CS206815B1 - Způsob výroby aminokyseliny - Google Patents

Description

Vynález se vztahuje k mikrobiologickému průmyslu a zvláště ke způsobu výroby aminokyseliny, která nachází použití v lékařství, při výrobě syntetických vláken, v potravinářském průmyslu a chovu zvířat.

Je znám způsob výroby aminokyselin submerní fermentací určitých mikroorganismů, které produkují aminokyseliny, na živném prostředí, které jako zdroj uhlíku obsahuje uhlovodíky a jejich deriváty, například n-parafiny s 11 až 18 atomy uhlíku, cyklohexan, benzen z ropy, ethylalkohol a methylalkohol, kyselinu octovou, uhlohydráty, například melasu, produkty hydrolýzy škrobů, brambor nebo obilniny, hexózové hydrolyzáty selektivních druhů z rostlinných surovin.

Zjpůsob výroby aminokyselin v uhlovodíkovém prostředí je znám. Způsob se provádí kultivací směsi mikroorganismů Micrococcus glutamicus v přítomnosti Arthrobacter paraffineus nebo Brevibacterium ketoglutamicum, které mohou asimilovat uhlovodíky a produkovat kyselinu L-glutaminovou, L-lysin, L-valin a L-homoserin (francouzský patent č. 1 577 264).

J e znám způsob výroby aminokyseliny kultivací Pseudomonas, Corynebacterium nebo

Sacchromyces v živném prostředí, které obsahuje nenasycené uhlovodíky jako zdroj , uhlíku, minerální soli a stimulátory růstu. Fermentací se z 15 litrů živného prostředí dostane 3,5 g L-asparaginu (japonský patent č. 50-11472).

Je znám způsob výroby L-lysinu kultivací kmene Brevibacterium ketoglutamicum 2473-Np-107 (ATCC 21297) a Arthrobacter paraffineus 2411-Np-82 (ATCC 21298) v živném prostředí, které jako zdroj uhlíku obsahuje n-parafiny s 10 až 50 atomy uhlíku, aromatické uhlovodíky, frakce z destilace ropy nebo surovou ropu. V prostředí, které obsahuje 5% hmotnostních n-parafinu s 12 až 17 atomy uhlíku, se nahromadí 3,2 mg/ml lysinu (sovětské autorské osvědčení č. 415 890).

Je znám rovněž způsob výroby aminokyselin, jako L-lysinu, kyseliny L-asparaginové, L-alaninu, L-valinu, L-leucinu a L-argininu, fermenltací v kulturním prostředí, které jako zdroj uhlíku obsahuje methanol. Koncentrace metanolu v prostředí činí pod 3 % objemová. Jako zdroj dusíku se použijí amoniové soli, amoniak, močovina, pepton nebo kvasnicový extrakt. Do prostředí se přidají minerální

Ž složky a jako producent se použije 'kmen Protaminophagus ATCC 21 927. Výtěžek konečných produktů je tento:

L-iysin 0,21 g/1, kyselina L-asparaginová 0,14 g/1, L-alanin 0,48 g/1, L-valin 0,6 g/1, L-leucin 0,72 g/1, L-arginin 0,49 g/1 (americký patent č. 3907641).

Je znám také způsob výroby kyseliny L-glutaminové mikrobiologickou syntézou, za použití nečištěné látky obsahující uhlohydrát, jako je produkt hydrolýzy. škrobů, brambor nebo obiloviny, nečištěného cukerného sirupu, melasy z řepy cukrovky a cukrové třtiny, jako zdroje uhlíku. Způsob čištění uvedených zdrojů uhlíku od přebytečného biotinu mikrobiologickým postupem předpokládá sterilizaci materiálu obsahujícího uhlohydrát po jeho vyčištění fermentací, kultivaci producentu kyseliny glutaminové a oddělení konečného produktu. Maximální výtěžek kyseliny glutaminové činí 39,2 g/1 při obsahu 10% uihlohydrátů v živném prostředí. Jako producent se používají tyto mikroorganismy: Micrococous glutamicus, Bacillus subtilis,, Brevibacterium lactofermentum a podobně (americký patent č. 3451891).

