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des la conversion de en L-phénylalanine au moyen de nylalanne nera-
Les proclement les stades (a) de propager en dérobiose un micro-organisme producteur de phenylalanin ammonialyase (dite ci-après PAL) dans un milieu nutritif
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@4 F aqueux :
PAL, (b) de mettre les cellules du micro-organisme producteur de PAL obtenues an (a), soit sous forme de bouillon de culture complet, soit sous forme de cellules qui en ont été isolées, ou de mettre l'enzyme isolée en contact avec des ions ammonium et des ions trans-cinnamate et de laisser la réaction progresser dans des conditions impostes de température et de pH jusqu'à ce que la conversion en L-phénylalanine soit sensiblement achevée et (c) de separer et recueillir la L-phénylalanine hors du mélange de reaction.
Le procédé ci-dessus est dd-crit, par exemple dans le brevet anglais nO 1. 489. 468 (19 octobre 1977).
Un inconvenient de l'application de ce rrocédé à 1a production industrielle est l'instabilité relative du PAL et son inhibition par le substrat qui est l'acide trans-cinnamique. Pour favoriser la production de la L- phényla1nìne et contrecarrer les effets de l'inhibition par le substrat, le brevet anglais précité décrit un procédé dans lequel on utilise de grandes masses de cellules contenant du PAL et une concentration d'ions
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ammonium en excès.
Yamada, S. et al. (Appl. and Environ.
Microbiol., 42, 773-778 (1981)) production de la phénylalanine à partir de l'acide transcinnamique au moyen de cellules de Rhodotorula glutinis contenant du PAL. Ils ont envisage que l'absence d'application pratique antérieure de ne procédé était attribuable à la faible activité et à l'instabilité du PAL microbien. Yamada et al. ont observé que la Lisoleucine a un effet stabilisant sur le PAL et augmente la durée d'activité utile de l'enzyme. Ces auteurs ont observé, en outre, l'effet inhibiteur du substrat en notant qu'aux concentrations pratques on acide trans-cinnamique (150 mM), la vitesse de conver-
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sion en L-phénylalanine est réduite à la moitié du maximum.
Malgré les améliorations décrites ci-dessus,
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le procedé au PAL n'a, de la Deman- deresse, pas été applique 3 la fabrication industrielle de la L-phénylalanine. L'instabilité et la faible activité de l'enzyme constituent un inconvénient persistant de ce procédé.
La presente invention a pour objet un procédé
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perfectionné de production de la phénylalanine ammonialyase suivant lequel on cultive un micro-organi9e producteur de PAL dans des conditions d'aérobiose favorisant la croissance, on amène par induction le micro-organisme à produire du PAL dans les conditions de la production du PAL, puis cn expose le milieu contenant le PAL à des conJitions sensiblement statiques anaérobies.
La Demanderesse a en effet decouvert qu'une diminution de l'aeration et de l'agitation du milieu de fermentation après l'induction du PAL améliore la stabilité'et prolonge l'activité de l'enzymc.
La demande de brevet EUA 547. 158 du 31 octobre 1983 et la demande de brevet européen n* 84307523. 5 du 30 octobre 1984 indiquent que la phénylalanine ammonialyase est sensible à la degradation en presence d'oxygène et SOUR l'influence de l'agitation mécanique. Ces demandes de brevets précisent des lors que la stabilité et la vie utile de l'enzyme peuvent être améliorées- si la reaction de bioconversion est exécutée dans des conditions sensiblement statiques anaerobies.
Suivant la présente invention, le procédé due fermentation pour produire le PAL a été perfectionné par maintien du milieu de fermentation dans des conditions sensiblement statiques anaérobies apres l'induction du PAL. Les mécanisrnes exacts par lesquels ces
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conditions améliorent pas 6te 'elles réduisent les effets chirniques etmecahiquesdel'oxy- lastabilitedel'enzymen'ontgène et de l'agitation, l'hypothèse avancée est que ces conditionsréduisentaussilesactvitésmétaboliques des cellules avec une baisse concomitante de la dégra-
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dation nzyme.
L'établissement de proteolytique de l'statiques anaerobies dano le milieu de fermentation apres l'induction du PAL peut améliorer notablement l'efficacité et le rendement d'ensemble d'un procédé pour produire la L-phénylalanine au moyen de cette enzyme. Il existe habituellement un délai entre 1a, production PAL et l'utilisation de l'enzyme pour produire la N-phénylalanine. Ce délai peut résulter de la collecte des cellules ou des techniques de conservation. Des pertes sensibles d'enzyme peut avoir lieu au cours de cette durée.
