DE2044907C3 - Biotechnisches Verfahren zur Her stellung von L Threonin - Google Patents

Description

' Um ein vorteilhaftes industrielles Verfahren /ur

gärtechnischen Herstellung von !.-Threonin aufzufinden, wurde eine große Anzahl verschiedener Mutantenstämme auf ihre Fähigkeit untersucht, i.-Threonin zu erzeugen.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur gärtech- Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten

nischen Herstellung von L-Threonin durch aerobes Stämme sind Mutanten, die fähig sind, in einem Züchten von Mikroorganismen in Kohlehydraten, ß-Hydroxynorvalin enthaltenden Medium zu wachsen Stickstoffsubstanzen und Mineralsalze enthaltenden und die künstlich aus dem Elternstamm Proteus Nährmedien bei hierfür üblichen Temperaturen und 25 rettgeri ATCC 21 118 erhalten wurden. Diese Mu- ;>H-Werten. tanten unterscheiden sich genotypisch von dem

Aus der USA.-Patentschrift 3 375 173 ist ein Ver- Proteus rettgeri ATCC 21 118. Die Mutanten wurden fahren zur Herstellung von L-Threonin bekannt, bei dadurch erzeugt, daß Proteus rettgeri ATCC 21 118 dcrr, mutante Proteus-Stämme, die zum Wachstum gezüchtet wurde, wobei zum Wachstum isoleucin L-Isoleucin benötigen, eingesetzt werden. Bei diesem 30 erforderlich war, die erhaltenen Zellen zur Herbei-Verfahren werden ohne Zugabe von L-Hoinoserin führungder Mutation mit N-methyl-N-nitro-N-nitrosi.. zum Medium, nur geringe Ausbeuter, erhalten.

Aus der französischen Patentschrift 155 144 ist ein Verfahren zur Herstellung von L-Threonin bekannt, bei dem Escherichia coli-Stämme verwendet werden, die Isoleucin und Diaminopimelinsäure im Kulturmedium erfordern. Aus den britischen Patentschriften 181 592 und 1 185 130 sind Verfahren zur Herstellung von L-Threonin bekannt, bei denen Stämme der

gleichen Gattung verwendet werden, die im Kultur- 40 Ursprungsstamm nicht wächst. Der auf diese Weise medium entweder Diaminopimelinsäure, gegebenen- erhaltene Mutantenstamm Nr. 33M ist ein Stamm, falls zusammen mit Methionin, erfordern. Obwohl
diese Verfahren gute Ausbeuten liefern, handelt es
sich bei Diaminopimelinsäure um eine schwer zugängliche Aminosäure, weshalb weiterhin ein Bedürfnis 45
nach einem Verfahren zur Herstellung von L-Threonin
besteht, das gute Ausbeuten liefert, ohne daß die
Zugabe von schwer zugänglichen Aminosäuren erforderlich ist.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch 50 daß letzterer für sein Wachstum zusätzlich noch gelöst, daß man bei dem Verfahren der eingangs L-Methionin benötigt.

genannten Art als Mikroorganismen Proteus rettgeri Werden der /J-Hydroxynorvalin-resistente Stamm

ATCC 21 598 oder — ATCC 21 599 einsetzt. Nr. 33 und der 0-Hydroxynorvalin-empfindliche El-

Bei diesen beiden Stämmen handelt es sich um ternstamm ATCC 21 118 in einem Medium, das eine bestimmte Mutanten von Proteus rettgeri ATCC 55 Minimalmedium-Zusammensetzung wie in der fol-21118, der die folgenden mikrobiologischen Eigen- genden Tabelle 1 und ß-Hydroxynorvalin in Konzentrationen wie in der folgenden Tabelle 2 aufweist, bei 30^uC während 24 Stunden gezüchtet, so wird das aus Tabelle 2 ersichtliche Wachstum erhalten. Wie 60 Tabelle 2 erkennen läßt, unterliegt der ß-Hydroxynorvalin-empfindliche Elternstamm bei einer /?-Hydroxynorvalin-Konzentration von 0,5 mg/ml oder mehr einer beträchtlichen Wachstumshemmung. Der

α ο u ·· ι ι» i- j·· · L 1· it. ... 5-Hydroxynorvalin-resistente Stamm Nr. 33 zeigt da-

Agar-Schragkultur: Faserformig, hellgelb, dünn- ₆ £_ege_n auch bei einer ^Hydroxynorvalin-Konzentmion

l^an,^Zeni' ,^durchsichtlS^{er Wuchs}· von 1 mg/ml oder mehr ein ausreichendes Wachstum,

also bei Bedingungen, bei denen der Eltemstamm praktisch kein Wachstum zeigt.

führung der Mutation mit Nmty
guanwün und in einer Schalenkultur mit Minimalmedium, das /9-Hydroxynorvalin und i.-lsoieucin enthielt, behandelt wurden.