Je znám způsob výroby L-lysinu v živném prostředí, které jako zdroj uhlíku obsahuje hydrolyzát polysacharidů. Tento použitý hydrolyzát není konkretizován, ale je známo, že polysacharidy jsou obsaženy v buněčné bláně jak rostlinných materiálů, tak také živých organismů, například kvasnic a hub (sovětské autorské osvědčení č. 171 727).

Je znám způsob výroby L-lysinu, který předpokládá použít hexózové hydrolyzáty z cupaniny z bavlnífcových semen nebo celloligninu z jehličnatých druhů dříví. Postup se provádí pomocí producentů, bakterií Micrococcus nebo Brevibacterium. Výtěžek lysinu je 25 g/1 při použití 12 % hmotnostních (přepočteno na cukr) hydrolyzátů z cupaniny z bavlníkových semen (sovětské autorské osvědčení č. 262 053).

Hydrolyzát z cupaniny z bavlnífcových semen a hexózové hydrolyzáty z celloligninu z jehličnatého dříví obsahují monosacharidy se šesti atomy. Nepřítomnost pentózových monosaoharidů negativně ovlivňuje postup mikrobiologické syntézy.

Uvedené způsoby nebyly realizovány ve velkém technickém rozsahu, protože se cupanina z bavlníkovýoh semen po bezvýznamné úpravě používá na výkrm dobytka a hexózové hydrolyzáty celloligninu z jehličnatého dříví se bez dodatečného zpracování nemohou použít, protože hydrolyzáty rostlinných surovin vedle monosacharidů obsahují příměsi, které zabraňují růstu mikroorganismů.

Jmenované způsoby mají řadu nedostatků a sice:

— nízké výtěžky konečných produktů, pokud se jako zdroj uhlíkaté živiny použijí uhlovodíky z ropy, — použití cenných surovin, jako melasy, škrobu a jiných, které se používají jako krmivo pro dobytek, — komplikovaný postup mikrobiologického čištění surového uhlohydrátu. od biotinu v případě použití kyseliny L-glutaminové.

Účelem tohoto vynálezu je vyvarovat se uvedených nedostatků.

V souladu s cílem byl stanoven úkol vyvinout způsob výroby aminokyseliny volbou vhodného živného prostředí pro produkční mikroorganismy, které umožňuje intenzifikovat postup a zlepšit jakost konečného produktu a zvýšit jeho výtěžek.

Tento úkol je vyřešen tím, že se podle vynálezu při způsobu výroby aminokyseliny submersní fermentací mikroorganismů produkujících aminokyselinu v živném prostředí, které obsahuje zdroj uhlíku, dusíku a minerální soli, jako zdroj uhlíku použije směs hexózových a pentózových monosacharidů, získaných perkolační hydrolýzou rostlinných surovin obsahujících celulózu, vyčištěná od furfurolu a Obsahující 1 až 3 % hmot. hydroxymethylfurfurolu a lignohuminových látek, vztaženo na hmotnost monosacharidů, při hmotnostním poměru hexózových a pentózových monosacharidů 52 až 98 :48 až 2.

Přednost použití směsi monosacharidů, získaných perkolační hydrolýzou rostlinných surovin obsahujících celulózu, spočívá v tom, že přítomnost pentózových monosacharidů stimuluje růlst mikroorganismů a jejich produkční schopnost.

Odstranění furfurolu, hydroxymethylfurfurolu a ligninhuminových látek způsobuje intenzifikaci postupu mikrobiologické syntézy aminokyseliny.

Aby se umožnilo pokud možno co nejúplnější odstranění shora uvedených příměsí, čištěni udané směsi hexózových a pentózových monosacharidů se účelně provádí filtrací při hodnotě pH 3,3 až 3,7, vakuovým odpařením při teplotě 60 až 80 °C na obsah monosacharidů 6 až 11 % hmotnostních, oxidací plynem obsahujícím kyslík v přítomnosti adsorpčního činidla nebo alkalie a sterilací.