Les conditions anaérobie8 peuvent être établies par différents moyens, par exemple par barbotage d'un gaz inerte (comme l'azote), par diminution ou. suppression de l'agitation et par limitation du volume d'air au-dessus de la surface du milieu contenant les cellules. Deux ou plusieurs de ces techniques peuvent être combinées avec avantage.
Les conditions statiques sont établies par une diminution de l'agitation jusqu'au minimum suffisant pour entretenir une homogénéité sensible. Une certaine agitation est, en général, souhaitable pcur empêcher une sédimentation des solides ou des composants de
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réaction liens aux solides.
Tout micro-organisme producteur de PAL peut outre utilisé dans le procédé de l'invention. Les microorganismes préférés sont notamment des souchcs productrices de PAL de bactéries du genre Streptomyces et des
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levures des genres Rhodotorula, Rhodosporidium et Sporobolomyces. Ces micro-organismes sont décrits, par exemple, dans la demande dss brevet E. U. A. 547. 129 du 31 octobre 1983 et la demande de brevet européen n* 64307477. 4 du 30 octobre 1984. Les micro-organismes specialement preferes sont les souches de Rhodotorula rubra et Rhodosporidium toruloides décrites dans l'exemple 1 de ces mémoires et reprises ci-apres.
Ces souches ont été déposées à l'united States Department of. Agriculture, Agricultural Research Collection, Northern Regional Research Cet ce, Peoria, Illinois le 8 septembre 1983.
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NO u : atricu1eRhodotorula rubra souche GX3242 NRRL Y-15596 Rhodotorula rubra souche GX3243 NRRL Y-15597 Rhodosporidium toruloides souche GX 3248 NRRL Y-15598 Rhodosporidium toruloides souche GX 3249 NRRL Y-15599
Le" micro-organismes producteurs de PAL utilises dans le procédé de la présente invention ont besoin d'oxygène pour leur croissance et. par conséquent, les cellules sont initialement cultivées en conditions d'aérobiose favorisant la croissance. En general, les techniques habituelles sont appliquées à la culture des cellules.
Les cellules sont inoculées dans un milieu nutritif contenant des sources assimilables de carbone et d'azote et des vitamines, minéraux et autres facteurs de croissance essentiels. Des sources appropriées de carbone sont notamment différents hydrates de carbone raffines ou bruts, comme le glucose, le saccharose, la melasse, les amidons, les céréales, etc. Une source de carbone préferée est le glucose.
Des sources d'azote sont notamment les sels inorganiques d'ammonium, comme le phorphate d'ammonium, le sulfate d'ammonium, l'acétate d'ammonium, le citrate d'ammonium, le nitrate d'ammonium, etc., et des sub-
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stance" organiques azotées comme la farine de soya, les infusions de viande, les aminoacides, la liqueur de macération de maîe, les hydrolysats de protéines, la peptone, les extraits de levure, etc. Une source d'azote préférée pour le procédé de l'invention eat l'extrait de levure et cet élément nutritif peut, avec avantage, être combine avec du phosphate de diammonium qui apporte simultanément de l'azote et du phosphore.
Les vitamines, mineraux et autres facteurs de croissance peuvent être apportés par les sources le carbone et d'azote (par exemple au moyen de l'extrait de levure) ou être apportés séparément. Ces constituants peuvent varier avec la nature du micro-orgenisme utilisé en particulier. Normalement, des o) go-éléments tels que le zinc, le manganèse, le fer, le cobalt et le calcium peuvent être apportés sous forme de sels inorganiques en quantités favorisant la croissance. Ces minéraux peuvent, par exemple, être apportés dans de l'eau, par exemple de l'eau de distribution ou de l'eau de mer, etc. Les milieux nutritifs du type décrit sont classiques et peuvent varier beaucoup en constitution.
Après la multiplication des cellules jusqu'a la densitf de c lLules souhaitce dans des conditions aérobies, elles peuvent être amendes par induction à produire le PAL dans des conditions d'aerobiose pour la production du PAL. L'induction du PAL est généralement assurée par addition de petites quantites d'un compose qui agit comme substrat pour le PAL. La L-phénylalanine est un bon inducteur du PAL et un certain ncmbre d'analogues de la phénylalanine induisent aussi la synthèse de cette enzyme. Par exemple, la D, Lphénylalanine, la L-tyrosine et la D, L-tyrosine conviennent à cette fin. De plus, il a été découvert que différentes sources d'azote brut peuvent être utilisées pour induire le PAL.
