jeweils 140 ml. Die aktiven Fraktionen (die Aktivität wird mittels der Lochplatteii-DiffaBionsmethode festgestellt) werden vereinigt und die so erhaltent'-n 2,2 Liter Flüssigkeit werden unter Stick-

,stoffdruck von 4,20 kg/cm mittels Ultrafiltration unter Verwen-

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dung einer Membran von 150 mm Durchmesser "bis auf 275 ml Flüssigkeit aufkonzentriert. Beim Gefriertrocknen dieses Konzentrats erhält man 2,2 g eines "braunen Pulvers. 1 g dieses Pulvers (32 Aktivitäteinheiten/mg) v/erden in 1 Liter einer 0,2 m-Natriumsulfatlösung aufgelöst und dann mit 1 Liter einer 2prozentigen Lösung (Gewicht/Volumen) von ietra-n-butyl-ammonium-hydrogensulfat in Dichlormethan vermischt. Unter der Einwirkung der Schwerkraft trennt sich die Dichlormethanphase ab und wird bis auf 20 ml aufkonzentriert. Dann setzt man 400 ml eines Leichtbenzins (Siedebereich 40 bis 60 C) hinzu und trennt den gebildeten Niederschlag durch Zentrifugieren ab. Dieser Niederschlag wird in 10 ml Dichlormethan aufgelöst und mit 10 ml V/asser extrahiert, welches 80 mg Bariumjodid und 70 mg Bariumcarbonat enthält. Die sich ausbildenden Phasen werden voneinander getrennt und die wässrige Phase wird filtriert und auf einen Ppj-Wert von 6,5 eingestellt. Durch Gefriertrocknen dieser Lösung erhält man ein gelbes Pulver. Der so gewonnene Feststoff wird mit Aceton ausgewaschen, um überschüssiges Bariumjodid aufzulösen. Durch Zentrifugieren wird ein schwach gelb gefärbter Feststoff isoliert und im Vakuum getrocknet. Man erhält auf diese V/eise 13 mg eines Feststoffes mit einer Aktivität von 320 Aktivitätseinheiten/mg.

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Beispiel 7

(a) Sine Mischung aus 125 mg Ampicillin-trihydrat und 125 mg des Wirkstoffes KM 4550 wird in Gelatinekapseln für orale Verabreichung eingefüllt.

(b) Entsprechende Mischungen des neuen Wirkstoffes v/erden unter Verwendung von 3 -Phenoxyäthylpenicillin und cx-Phenoxypropylpenicillin in Form von Gelatinekapseln hergestellt.

(c) Eine Mischung aus 250 mg des Natriumsalζes von Ampicillin und 125 nig des Wirkstoffes MM 4550 wird unter sterilen Bedingungen in eine Ampulle abgefüllt und diese wird verschlossen. Durch Vermischen des Ampulleninhalts mit sterilem Wasser erhält man eine Injektionsflüssigkeit für parenterale Verabreichung.

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Claims

"U 2U6400 Patentansprüche

1. Biosynthetisciier Wirkstoff (M-I 4550) in Form eines Peststoffes mit Säurefunktion, gekennzei chnet durch das als Anlage beigefügte Infrarot-Absorptionsspektrum (Bariunsalz) und durch eine Inhibitorwirkung gegenüber der Spaltwirkung von ß-Lactamase-Enzymen auf Penicilline und Cephalosporine, sowie nicht-giftige Salze des -Wirkstoffes.

2» Verfahren zur Herstellung des biosynthetischen Wirkstoffes nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ein Stamm von Streptomyces olivaceus oder eine liutante desselben in einem liährmedium gezüchtet wird, welches assimilierbaren Kohlenstoff und assimilierbaren Stickstoff liefernde Verbindungen sowie Mineralsalze entnält, und anschliessend den V'irkstoff aus dem Medium abgetrennt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Stämme ATCC 21379, ATCC 21380, ATCC 21381 und ATCC 21382 verwendet werden.

4. Verfahren nach Anspruch 2 und 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Züchtung aerob'isch bei 20 bis 35°C, vorzugsweise bei 30 bis 31°C, durchgeführt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Züchtung bis zu 7 Ta^en, vorzugsweise bis zu 2 Tagen durchgeführt wird.

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6. Arzneipräparate, gekennzeichnet durch einen Gehalt an dem Y/irlcstoff nach Anspruch 1 sov/ie an einem Penicillin, insbesondere O(-Aminobenzylpenicillin, cy-Phenoxyäthy!penicillin und a-Phenoxypropylpenicillin.

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