Pro zvýšení výtěžku konečného produktu a zlepšení jeho jakosti se s výhodou používá směs hexózových a pentózových monosacharidů z perkolační hydrolýzy listnatého a jehličnatého dříví, přičemž poměr hexózových monosacharidů k pentózovým monosacharidům, vyjádřený jako hmotnostní %, činí 79 až 96,4 : 21 až 3,6.

Způsob výroby aminokyseliny podle vynálezu se provádí jak je uvedeno dále.

Při způsobu výroby aminokyselin se předpokládá, že se jako zdroj uhlíku použije čistá směs hexózových a pentózových monosacharidů z perkolační hydrolýzy rostlinných surovin obsahujících celulózu,

V SSSR se zpracovává rostlinná surovina perkolační metodou hydrolýzy zředěnou kyselinou sírovou. Perkolační metoda hydrolýzy umožňuje zpracovat všechny druhy rostlinných surovin obsahujících celulózu, jako zemědělských odpadů (rýžová a bavlněná pouzdra, kukuřiční palice, slupky ze slunečnicových semen), odpadů při zpracování dřeva a z pil (krajinky, kraje, třísky) a dřeva nezávisle na jeho druhu.

Při dvojstupňové hydrolýze, například listnatého dříví, se postup provádí v prvním stupni za vzniku hlavně pentózových monosacbaridů pro následující výrobu furfurolu. V druhém stupni postupu se dostane roztok směsi monosacharidů, který odpovídá výhodnému poměru pro mikrobiologickou syntézu aminokyseliny a sice obsahuje 90 až 95 % hexózových monosacharidů a 5 až 10 % pentózových monosacharidů.

Při zpracování jehličnatého dříví hydrolyzát z prvního stupně obsahuje směs hexó3 zovýóh monosacharidů (70 až 80 %) a pentózových monosacharidů (20 až 30 %). Uvedená směs monosacharidů se používá pro výrobu kvasinkové bílkoviny. Hydrolyzát z druhého stupně hydrolýzy jehličnatého dříví obsahuje 95 až 98 % hexózových monosacharidů a 2 až 5 % pentózových monosacharidů.

Technické hydrolyzáty perkolační hydrolýzy rostlinné suroviny obsahující celulózu obsahují směs hexózových a pentózových monosadharidů v množství 2 až 3 % hmotnostní. Změnou podmínek perkolační hydrolýzy a suroviny se získá roztok směsi monosacharidů, . která je uvedena v tabulce.

Tabulka

Složení monosacharidů z hydrolyzátů, získaných perkolační hydrolýzou rostlihnýoh surovin obsahujících celulózu

Typ hydrolyzátů	Rostlinná surovina obsahující celulózu	Relativní obsah monosacharidů, %
glukóza	mannóza	galaktóza	xylóza	arabinóza
Jednostupňová	Jehličnaté dříví	70,94	17,41	2,59	7,34	1,72
perkolační	Listnaté dříví	61,93	2,78	1,61	32,36	1,31
hydrolýza	Směs listnatého
	a jehličnatého dříví Slupky ze sluneční-	66,57	10,17 .	2,03	19,77	1,45
	cových semen	55,15	3,11	1,94	32,62	5,44
	Kukuřičné palice	49,49	—	2,72	43,43	4,79 1,30
	Bavlněná pouzdra	61,22	1,46	1,30	36,42
Druhý stupeň	Jehličnaté dříví	92,66	5,06		2,08
dvojstupňové	Listnaté dříví	92,87	1,84	—	5,29	—
perkolační	Směs jehličnatého
hydrolýzyx)	a listnatého dříví Směs slupek ze slunečnicových semen	92,75	3,62		3,62
	a kukuřičných palic	90,30	1,95		7,77
Druhý stupeň dvojstupňové perkolační hydrolýzy*)	Bavlněná pouzdra	92,82	2,39	—	4,79

^x> Hydrolyzát z prvního stupně hydrolýzy se použije pro výrobu furfurolu nebo xylitu nebo krmných kvasnic

Hydrolyzáty z rostlinné suroviny obsahují vedle cukru příměsi, které představují komplikovanou směs sloučenin, odlišujících se množstvím a vlastnostmi. Příměsi přítomné v hydrolyzátech se mohou rozdělit do dvou skupin, na těkavé a netěkavé složky. Těkavé inhibující příměsi činí 1 až 3 % hmotnostní směsi monosacharidů a netěkavé jsou obsaženy v množství 5 až 6 % hmotnostních, vztaženo na směs monosacharidů.