De telles sources d'azote brut
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sont notamment les protcines hydrolysées qui contiennent des quantités sensibies de N-phénylalanine ou de L-tyrosin6. Les hydrolysats de caséine ou de sang peuvent eire utilises avec avantage conune sources d'azote brut pour induire la synthese du PAL.
L'inducteur de PAL est ajoute aux cellules en quantité induisant le PAL, qui s'échelonne généralement d'environ 0, 1 a 10 g par litre de milieu de fermentation. De préférence, .. nducteur de PAL est utilise! en une concentration d'environ 4 à 8 g par litre du milieu de fermentation. Pendant cette opération, les conditions de température et de pH, l'aération et l'agitation induioant le PAL sont entretenues. La temperature et le pH sont généralement maintenus entre les limites physiologiquement compatibles pendant l'induction du PAL.
Des temperatures quelque le réduites, par exemple d'environ 15*C a environ 25'C, sont préférées parce qu'à ces températures plus basses, la stabilité de l'enzyme est meilleure et que la vitesse de consommation de l'inducteur de PAL est diminuée. Un pH préféré pour l'induction du PAL s'éche- lonne d'environ 5,5 à environ 7, 5, où des concentrations relativement élevées en PAL sont atteintes.
Si les cellules utilisées sont sensibles à la repression catabolique de la synthèse du PAL, il faut utiliser, avant l'induction, des moyens pour raréfier ou supprimer les catabolites ou leurs précurseurs hors du milieu. Cela peut être réalisé par séparation des cellules hors du milieu, par lavage des cellules et par mise en suspension des cellules dans du milieu exempt de catabolites. En variante, los cellules peuvent être laissées en croissance jusqu'a ce que les elements. nutritifs soient sensiblement épuisés avant que l'jnduction du PAL soit commencée.
Les cellules sont cultivées avec avantage dans
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les conditions de l'induction du PAL jusqu'à ce que l'activite de PAL atteigne au moins environ 0,5 et de preference au moins environ 2 unites par ml. Il a été observé que dans ces conditions, l'activité de PAL augmente jusqu'a un certain point, puis commence à diminuer. Le PAL obtenu suivant ces procédés peut être utilisé pour produire la phénylalanine ci partir du l'pacifie trans-cinnamique et de l'ammoniac.
Apres l'induction du PAL et l'accumulation de l'activité de PAL jusqu'à la valour souhaitée, les conditionssensiblementstatiquesanaérobiessont 4tablies dans le milieu de fermentation. En général, ces conditions sont établies par arrêt de l'aération et de l'agitation et par barbotage d'un gaz inerte tel que l'azote dans le milieu. Normalement, dans un système de réaction à marche discontinue, les cellules sont récoltées par centrifugation et transfErees dans un biréacteur. Dans un tel cas, les conditions sens- blement statiques anaérobies sont également entreiss n'. es aspres la récolte.
Comme indiqué précédemment, la phénylalanine ammonia-lyase s'est révélée très sensible à la degra- dation en présence d'oxygene et sous l'influence de l'agitation. Alors que l'agitation dans les réacteurs classiques (par exemple les cuves de fermentation profondes) est exécutée avec une puissance d'environ 0, 5 à 1 watt par litre, l'agitation des melanges de fermentation conformes à l'invention est avantageusement assurée avec une puissance moyenne inferieure à environ 400 et de preference inferieure à environ 100 milliwatts par litre.
Des puissances plus elevees, par exemple jusqu'a environ 5 watts par litre, sont applicables aussi, mais dans ce cas l'agitation est intermittente, par exemple 30 secondes d'agitation à des intervalles de 2 heures.
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La nature de l'agitation semble influencer aussi la stabilité de l'enzyme. Un mélange sous faible cisaillement est préféré. Une telle agitation est
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avantageuaeinent par injeotion jaz in gaz. que l'azote dans le mélange de r4action.
De plus, des agitateurs m4caniques us pour une agitation s - > euvent ;-tre utilisg-s avant-ageusGtnent assureeaussi. En général, l'agitation est juste suffisante pour entretenir l'homogénéité sensible du mélange.
