La pressente invention se rapporte à la préparation par biosynthèse du pigment jaune appelé zéaxanthine ou 3,3'-dihydroxy-ss carotène par culture d'un microorganisme producteur de cette substance.
Elle concerne un procédé de fabrication de zéaxanthine par culture d'un microorganisme du genre Flavobacter producteur de ce pigment selon la revendication du brevet principal, caractérisé par le fait que ce microorganisme est la bactérie Flavobac teriunt aquatile ATCC N 11947 ou un mutant de cette bactérie.
Selon une forme d'exécution particuliere du procédé suivant l'inventiom on prépare une culture du microorganisme Flavobac- rerizml aquatile ATCC N" 11947, que l'on inocule ensuite à un milieu nutritif placé dans un fermenteur et contenant, à titre de sources principales de carbone et d'azote assimilables par le microorganisme. au moins un hydrate de carbone et au moins une substance contenant des acides aminés libres. On entretient la croissance de la bactérie dans le fermenteur en assurant une oxygénation suffisante du milieu de culture ainsi que le maintien d'une température adéquate, de l'ordre de 28 à 30 C, et d'un pH appro pne.
Lorsque les cellules bactériennes sont parvenues à un stade de croissance suffisant, de préférence lorsque la culture est dans la phase de croissance exponentielle, et quand les cellules ont atteint un stade de production de zéaxanthine, stade aisément décelable grâce à la coloration jaune de ce pigment, on poursuit la culture de ces cellules à une température comprise entre 22 et 25' C, dans des conditions d'oxygénation suffisantes, et dans un milieu nutritif aqueux contenant au moins un hydrate de carbone à raison de 15 à 35 mg:
: ml, ainsi qu'une source d'azote amine assimilable contenant des acides aminés libres, en maintenant par addition progressive de ces deux substances dans le milieu de fermentation un rapport sensiblement constant entre leurs quantités respectives.
L'hydrate de carbone, constituant la source de carbone princi- pale assimilable par le microorganisme, peut être choisi parmi des substances telles que le glucose, le lactose ou le sucrose. Cette source principale de carbone assimilable peut également être constituée par un mélange de ces substances.
Parmi les substances susceptibles d'entrer dans la composition de la source principale d'azote aminé, on peut citer par exemple la liqueur de trempage de maïs, les extraits de levure, les hydrolysats de protéine, en particulier les produits obtenus par hydrolyse acide ou enzymatique de protéines d'origine végétale telles que les protéines, de soja ou d'arachide, et/ou l'hydrolysat de caséine ap pelte tryptone .
Cette source d'azote aminé peut également contenir une substance préparée par hydrolyse acide ou enzymatique d'une biomasse récuperee à titre de sous-produit de la biosynthese d'un pigment caroténoide par culture d'une bactérie du genre Fla-
vohacler en particulier par hydrolyse d'une biomasse de Flavobac er cultivée pour préparer de la zéaxanthine et dont on a extrait le pigment.
On poursuit ensuite la culture dans ces conditions pendant un temps suffisant. pour obtenir dans le'milieu de culture une quantité substantielle de zéaxanthine, ce pigment étant présent dans les cellules. On peut également, à la fin de cette période, interrompre l'addition progressive des sources de carbone et d'azote et laisser la composition du milieu de culture en fonction de la consommation des substances nutritives par le microorganisme.
Les résultats expérimentaux ont montré que, lorsque la culture du microorganisme est effectuée selon ce procédé, la production de zéaxanthine est notablement supérieure a celle d'une culture de ce microorganisme effectuée dans les conditions pratiquées habituellement.
On peut ensuite, éventuellement après concentration du bouillon de culture, extraire la zéaxanthine des cellules à l'aide d'un solvant organique polaire tel que l'acétone, I'alcool éthylique ou
un solvant chloré comme le chloroforme.
Selon une variante on peut séparer la biomasse du milieu de culture, par exemple par centrifugation, décantation ou filtration.
La biomasse peut être utilisée telle quelle, par exemple Åa titre d'additif dans l'alimentation des poules, ou faire l'objet d'un traitement d'extraction à l'aide d'un solvant organique polaire.
Selon un mode d'exécution du procédé particulièrement avantageux, on prépare une culture de la bactérie Flavohacterium aqua- tille ATCC N 11947 que l'on inocule à un milieu nutritif aqueux placé dans un fermenteur et contenant une source principale de carbone constituée par un hydrate de carbone ou un mélange d'hydrates de carbone. de préférence à raison de 6 à 8% en poids, ainsi qu'une source principale d'azote amine assimilable.
On entretient la croissance du microorganisme en assurant une oxygénation suffisante du milieu. ainsi que le maintien d'une température adéquate, de l'ordre de 28 à 30 C et d'un pH approprié, compris entre 6,5 et 8,0, de préférence entre 7,0 et 7,5.