Furfurol, přítomný v hydrolyzátů rostlinné suroviny Obsahující celulózu v množství 0,03 až 0,07 % hmotnostních, otravuje fermentační systém mikroorganismů. Přítomnost hydroxymethylfurfurolu v prostředí hydrolýzy prodlužuje růst mikroorganismů a brání jejich produkční schopnosti. Lignohuminové látky a barviva, které jsou obsaženy v hydrolyzátu, se zachycují na buněčných blánách mikroorganismů a ztěžují pronikání živin do buňky.

Protože se perkolační hydrolýza rostlinných surovin obsahujících celulózu provádí v přítomnosti kyseliny sírové jako katalyzátoru postupu, získaný roztok směsi monosacharidů se především neutralizuje.

Kyselý hydrolyzát se neutralizuje vápeným mlékem nebo čpavkovou vodou, s výhodou na hodnotu pH 3,3. až 3,7 a odfiltruje se od suspendovaných látek.

Filtrát se odpaří ve vakuu při teplotě 60 až 80 °C ha obsah monosacharidů 6 až 11 % hmotnostních, který je pro mikrobiologickou syntézu aminokyseliny optimální.

Dodržování uvedených parametrů odpařovacího procesu umožňuje nejen snížit rozpad cuíkru, ale také dosáhnout úplného odstranění těkavých inhibujícíah příměsí, furfurolu a methylfurfurolu.

Netěkavé organické příměsi hydrolyzátu, jako hydroxymethylřurfurol, lignohuminové látky a barviva, se oxidují.

Oxidace odpařeného filtrátu směsi monosachiaridů se provádí plyneim obsahujícím kyslík v přítomnosti adsorpčního prostředku, například aktivního uhlí, nebo alkalie. Provzdušňování se účelně provádí 60 minut při teplotě 45 °C.

Vedle oxidace netěkavýoh příměsí se při provzdušňování uspíší kongulace lignohuminových látek, které jsou v hydrolyzátu v koloiidním stavu.

Zmíněné operace umožňují, aby byl snížen obsah hydroxymetylfurřurolu a lignohuminových látek na 1 až 3 %, vztaženo na hmotnost monosacharidů v roztoku.

Navržené čištění intenzifikuje postup mikrobiologické syntézy aminokyseliny odstraněním těkavých a netěkavých inhibujících příměsí z hydrolyzátu.

Do vyčištěného roztoku směsi monosacharidů se přidá zdroj dusíku a minerální soli a rotztok se steriluje.

Živné prostředí získané tímto způsobem se naočkuje 24 hodinovou kulturou mikroorganismu producentu a provádí se fermentace za aerobních podmínek.

Po skončení fermentace se konečný produkt ve formě aminokyseliny oddělí o sobě známým způsobem.

Způsob podle vynálezu umožňuje postup intenszifikovat, zlepšit jakost aminokyseliny a zvýšit její výtěžek použitím směsi hexózových a pentózových monosacharidů jako zdroje uhlíku, přičemž tyto monosacharidy se získají perkolační hydrolýzou rostlinně suroviny obsahující celulózu, která je k dispozici v neohraničeném. množství.

Další výhoda tohoto vynálezu spočívá v dostupnosti a nízké ceně zdroje uhlíku, protože směs monosacharidů, získaná perkolační hydrolýzou suroviny, obsahující celulózu, například dříví, je o 30 % levnější než nejvíce rozšířený zdroj uhlíku k výrobě aminokyselin, melasa.

Kromě toho je možné při použití směsi monosacharidů, jako zdroje uhlíku, zkrátit technologickou operaci proti známým způsobům (americký patent č. 3 451 891), kdy je zapotřebí komplikovaného mikrobiologidkého čištění zdroje uhlíku, melasy, od přebytečného biotinu.