Der auf diese Weise erhaltene Mutantenstamm Nr. 33 ist der Stamm, der für sein Wachstum L-lsoleucin benötigt und in der Lage ist, in Minimalmedium, enthaltend eine ausreichende Menge L-Isoleucin, und 5 mg/ml /i-Hydroxynurvaün, /u wachsen, !P. dem der

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der sowohl L-Isoleucin wie i.-Methionin für sein Wachstum benötigt und der fähig ist, in Gegenwart von /i-Hydroxynprvalin _Zu wachsen.

Stamm Nr. 33 und 33 M sind bei der American Type Culture Collection unter der Nummer 21 598 bzw. 21 59<? hinterlegt.

Der Hauptunterschied in den Eigenschaften zwischen der Mutante Nr. 33 und 33 M besteht darin,

schaften besitzt:

Stäbchen, 0,5 · 1,2 bis 1,5 m, einzeln auftretend. Gewöhnlich unbeweglich, Gramnegativ.
Gelatine-Stichkultur: Keine Verflüssigung.
Agar-Kolonien: Rund, schwach hellgelb, glänzend, durchsichtig, ungetrennt, konvex.

Brühe: Schmutzig.

Lackmus-Milch: Schwach sauer in 5 Tagen.

Tabelle 1

Dikaliumphosphat 7 g

Monokaliumphosphat 3 g

Ammoniumsulfat Ig

Natriumcitrat 0,5 g

Magnesiumsulfat 5,0 g

Glucose 5,0 g

Isoleucin 0,1 g

Destilliertes Wasser 1000 ml

Die Züchtung wird unter üblichen aeroben Bedingungen wie bei einer Temperatur von etwa 25 bis 37°C durchgeführt.

Nach Beendigung der Gärung wird das L-Threonin aus der Nährbrühe mit Hilfe herkömmlicher Mittel abgetrennt.

Die Erfindung wird nachfolgend an Hand von Beispielen näher beschrieben.

Tabelle 2
Wachstumshemmung durch /3-Hydroxynorvalin

.'i-Hydroxynorvalin	Relatives	Wachstum
(mg/ml)	ATCC 21 118	Stamm Nr. 33
0	100	100
0,5	12	81
1,0	9	75
2,5	7	68
5,0	5	71

Werden der Elternstamm ATCC 21 118 und der Stamm Nr. 33 jeweils während 96 Stunden getrennt in einem Medium gezüchtet, das 10% Glucose, 2% Ammoniumsulfat, 0,5% Maissaft, 0,1% IC₂HPO₄, 0,03% Magnesiumsulfat und 2% Calciumcarbonat enthält, so beträgt die Erzeugung von L-Threonin bei dem Elternstamm nut 1,0 mg/ml, während die des Stamms Nr. 33 10,3 mg/ml beträft.

Geeignet ist ein synthetisches Nährmedium oder ein natürliches Nährmedium, soweit sie die notwendigen Bestandteile für das Wachstum der Mikroorganismen, wie z.B. eine Kohlenstoffquelle, Stickstoffquelle, anorganische Verbindungen u. dgl. enthalten.

Kohlenstoffquellen sind beispielsweise Glucose, Fructose, Saccharose, Melasse, Stärke usw. Ais S'acksiüffqüclSe lcönnen verschiedene Arten von anorganischen oder organischen Salzen oder Verbindungen, Ammoniumsalze, wie z. B. Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat und Ammoniak usw. oder natürliche Substanzen verwendet werden, die Stickstoff enthalten, wie z. B. Maisquellflüssigkeit, Fleischextrakt, Pepton, entfettete Sojabohnen usw.