La phénylalanine ammonia-lyase produite par le procédé de l'invention est utilisée pour catalyser la conversion de l'acide trans-cinnamique et de l'ammoniac en L-phénylalanine. Cette conversion est exécutée par mise en contact de 1'enzyme, sous forme de cellules entières, sous forme d'enzyme isolée ou sous forme immobiliste, avec une solution du snbstrat dans les conditions de la production de la phénylalanine. Un procédé particulièrement préféré pour condoire cette réaction de conversion est décri t dans la demande de brevet EUA 547. 258 du 31 octobre 1983 et la demande de brevet européen nO 84307523. 5 du 30 octobre 1984.
La bioréaction est poursuivie jusqu'à accumu- lation de quantits sensibles de L-phénylalanine dans le melange de reaction. En général, l'isolement est comment lorsque la concentration en : "-phénylalanine
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atteint environ 30 c atteint environ de preference environ 45 à 50 g par litre. La L-phénylalanine peut être isolée du melange de réaction de toute manière appropriée. Par exemple, les solides peuvent être séparés par filtration ou centrifugation pour laisser subsister une solution clarifiée dont la L-phénylalanine puut être précipitée par ajustement du pH au int isoelec- trique de la L-phenylalanine. à savoir environ 5, 5.
L'invention est davantage illustrée sans être limitée par les exemples suivants.
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EXEMPLE
Le présent exemple decrit nn procede de fermentation pour produire de la phénylalanine ammonilyase conformément à la présents invention. On cultive Rhodotorula rubra, souche NRRL Y-15597 a 30 C aur de la gélose au malt inclinée. Le milieu gélosé contient 1% d'extrait de malt (Difco) et 1, 5% de gélose (Difco) et a un pH de 6, 0.
On introduit dans un flacon à secouer de 250 ml, 25 ml d'un milieu d'ensemencement d'un pH de 6, 0 qui contient 1% p/v d'extrait de levure et 7% v/v de sirop de mals riche en fructose (stériln sepa- rément). On inocule le milieu an moyen d'un prélèvement à la boucle de la culture inclinée et on le met à incuber pendant 24 heures à 30 C sur un secoueur rotatif.
On introduit 550 ml du milieu d'ensemencement décrit ci-dessus dans un flacon à secouer de 4 litres muni de chicanes. On inocule le milieu en transférant l'ensemble des 25 ml du premier flacon à secouer. On met le flacon à secouer de 4 litres a incuber pendant 24 heures à 30 C sur un secoueur rotatif jusqu' ce que la densite optique A 560 nm soit au moins 40.
On verse tout le contenu du flacon i secouer de 4 litres dans un fermenteur de 14 litres contenant 9, 5 litres du milieu d'ensemencement décrit precé- demment. Après 14 heures d'incubation sous aeration et agitation à 30 C, la densité cptique à 560 rm est d'au moins 40 dans le fermenteur.
On utilise le contenu du fermenteur ensuite pour inoculer un grand fermenteur de 250 litres contenant 136 litres du milieu de production. Le milieu de production a la constitution suivante : Sirop de mats riche en fructose 15 g/litre Extrait de levure 4, 5 g/litre
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Phosphate de dianmonium 1, 9 q/litre L-phénylalanine8,5g/litre Silicone antimouasea 100 ppm
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le est à peu pres de i50 litres après l'inocu- volumelation. on ajuste à 6,0 le pil dans le grand fermenteur par des additions d'ammoniaque aqueuse ? 29% ou d'acide sulfurique 10%. On agite ce milieu et on l'aère à
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raison de 1 volume tient la temperature ä 30oC.
Lorsque la densité optique 20 dans le grand on ajoute-lu de mals riche en fructose en quantité conduisant ä une concentration de 15 g par litre. Lorsque la densit optique 560 nm atteint 30, on ajoute de l'extrait de levure en quantité conduisant à une concentration de 9 g par litre. Apres tout. es les additions, le volume final est d'environ 165 litres.
Après environ 20 heures, l'activité de PAL dans le milieu de fermentation atteint une valeur de crete de 2140 unites oar litre. A ce moment, on arrête l'admission d'air, de meme que l'agitateur et on désaère la culture an moyen d'azote. On maintient le milieu de fermentation dans ces conditions ju & qu'au moment ou on récolte les cellules en faisant passer la uulture par une centrifugeuse à bol et disque.