Dodatková výhoda způsobu podle vynálezu spočívá v tom, že roztok směsi monosacharidů, použitý jako zdroj uhlíku, obsahuje v dostatečně čistém a optimálním množství také růstové látky pro mikroorganismy, protože materiály obsahující celulózu mají přírodní rostlinný základ.

Výhoda způsobu podle vynálezu spočívá také v tom, že je možné použít také nové zdroje uhlíku k syntéze aminokyseliny, například L-lysinu, pro získání nehygroskopického produktu, který se při deíšim skladování nespéká.

Pro lepší porozumění způsobu výroby aminokyseliny podle vynálezu jsou uvedeny následující příklady.

Příklad 1 ‘

Hydrolyzát, získaný dvojstupňovou perkolační hydrolýzou směsi jehličnatého a listnatého dříví, který obsahuje 2,51 % hmotnostních hexózových a 0,09 % hmotnostního pentózových monosacharidů, se neutralizuje na hodnotu pH 3,3, filtruje a filtrát se odpařuje ve vakuu při teplotě 60 °C až do dosažení koncentrace monosacharidů 6,0 % hmotnostních. Odpařený roztok směsi monosacharidů se oxiduje vzdušným kyslíkem 60 minut při teplotě 45 °C v přítomnosti aktivního Uhlí a filtruje.

Čištěním hydrolyzátu se zcela odstraní furfurol, co se potvrdí plynovou chromatografickou analýzou. Obsah hydroxymethylfurfurolu a lignohuminovýeh látek po čištění činí 2,5 %, vztaženo ná hmotnost monosacharidů. Jejich Obsah se stanoví spektrofotometrickou metodou u hydrolyzátu před čištěním a po něm.

K vyčištěnému roztoku monosacharidů, vztaženo na množství 1000 ml, se přidá 15 g síranu amonného (NH₄)₂SO₄, 0,5 g středního fosforečnanu draselného K₂HPO₄, 0,5 g kyselého fosforečnanu draselného KH₂PO₄, 0,2 g heptahydrátu síranu hořečnatého MgSO₄.7 H₂O, 2,5 g kukuřičného extraktu a 0,4 g homoserinu a hodnota pH prostředí se upraví alkálií na 7,0. Prostředí se nalije, vždy v množství 50 ml, do třepací baňky o objemu 750 ml. Do každé baňky se vnese 0,5 g křídy a steriluje za přetlaku 80 kPa během 30 minut. Potom se vnese vždy 2,5 ml 24 hodinové kultury Brevibacterium 22. Tato kultura se připraví na očkovacím prostředí tohoto složení: ' glukóza 2,0 % hmotnostní, kukuřičný extrakt 2,0 % hmotnostní, chlorid sodný NaCl 0,3 % hmotnostního, pH prostředí 7,0. Očkovací prostředí se sterilizuje, očkuje na šikmý agar s 24 hodinovou kulturou a kultivuje 24 hodiny při teplotě 28 až 32 °C na třepačce.

Jako producent L-lysinu se používá kmen Brevibacterium 22, který je deficitní na homoserin.

Fermentace se provádí při teplotě 28 až 30 °C na třepačce s počtem otáček 200 za minutu po dobu 60 hodin. Koncentrace L-lysinu činí 18 mg/ml a výtěžek aminokyseliny 30 %, vztaženo na směs monosacharidů v živném prostředí. Kulturní kapalina se oddělí od bakteriální biomasy, okyselí na hodnotu pH 4 až 5 a stabilizuje kyselým pyrosiřičitanem sodným v množství 0,2 % hmotnostního. Stabilní kapalina se vede ionoměničovými kolonami naplněnými ionexem. Získaný eluát se odpaří na obsah L-lysinu 40 % hmotnostních, potom se roztok okyselí na hodnotu pH asi 5,0, ochladí na teplotu 12 až 14°C a krystaluje.