Lorsque la concentration du milieu en hydrate de carbone atteint, par valeurs décroissantes, une valeur comprise entre 15 et 35 mgíml. on ajuste la température du milieu entre 22 et 25 C et on introduit dans le fermenteur, de façon progressive, c'est-à-dire soit par une alimentation continue, soit par quantités successives, au moins un hydrate de carbone et au moins une source de carbone assimilables. On peut introduire ces substances dans le fermenteur soit séparément, soit mélangées pour constituer un substrat nutritif. Cette addition est effectuée à un débit tel que la teneur du milieu de culture en hydrate de carbone reste comprise entre 15 et 35 mg/ml et que les quantités respectives d'hydrate de carbone et de source d'azote aminé soient dans un rapport constant.
A cet effet on introduit de préférence dans le f,enmenteur un substrat contenant ces substances, selon le débit voulu pour maintenir la teneur du milieu en hydrate de carbone entre 15 et 35 mgi'ml, la composition chimique du substrat étant telle que les quantités pondérales respectives d'hydrate de carbone et de substance aminée assimilables qu'il contient soient dans un rapport constant, de préférence compris entre 1,6 et 3,4.
Pendant cette fermentation. Ie pH du milieu de culture est ajusté entre 6,5 et 8,0, de préférence entre 7,0 et 7,5. L'ajustement du pH peut être effectué à l'aide de solutions alcalines telles que des solutions aqueuses d'hydroxyde de sodium, d'hydroxyde de potassium ou d'ammoniaque ou à l'aide d'un courant d'ammoniac. On utilise de préférence ces deux dernières substances car elles constituent également des sources d'azote aminé assimilables par le microorganisme.
On poursuit ensuite cette culture pendant un temps suffisant pour obtenir dans le milieu une quantité substantielle de zéaxanthine. On peut également continuer la culture après arrêt des additions progressives de substances nutritives et laisser la composition du milieu évoluer en fonction de la consommation des substances nutritives par le microorganisme.
Des résultats particulièrement intéressants ont été obtenus en cultivant, comme décrit précédemment, des cellules mutantes préparées par action de la l-méthyl-3-nitro-1-nitroso-guanidine, ci après dénommée NTG, sur la bactérie Flavobacterium aquatile
ATCC N 11947 selon un procédé de mutation original remarquable par le fait que l'on fait agir la NTG sur la bactérie au sein d'un milieu solidifié.
Selon une forme d'exécution particulière de ce procédé de mutation. on prépare une culture de la bactérie, que l'on dilue dans une solution physiologique stérile. La solution obtenue est ensuite mélangée dans une boîte de Petri avec une solution aqueuse de NTG dans les proportions convenables, par exemple avec un volume équivalent d'une solution aqueuse de NTG contenant I à 10 mg de cette substance par ml. On verse ensuite sur la solution obtenue de L'aga fondu que l'on mélange soigneusement à la solution. Lorsque L'aga est solidifié on maintient le milieu solide obtenu à une température d'incubation convenable, par exemple entre 25 et 28 - C jusqu'à l'apparition de colonies dans le milieu solidifié.
Les colonies sont ensuite prélevées et repiquées plusieurs fois de suite sur des supports solides nutritifs.
Le microorganisme mutant obtenu peut ensuite faire l'objet d'un ou de plusieurs autres traitements de mutation ultérieurs en milieu solidifé.
Les exemples suivants illustrent la mise en oeuvre du procédé selon l'invention, celle-ci n'étant toutefois pas limitée aux conditions qui y sont décrites.
Dans ces exemples, les compositions des milieux nutritifs sont exprimées en pourcentages pondéraux.
Exemple I
On prépare une culture de la bactérie Flavobacterium aquatile
ATCC N" 11947 que l'on inocule à raison de 5% en volume à un milieu nutritif aqueux contenu dans un fermenteur. Ce mélange nutritif, préalablement stérilisé à 120 C C pendant 40 minutes et re- froidi à 28" C, et dont le pH est ajusté entre 6,9 et 7,1 à l'aide d'ammoniaque, présente la composition suivante:
:
glucose (stérilisé séparément
en solution concentrée) 7,0 %
liqueur de trempage de maïs 1,6 %
hydrolysat de caséine (tryptone) 0,8 %
extrait de levure 1,8 %
sulfate de magnésium 0,5 Ó
huile de maïs 0,08%
eau du robinet balance à 100%
Le microorganisme est cultivé dans le fermenteur à 28' C, sous aération et agitation énergiques, avec ajustement continu du pH du milieu entre 7,2 et 7,3 par addition automatique d'une solution aqueuse diluée d'ammoniaque.
La culture exécutée dans ces conditions présente une phase de latence de 6 à 7 heures, et la production de zéaxanthine commence aprés 14 heures de culture.
Lorsque la teneur en glucose du milieu de fermentation atteint, par valeurs décroissantes, 25 mg/ml, c'est-à-dire 24 heures aprés le début de la culture, on ajuste la température du milieu à 240 C et on introduit de façon progressive dans le fermenteur, selon un débit tel que la teneur en glucose du milieu reste sensiblement constante, un substrat nutritif préalablement stérilisé dans un réservoir séparé, dont le pH est ajusté à 7,2 et dont la composition est la suivante:
glucose 32 %
liqueur de trempage de mais 4,7%
hydrolysat de caséine (tryptone) 4,3%
extrait de levure 5,5%
eau du robinet balance à 100%
Cette addition progressive est poursuivie pendant 20 heures, la température du milieu étant maintenue à 24 C.