Dem Nährmedium können anorganische Verbindungen zugesetzt werden, wie Dikaliumhydrogenphosphat, Kaliumdihydrogenphosphat, Magnesiumsulfat usw. Um den pH-Wert des Mediums aufrechtzuerhalten, kann Calciumcarbonat zugegeben werden. Zur Erhöhung der Erzeugung von L-Threonin wird vorzugsweise ein die Gärung förderndes Mittel, wie z. B. Fumarsäure, Asparaginsäure und ihre Salze in einer Menge von 0,5 bis 2 Gewichtsprozent während der Gärung oder unmittelbar vor der Gärung zugesetzt.

Beispiel 1

50 ml eines Nährmediums (pH 7,5) aus 10% Glucose, 2% Ammoniumsulfat, 0,5% Maisquellflüssigkeit, 0,1% Kaliumsulfat und 0,03% Magnesiumsulfat (Rest: Wasser) wurden in einen 500 ml-Erlenmeyer-Kolben eingegeben und sterilisiert.

Anschließend wurde Calciumcarbonat. das getrennt sterilisiert, wurde, so lange zugegeben, bis die Konzentration an Calciumcarbonat 2% betrug. Die auf diese Weise hergestellte Lösung wurde mit einer Kultur (Inoculatgröße 4%) beimpft, die dadurch erhalten worden war, daß man Proteus rettgeri ATCC 21598 in einem Bouillon-Medium während 24Stunden bei einer Temperatur von 30^;C schüttelte. Die Züchtung erfolgte unter Schütteln bei einer Temperatur von 30⁰C während 96 Stunden und ergab eine Fermentationsbrühe, die 10,3 mg/ml L-Threonin enthielt. Nach Entfernung der Bakterienzellen durch Filtrieren wurden 1000 ml der Fermentationsbrühe über ein lonenaustauscherharz geleitet und anschließend das

so Eluat konzentriert. Durch Zugabe von Äthanol wur den 7,3 g Kristalle von rohem L-Threonin erhalten.

Beispiel 2

Die Züchtung erfolgte auf die gieidic Weise wie in Beispiel 1 mit der Abwandlung, daß zweimal Natrium-

asparaginat in einer Menge zugegeben wurde, daß die Konzentration an Natriumasparaginat auf 0,5% nach 24 bzw. 48 Stunden, gerechnet vom Beginn der Züchtung an, betrug. Nach 96stündiger Züchtung wur-

4= de eine Fermentationsbrühe erhalten, die 12,3 mg/ml L-Threonin enthielt.

Beispiel 3

Die Züchtung erfolgte auf die gleiche Weise wie im Beispiel 2 mit der Abwandlung, daß an Stelle von Natriumasparaginat Ammoniumfumarat verwendet wurde. Nach 96stündiger Züchtung wurde eine Fermentationsbrühe erhalten, die 12,2 mg/ml L-Threonin enthielt.
Beispiel 4

Die Züchtung erfolgte auf die gleiche Weise wie im Beispiel 1 mit der Abwandlung, daß als Impfstamm der Stamm Proteus rettgeri ATCC 21 599 verwendet wurde. Nach 96 Stunden wurde eine Fermentationsbrühe erhalten, die 10,1 mg/ml L-Threonin enthielt.

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Verfahren zur Herstellung von L-Threonin durch aerobes Züchten von Mikroorganismen in Kohlenhydraten, Stickstoffsubstanzen und Mineralsalze enthaltenden Nährmedien bei hierfür üblichen Temperaturen und pH-Werten, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismen Proteus rettgeri ATCC 21 598 oder — ATCC 21 599 einsetzt.

   Erzeugung von Indol.

   Keine Erzeugung von Schwefelwasserstoff.

   Aus Kitraten werden Nitrite erzeugt.

   Keine Erzeugung von Acetylmethylcarbinol.

   Methylrot-Reaktion positiv.

   Aus Wasserstoffperoxid entsteht Sauerstoff.

   Stärke wird nicht verflüssigt.

   Säure, aber keine Gaserzeugung aus Glucose,

   Fructose, Galactose, Rhamnose.

   Keine Säure und kein Gas aus Mannose, Lactose·.

   Trehal c, Raffinose, Dextrin, Maltose, Xylose.

   Arabi. >se und Saccharose.