s

Příklad 2

Hydroíyzát, získaný dvojstupňovou peťkolační hydrolýzou jehličnatého dříví, který obsahuje 2,73 % hmotnostních hexózových a 0,07 % hmotnostního pentózových monosacharidů, se neutralizuje na hodnotu pH 3,5, filtruje a filtrát se odpařuje ve vakuu při teplotě 70 °C až se dosáhne koncentrace monosacharidů 11 % hmotnostních. Odpařený roztok směsi monosacharidů se oxiduje vzdušným kyslíkem v přítomnosti aktivního uhlí 30 minut při teplotě 45 ’C. Roztok se potom filtruje. Po vyčištění se získá roztok směsi monosacharidů, který neobsahuje furfurol, jak se stanoví chromatografickou metodou nsa fázovém rozhraní plyn — kapalina. Množství hydroxymethylfiurfurolu a lignohuminových látek ve vyčištěném roztoku činí 1 % hmotnostní, vztaženo na hmotnost monosacharidů. Jejich obsah se stanoví epektrofotometrickou metodou před a po vyčištění. K vyčištěnému roztoku směsi monosacharidů, použitému v množství 9,6 litrů, se přidá 225 g síranu amonného (NH^aSOí 7,5 g středního fosforečnanu draselného K₂HPO$, 7,5 g akyselého fosforečnanu draselného ΚΉ2ΡΟ4, 3 g heptahýdrátu síranu horečnatého MgSÓ₄. 7H₂O, 600 g kukuřičného extraktu a 50 g živných kvasinek a doplní se vodou na 15 litrů. Prostředí se vnese do enzymatického aparátu o objemu 30 litrů a steriluje při tlaku 100 kPa po dobu 30 minut. Po sterilaci se hodnota pH upraví na 7,0 čpavkovou vodou. Potom se vnese 750 ml 24 hodinové kultury Brevibacterium 22, která'se získala obdobně jako v příkladu 1. Fermentace se provádí při teplotě 28 až 30 °C za proťukávání vzduchem v množství 1 m³/m³ prostředí za míchání při počtu otáček 400 až 500 za minutu. Během fermentace se udržuje hodnota pH prostředí čpavkovou vodou nebo kyselinou sírovou. Fermentace trvá 60 hodin. Koncentrace L-lysinu činí

22,4 g gramů na litr a výtěžek aminokyseliny 32 % hmotnostních, vztaženo na směs monosacharidů.

Po fermentací se kulturní kapalina okyselí na hodnotu pH 4 až 5 a stabilizuje kyselým pyrosiřičitanem sodným v množství 0,2 % hmotnostního. Stabilizovaná kulturní kapalina se suší v rozstřikovací sušárně. Hotový produkt není hydroskopický a při delším skladování se nespéká a netvoří hrudky. Příklad 3

Hydroíyzát, získaný při dvojstupňové perkolační hydrolýze listnatého dříví, který obsahuje směs 2,26 % hmotnostních hexózových a 0,14 % hmotnostního pentózových monosacharidů, se neutralizuje na hodnotu pH 3,7, filtruje a filtrát odpařuje ve vakuu při teplotě 80 °C až do dosažení koncentrace monosacharidů 9 % hmotnostních. Odpařený roztok směsi monosacharidů se oxiduje vzdušným kyslíkem po dobu 60 minut při teplotě 45 °C v přítomnosti aktivního uhlí a filtruje.

Čištěním hydrolyzátů Se kvantitativně odstraní furfurol, 00 se stanoví chromatografickou metodou na fázovém rozhraní plyn— kapalina. Množství hydroxymethylfiurfurolu a lignohuminových látek ve vyčištěném roztoku činí 1,8 % hmotnostních, vztaženo na hmotnost monosacharidů. Jejich obsah se stanoví spektrofotometrickou metodou z roztoku před a po vyčištění.

K vyčištěnému roztoku monosacharidů, použitému v množství 660 ml, se přidá zdroj dusíku, minerální soli a růstové látky, analogicky jako v příkladu 1 a živné prostředí se doplní na objem 1 litru. Fermentace se provádí v třepací baňce, obdobně jako v příkladu 1. Koncentrace L-lysinu činí 21,1 mg/ ml a výtěžek aminokyseliny 28 % hmotnostních, vztaženo na směs monosacharidů.