EXEMPLE lb.-
On exécute la produetion de la L-phénylalanine & partir de l'acide cinnamique et de l'ammoniaque dans un bioréacteur au moyen de cellules entiares de hodotorula rubra ayant une haute activite enzymatique de PAL obtenues comme dans l'exempie la. On ajoute a 390 litres d'eau, 11, 2 kg d'acide trans-cinnamique, puis 470 litres d'ammoniaque aqueuse à 29%. Après la dissolution de l'acide cinnamique, on ajuste le pH de la solution A 10, 6 par addition de 31 kg de dioxyde de
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carbone. On désaère la solution par barbotage d'azote pendant 5 minutes. On ajoute 5,06 kg (en poids sec) de
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cellules de Rhodotorula la solution du e- & -on laisse 1 p-. ndant et se poursuivre 130 heures.
On ajoute périodiquement des Supplements de rubra asubstrat dans le bioréacteur sous la forme d'une solution concentrée de cinnamate l'ammonium, Après chaque addition, on melange brièvement le contenu du biréacteur par barbotage d'azote. On maintint la
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température dans le bioreacteur à 29*C pendant lespremières 17 heures de réaction, puis on la fait baisser graduellement jusqu'à 13 C à 130 heures.
Après 130 heures d'incubation, la solution de substrat contient 42, 7 g par litre de L-phénylalanine et 6 ; 4 g par litre d'acide trans-@nnamique. on sépare lee cellules de la solution de sub3trat au moyen d'une centrifugeuse à bol et disque.
On filtre le liquide surnageant centrifugé et on en chasse l'ammoniac et le carbonate d'ammonium par evaporation. Les cristaux de L-phénylalanine précipitent lors du refroidissement. On recueille les cristaux de L-phénylalanine dans une centrifugeuse à panier, on les rince à l'eau froide et on les sèche. On collecte ainsi 22 kg de L-phenylalanine.
EXEMPLE 2.-
Le present exemple décrit une experience démontrant l'induction de la production du PAL d l'aide d'une source d'azote brut. La source d'azote utilisee pour l'experience est une caséine hydrolysée vendue par la Société Sheffield Chemical, Memphis, Tennessee, E. U. A., sous la marque N-Z Amine. On compare l'efficacite de cette source d'azote brut à celle la phénylalanine pour induire la production du PAL.
On cultive la souche de Rhodotorula rubra décrite dans l'exemple 1 dans 10 litres du milieu de
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fertMentationcontenantdela:;pepton; (30 g par ;.''.''.''. '-'. ''.' litre) et tffrentes uantités ration mats ine e la L-phnylalanine..
On ient d'anmonaque * sulfurique à 10\., On al% en quantite 0, et on l'agite l'aided'un mücanique.'Les l'experience sont rassembles resultats brut peut remplacer la L-ph4nylalanine comme-inducteur de PAL.
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''. . '..'TABLEAU ''', ."'.. TABLEA
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<tb> de <SEP> ; <SEP> Milieu <SEP> de <SEP> Activité <SEP> de <SEP> Concentration
<tb> fermentation <SEP> crête <SEP> du <SEP> PAL <SEP> finale
<tb> en <SEP>
<tb> celluLiqueur <SEP> Caséine <SEP> Concentra- <SEP> Activité <SEP> Poids
<tb> de <SEP> macé- <SEP> hydro- <SEP> tion <SEP> en <SEP> de <SEP> PAL <SEP> sec <SEP> de
<tb> ration <SEP> lysée <SEP> cellules <SEP> ## <SEP> cellules
<tb> de <SEP> maïs <SEP> g/1 <SEP> # <SEP> g/1
<tb> g/1 <SEP> g/1
<tb> 0 <SEP> 15 <SEP> 8,8 <SEP> 49,0 <SEP> 9,6
<tb> 2 <SEP> 15 <SEP> 8,8 <SEP> 56 <SEP> 10,0
<tb> 4 <SEP> 15 <SEP> 9,5 <SEP> 52 <SEP> 10,2
<tb> 10 <SEP> 15 <SEP> 9,2 <SEP> 57 <SEP> 10,6
<tb> L-Ph'eriylL-',
<tb> alanine <SEP> g/1
<tb> 0 <SEP> 1,5 <SEP> 7,0 <SEP> 49 <SEP> 7,7
<tb> 2 <SEP> 1,5 <SEP> 7,2 <SEP> 65 <SEP> 7,6
<tb> 4 <SEP> 1,5 <SEP> 7,9 <SEP> 46 <SEP> 7,
4
<tb> 10 <SEP> 1,5 <SEP> 7,9 <SEP> 53 <SEP> 8,6
<tb>
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* poids sec de ** par 9 de poids sec