Après une durée totale de culture de 50 heures, on mesure la teneur du milieu de fermentation en zéaxanthine par chromatographie en couche mince et par spectroscopie dans l'ultraviolet.
La teneur du milieu de fermentation en zéaxanthine ainsi mesurée est de 16 ,ug/ml.
A titre de comparaison la bactérie est cultivée selon un procédé traditionnel. A cet effet elle est inoculée, à raison de 5% en volume, à une même quantité d'un milieu nutritif préalablement stérilisé et refroidi à 28" C, dont le pH est ajusté entre 6,9 et 7,1, et dont la composition est la suivante:
glucose 10,0 %
liqueur de trempage de maïs 1,85%
hydrolysat de caséine (tryptone) 1,25%
extrait de levure 2,1 %
sulfate de magnésium 0,5 %
huile de maïs 0,08%
eau du robinet balance à 100%
La culture est exécutée sous agitation et aération énergiques, avec ajustement continu du pH entre 7,2 et 7,3. La phase de latence observée est de 8 heures et la production de zéaxanthine commence après 15 heures de culture.
On ajuste la température du milieu à 24 C après 24 heures de culture. 55 heures après le début de la culture, la teneur du milieu de fermentation en zéaxanthine, déterminée comme décrit précédemment, est de 4 zg/ml.
Exemple 2
On prépare une culture de la bactérie Flavobacterium aquatile
ATCC N" 11947 dans un milieu nutritif aqueux dont le pH est
ajusté à 6,5 et dont la composition est la suivante:
glucose 3,0%
extrait de levure 1,0%
hydrolysat de caséine (tryptone) 1,0%
sulfate de magnésium 0,5%
eau du robinet balance à 100%
Cette culture, qui contient S g de cellules du microorganisme par litre de milieu nutritif, est ensuite diluée dans le rapport 1:108 (en volume) par une série d'opérations successives dans une solution physiologique stérile contenant 0,9% en poids de chlorure de sodium.
On mélange ensuite soigneusement I ml de cette solution avec 1 ml d'une solution aqueuse de NTG contenant S mg/ml de cette substance, dans une boîte de Petri. On ajoute ensuite 10 ml d'agar fondu sur la solution ainsi préparée et l'on mélange complètement l'agar et la solution. Lorsque l'agar est solidifié, la boîte de Petri est incubée à une température de l'ordre de 25 à 28" C, jusqu'à l'apparition de colonies dans le milieu solidifié, c'est-àdire pendant 2 à 4 jours. On sépare ensuite les colonies de la boîte de Petri puis on les étale sur des supports en agar nutritif en l'absence de NTG, en plusieurs opérations successives.
La souche mutante obtenue est ensuite inoculée à raison de 5% en volume à 100 ml d'un milieu nutritif stérile dont le pH est ajusté à 6,5 et dont la composition est la suivante:
glucose 3,0%
extrait de levure 1,0%
hydrolysat de caséine (trytone) 1,0%
sulfate de magnésium 0,5%
eau du robinet balance à 100%
Le microorganisme est cultivé dans ce milieu à 28' C et en conditions aérobies pendant 24 heures, puis cette culture est à nouveau inoculée à 2 litres d'un milieu nutritif de même composition.
Après 24 heures de fermentation dans les mêmes conditions, cette dernière culture est inoculée, à raison de 5% en volume, à un milieu nutritif aqueux contenu dans un fermenteur. Ce milieu nutritif, préalablement stérilisé à 120"C pendant 40 minutes et refroidi à 28" C, présente un pH ajusté entre 6,9 et 7,1 à l'aide d'ammoniaque, et possède la composition suivante:
:
glucose (stérilisé séparément
en solution concentrée) 7,0 %
liqueur de trempage de maïs 1,6 %
hydrolysat de caséine (tryptone) 0,8 %
extrait de levure 1,8 %
sulfate de magnésium 0,5 %
huile de maïs 0,08%
eau du robinet balance à 100%
Lorsque la teneur en glucose du milieu de culture atteint, par valeurs décroissantes, 25 mg/ml, c'est-à-dire 22 heures après le début de la culture, on ajuste la température du milieu à 24 C et l'on introduit, selon un débit tel que la teneur en glucose du mi lieu reste sensiblement constante, un substrat nutritif préalablement stérilisé, dont le pH est ajusté à 7,2 et dont la composition est la suivante:
:
glucose 32,0%
liqueur de trempage de maïs 4,7 /0
hydrolysat de caséine (tryptone) 4,30,o
extrait de levure 5,5 < )
eau du robinet balance à 100 /,
Cette addition progressive est poursuivie pendant 20 heures. la température du milieu étant maintenue à 24-C.
Après une durée totale de culture de 48 heures, la concentration du milieu en glucose a atteint 5 mg/ml, et sa teneur en zéaxanthine, mesurée comme décrit dans l'exemple 1, est de 40 ,ug/ml.