Příklad 4

Hydroíyzát, získaný jednostupňovou hydrolýzou jéhličnatého dříví, který obsahuje 2,55 % hmotnostních hexózových a 0,25 % hmotnostního pentózových monosacharidů, se neutralizuje na hodnotu pH 3,4, filtruje a filtrát odpaří ve vakuu při teplotě 75 °C až do dosažení koncentrace monosacharidů 10 % hmotnostních. Odpařený roztok se oxiduje vzdušným kyslíkem po dobu 60 minut při teplotě 45 °C v přítomnosti hydroxidu draselného. Vzniklá sraženina se odfiltruje. Naprostá nepřítomnost furfurolu ve vyčištěném roztoku monosacharidů se kontroluje chromatografickou metodou na fázovém rozhraní plyn—kapalina. Množství hydroxymethylfurfurolu a lignohuminových látek ve vyčištěném roztoku činí 1,8 % hmotnostních, vztaženo na hmotnost monosacharidů. Jejich obsah se stanoví spektrafotometrickou metodou.

Do čistého roztoku monosacharidů, v množství 860 ml, se vnese 25 g síranu amonného (NH^SOé, 0,5 g středního fosforečnanu draselného Κ2ΗΡΌ4, 0,5 g kyselého fosforečnanu draselného Κ₂ΗΡΟ₄ a 0,4 g heptahydrátu síranu hořečnatého MgSO4.7H₂O a doplní vodou na objem 1 litru. Hodnota pH se potom upraví čpavkovou vodou na 7,0. Prostředí se nalije, vždy v množství 50 ml, do třepací baňky o objemu 750 ml. Do každé baňky se vnese 1 g křídy a steriluje za přetlaku 80 kiPa během 30 minut. Potom se vnese vždy 2,5 ml 24 hodinové kultury Brevibacterium flavum ATCC 14 067.

Prostředí pro očkovací materiál má toto složení:

glukóza 2,0 % hmotnostní, kukuřičný extrakt 2,0 % hmotnostní, chlorid sodný NaCl 0,3 % hmotnostního, pH prostředí 7,0 až 7,2. Prostředí se steriluje při přetlaku 80 kPa po dobu 40 minut. Očkovací materiál se kultivuje v třepací baňce při teplotě 28 až 30 °C po dobu 24 hodin. Jako producent se použije mikroorganismus Brevibacterium flavum ATCC 14 067.

Hlavní fermentace se provádí na třepačce při teplotě 28 až 30 ^ŮC při počtu otáček míchaidla 140 za minutu po dobu 72 hodin. Koncentrace kyseliny L-glutaminové činí 42 mg/ ml a výtěžek aminokyseliny 49 % hmotnostních, vztaženo na hmotnost monosacharidů.

Příklad 5

Hydrolyzát, získaný dvojstupňovou perkolační hydrolýzou listnatého dříví, který obsahuje 2,23 % hmotnostních hexózových a 0,17% hmotnostního pentózových monosacharidů, se neutralizuje na hodnotu pH 3,6, filtruje a filtrát se odpařuje ve vakuu při teplotě 72 °C. až se dosáhne koncentrace monosaoharidů 10% hmotnostních. Odpařený roztok směsi monosaoharidů se oxiduje vzdušným kyslíkem v přítomnosti aktivního uhlí 30 minut při teplotě 45 °C a filtruje.

Čistý roztok neobsahuje furfurol, jak se stanoví chromatografickou metodou na fázovém rozhraní plyn—kapalina. Množství hydroxymethylfurfurolu a lignohuminových látek ve vyčištěném roztoku směsi monosacharidů; činí 2,2 % hmotnostních, vztaženo na hmotnost monosacharidů. Jejich obsah se stanoví spektrofotometriokou metodou u roztoku před a po vyčištění.

K vyčištěnému roztoku směsi monosacharidů použitému v množství 15 litrů, se přidá 450 g síranu amonného (NH₄)₂SO₄, 7,5 g středního fosforečnanu draselného K₂HPO₄, 7,5 g •kyselého fosforečnanu draselného KH₂PO₄ a 6 g heptahydrátu síranu hořečnatého MgSO₄.7H₂O.

Prostředí se vnese do enzymatického aparátu o objemu 30 litrů a steriluje za přetlaku 100 kPa po dobu 30 minut. Potom se vnese 750 ml 24 hodinové kultury Brevibactetium flavum ATCC 14 067.

Očkovací materiál se připraví obdobně jako v příkladu 4.

Hlavní fermentace se provádí při teplotě 30 až 32 °C při počtu otáček míchadla 200 za minutu, za použití vzduchů v množství 1 m^{1 * 3}/ m³ prostředí při trvání fermentace 56 hodin. Během fermentace se udržuje hodnota pH prostředí čpavkovou vodou. Koncentrace kyseliny L-glutaminové v kulturní kapalině činí 49,2 gramů na litr, výtěžek aminokyseliny

49,2 % hmotnostních, vztaženo na směs monosacharidů.

Příklad 6

Hydrolyzát, získaný jednostupňovou hydrolýzou směsi jehličnatého a listnatého dříví, který obsahuje 2,06 % hmotnostních hexózovýah a 0,54 % hmotnostního pentózových monosacharidů se neutralizuje na hodnotu pH 3,5, filtruje a filtrát se odpařuje ve vakuu při teplotě 65 °C až do dosažení koncentrace monosacharidů 9,55 % hmotnostních. Odpařená směs monosacharidů se oxiduje vzdušným-kyslíkem 30 minut při teplotě 45 °C v přítomnosti hydroxidu sodného. Vzniklá sraženina se odfiltruje. Po vyčištění se získá roztok směsi monosacharidů neobsahující furfurol, jak se stanoví plynovou chromatografickou analýzou. Množství hydroxymethýlfůrfurolu a lignohuminových látek ve vyčištěném roztoku činí 3,0 % hmotnostní, vztaženo na hmotnost monosacharidů. Jejich obsah se stanoví spektrofotometrickou analýzou před a po vyčištění. K vyčištěnému roztoku směsi monosacharidů, použitému v množství 12 litrů se přidá 450 g síranu amonného (NH₄)2SO₄, 7,5 g středního fosforečnanu draselného K₂HPO, 7,5 g kyselého fosforečnanu draselného KH₂PO₄ a 6 g heptahydrátu síranu hořečnatého MgSO₄.7H₂O a doplní vodou na 15 litrů. Připravené prostředí se vnese do enzymatického aparátu o objemu 30 litrů a steriluje za přetlaku 100 kPa po dobu 30 minut. Potom se vnese 750 ml 24 hodinové kultury Micrococcus glutamicus.

Očkovací materiál se připraví analogicky jako v příkladu 4. Jako producent se použije mikroorganismus Micrococcus glutamicus.

Hlavní fermentace se provádí při teplotě 28 až 30 °C při počtu otáček míchadla 200 za minutu, za použití vzduchu v množství 0,8 m³/ m³ prostředí při trvání fermentace 60 hodin, přičemž během fermentace se udržuje hodnota pH prostředí čpavkovou vodou. Koncentrace kyseliny L-glutaminové v kulturní kapalině činí 32,5 gramů na litr, výtěžek aminokyseliny 32,5 % hmotnostních, vztaženo na směs monosacharidů.

Claims (2)

PŘEDMĚT VYNÁLEZU

1. Způsob výroby aminokyseliny submersní

..fermentací mikroorganismů, které ji produkují, v živném prostředí obsahujícím zdroj uhlíku, zdroj dusíku a minerální soli, vyznačující se tím, že se jako zdroje uhlíku použije směsi hexózových a pentózových monosacharidů, získané perkolační hydrolýzou rostlinných surovin obsahujících celulózu, zbavené furfurolu a obsahující 1 až 3 % hmotnostní hydroxymethylfurfurolu a lignohuminových látek, vztaženo na hmotnost monosacharidů, při hmotnostním poměru hexózových a pentózových monosacharidů 52 až 98 :48 až 2.

2. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se použije směsi hexózových a pentózových monosacharidů z perkolační hydřolýzy jehličnatého nebo listnatého dříví, přičemž poměr hexózových monosacharidů k pentózovým monosacharidům, vyjádřený jako hmotnostní %, činí 79 až 96,4 :21 až 3,6.